不同毒力結核桿菌對感染小鼠肺泡巨噬細胞鐵蛋白及鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響①

莊 睿 王 霞 張 鋒 寶 音 章 樂 吳 芳 吳江東 張春軍 張 輝 李文娟 梁 晨 樊 超張萬江

（石河子大學醫(yī)學院病理生理學教研室/石河子大學《新疆地方與民族高發(fā)病》教育部重點實驗室，石河子 832002）

不同毒力結核桿菌對感染小鼠肺泡巨噬細胞鐵蛋白及鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響①

莊 睿 王 霞 張 鋒 寶 音 章 樂 吳 芳 吳江東 張春軍 張 輝 李文娟 梁 晨 樊 超張萬江

（石河子大學醫(yī)學院病理生理學教研室/石河子大學《新疆地方與民族高發(fā)病》教育部重點實驗室，石河子 832002）

目的:探討不同毒力的結核桿菌分別感染小鼠肺泡巨噬細胞后鐵蛋白（Fn）和鐵轉(zhuǎn)運蛋白（FPN）表達量及其時相性變化。方法:利用制備的結核桿菌國際標準強毒株H37Rv株（以下簡稱H37Rv株）和卡介苗菌株（以下簡稱BCG）菌懸液，分別經(jīng)小鼠尾靜脈注射，建立各組小鼠感染模型。各組小鼠感染模型建立成功后，分別于第1、3、5、7、9、11、13、15天，進行肺泡灌洗，收集小鼠肺泡灌洗液，獲取各組小鼠肺泡巨噬細胞。應用ELISA方法檢測各組感染組小鼠肺泡巨噬細胞中Fn和FPN的表達含量;應用Western blot技術檢測上述時間點各組感染的小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)Fn的表達量。結果:用ELISA方法和Western blot技術檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)Fn表達，結果顯示:于模型建成后第7、9、11天，H37Rv株組與BCG組的小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)Fn表達量明顯減低，并且于第7天時表達量最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。利用ELISA方法檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)FNP的表達，結果顯示:不同毒力的結核桿菌菌株感染小鼠肺泡巨噬細胞后，各感染組內(nèi)小鼠肺泡巨噬細胞FPN隨處理時間延長表達逐漸降低;于感染第5天開始下降明顯，第7、9天最低。H37Rv株組和BCG組表達接近，于第5、7、9天明顯低于正常對照組FPN的表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論:結核桿菌感染導致巨噬細胞內(nèi)Fn與FPN的表達均降低，并且感染巨噬細胞Fn和FPN的表達與結核桿菌的毒力強弱關系無相關性。

結核桿菌;巨噬細胞;鐵蛋白;鐵轉(zhuǎn)運蛋白

①本文為國家自然科學基金資助項目（No.81260261，81160192，81260241，81160001）和新疆生產(chǎn)建設兵團醫(yī)藥專項資金資助項目（No.2012BA022）。

②新疆阿克蘇地區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，阿克蘇843000。

③新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院燒傷整形科，烏魯木齊830011。

④新疆烏魯木齊市第一人民醫(yī)院內(nèi)一科，烏魯木齊830000。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，6～8周齡，體重（18±2）克，雌雄各半，共120只，購自石河子大學實驗動物中心。

1.1.2 菌株 結核桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 主要材料及來源 DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司），臺盼蘭（美國Sigma公司），小鼠鐵轉(zhuǎn)運蛋白ELISA試劑盒（上海藍基生物科技有限公司），小鼠鐵蛋白ELISA試劑盒（上海藍基生物科技有限公司），兔抗小鼠Fn單克隆抗體（Epitmics公司），HRP山羊抗兔二抗（北京康為生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將實驗小鼠隨機分為H37Rv菌株組、BCG菌株組和空白對照組，每組各40只小鼠，共120只小鼠，按感染模型復制成功后第1、3、5、7、9、11、13、15 天設置 8 個時間點，每個時間點各設5只小鼠。

1.2.2 小鼠感染模型建立 在生物安全柜內(nèi)，以滅菌接種環(huán)取改良羅氏固體培養(yǎng)基上生長2～3周狀態(tài)良好的結核桿菌菌落，置滅菌磨菌器中，加少量0.05%Tween-20的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。利用麥氏比濁法調(diào)細菌濃度約1.0×107個/ml。將不同菌懸液經(jīng)小鼠尾靜脈分別注射到對應分組的每只小鼠體內(nèi)，注射量約為0.3 ml。將感染小鼠置生物安全三級實驗室內(nèi)，IVC籠具中飼養(yǎng)。

1.2.3 小鼠肺泡巨噬細胞的收集 在上述不同時間點，將小鼠脫頸處死，摘眼球取血，暴露支氣管，用消毒好的剪刀在氣管上做一切口，用連有注射器的無菌軟皮管從切口處插入氣管，絲線固定，用4℃預冷PBS液行氣管肺泡灌洗，每次1 m l，共10次，離心管收集支氣管肺泡灌洗液，4℃ 1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，貼壁細胞即為小鼠肺泡巨噬細胞。

1.2.4 各組小鼠肺泡巨噬細胞蛋白提取 將提取的小鼠肺泡巨噬細胞置于培養(yǎng)瓶中，培育4 h后，將培養(yǎng)瓶內(nèi)營養(yǎng)液吸干凈，每瓶加100μl的SDS蛋白裂解液，冰水浸泡裂解30 min，然后用小刮子將其刮出，水中煮沸15 min，4℃離心16 min，取上清。

1.2.5 利用ELISA方法檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞FPN的表達 按照ELISA方法檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白受體試劑盒操作說明進行操作。按50、40、30、20、10、0 ng/ml分別配制標準工作液，加入酶標測定板中，100μl/孔。其他孔中加入相同體積的待測上清樣品，酶標板加蓋，37℃反應40 min，洗滌5次，每孔加50μl生物素抗小鼠鐵蛋白工作液，37℃反應20 min，洗滌3次，加酶標抗體工作液100μl/孔，37℃反應10 min，洗滌5次，加 TMB顯色液，90μl/孔，37℃避光反應20 min，最后加TMB終止液100μl/孔，在酶標儀450 nm波長下讀取各孔吸光度，繪制標準曲線，按標準曲線計算各樣本的鐵蛋白含量。

1.2.6 利用ELISA檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞Fn的表達 操作步驟和方法同F(xiàn)PN的測定，不同的是標準工作液按 100、50、25、10、5、0 ng/ml進行配置。

1.2.7 利用Western blot技術動態(tài)檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞Fn的表達 取上述提取的各組小鼠肺泡巨噬細胞提取的蛋白，將核酸蛋白測定儀模式調(diào)至A280，測定總蛋白的濃度，以最小濃度所在的蛋白組為標準，用裂解液稀釋，使得各組蛋白濃度一致。將蛋白質(zhì)上樣緩沖液5μl與蛋白液20μl混勻，煮沸10 min，冰上冷卻5 min。上樣液體在4℃13 000 r/min離心5 min，取上清上樣，80 V恒壓電泳30 min，待溴酚藍遷移至分離膠后改為110 V恒壓電泳90 min。將PVDF膜裁剪好后，在甲醇中浸泡5 min，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，將Walkman濾紙泡入轉(zhuǎn)膜液約15 min。按照Walkman濾紙、聚丙酰胺凝膠、PVDF膜、Walkman濾紙的順序從上到下。23 V恒壓半干轉(zhuǎn)膜20 min，再將PVDF膜置入含50 g/L脫脂奶粉的TBS-T中，封閉2 h。將PVDF膜放入兔源性抗Fn抗體TBS-T溶液中（1∶1 000）4℃孵育過夜。次日，TBS-T洗滌PVDF膜，5 min/次洗膜1次、10 min/次洗膜3次，共4次。PVDF膜放入辣根酶標記山羊抗兔IgG的二抗中（1∶15 000），室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次，10 min/次，用ECL發(fā)光試劑進行發(fā)光顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照，用Quantity One軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，所得數(shù)據(jù)均以x－±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 利用ELISA方法檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞FPN的表達 結核桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞后，F(xiàn)PN的表達隨著時間延長逐漸減弱，第5天時表達量開始明顯下降，于第7、9天表達量最低。在H37RV株組內(nèi)各時間點比較，于第5、7、9天降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1和圖1）。在BCG組內(nèi)各時間點比較，于5、7、9天FPN表達量同樣減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1和圖1）。H37Rv株組與BCG組之間差異較小，無統(tǒng)計學意義。H37Rv株組于第5、7、9天與對照組比較，差異顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1和圖1）。BCG組于第5、7、9天與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1和圖1）。

2.2 利用ELISA方法檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)Fn的表達 結核桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞后，F(xiàn)n的表達隨著時間延長逐漸減弱，第7天時表達量最少。在H37Rv株組內(nèi)各時間點比較，于第7、9、11天降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2和圖2）。BCG組于7、9、11 d Fn表達量同樣減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2和圖2）。H37Rv株組與BCG組之間差異較小，差異無統(tǒng)計學意義。H37Rv株組于第7、9、11天與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2和圖2）。BCG組于第7、9天與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2和圖2）。

表1 各組各時間點感染小鼠巨噬細胞FPN表達水平比較（±s）Tab.1 Expression of FPN in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

表1 各組各時間點感染小鼠巨噬細胞FPN表達水平比較（±s）Tab.1 Expression of FPN in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

Note:1）P ＜0.05 vs control group;2）P ＜0.05 vs the same group.

Time（Day） n BCG H37Rv Control 1 5 7.10 ±0.45 6.86 ±0.06 7.43 ±0.13 3 5 5.75 ±0.51 4.11 ±0.06 7.58 ±0.19 5 5 3.33 ±0.441）2）3.01 ±0.061）2）7.49 ±0.14 7 5 2.80 ±0.351）2）2.14 ±0.051）2）7.79 ±0.18 9 5 2.81 ±0.311）2）2.16 ±0.051）2）7.15 ±0.12 11 5 5.22 ±0.89 4.54 ±0.04 7.38 ±0.30 13 5 6.07 ±0.41 5.91 ±0.03 7.64 ±0.13 15 5 6.81 ±0.55 6.63 ±0.07 7.11 ±0.09

圖1 ELISA技術檢測各組感染后小鼠肺泡巨噬細胞FPN的表達Fig.1 ELISA analysis of FPN expression in culturemedium of infected mouse alveolar macrophages

2.3 利用Western blot技術動態(tài)檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞Fn的表達 利用Western blot技術，于第1、3、5、7、9、11、13、15 天動態(tài)檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞Fn蛋白的表達，在蛋白分子量約20 kD處各有一條特異性蛋白帶（見圖3）。在7、9、11 d時，BCG組與H37Rv株組小鼠肺泡巨噬細胞Fn蛋白的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。H37Rv組與BCG組相比較，無明顯統(tǒng)計學差異。結核桿菌感染宿主巨噬細胞，可誘導小鼠肺泡巨噬細胞Fn蛋白的表達降低，但表達的高低與毒力的強弱無關（見表3和圖4）。

表2 各組各時間點感染小鼠巨噬細胞Fn表達水平比較（±s）Tab.2 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

表2 各組各時間點感染小鼠巨噬細胞Fn表達水平比較（±s）Tab.2 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

Note:1）P ＜0.05 vs control group;2）P ＜0.05 vs the same group.

Time（Day） n BCG H37Rv Control 1 5 4.93 ±0.09 4.88 ±0.09 4.79 ±0.13 3 5 4.97 ±0.06 5.01 ±0.12 4.71 ±0.19 5 5 4.55 ±0.15 4.99 ±0.16 4.89 ±0.14 7 5 3.92 ±0.151）2）3.46 ±0.161）2） 4.73 ±0.18 9 5 4.05 ±0.131）2）4.08 ±0.121）2） 4.89 ±0.12 11 5 3.99 ±0.091）2）4.26 ±0.151）2） 5.09 ±0.30 13 5 5.10 ±0.11 5.11 ±0.09 4.95 ±0.13 15 5 5.05 ±0.11 5.09 ±0.08 4.77 ±0.09

圖2 ELISA技術檢測各組感染后小鼠肺泡巨噬細胞Fn的表達Fig.2 ELISA analysis of Fn expression in culturemedium of infected mouse alveolar macrophages

圖3 W estern blot技術檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞Fn表達Fig.3 Analysis of expression of Fn in mouse alveolar macrophages by W estern blot

表3 各組各時間點感染小鼠肺泡巨噬細胞Fn表達水平比較（± s）Tab.3 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages（±s）

表3 各組各時間點感染小鼠肺泡巨噬細胞Fn表達水平比較（± s）Tab.3 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages（±s）

Note:1）P ＜0.05 vs control group;2）P ＜0.05 vs the same group.

Time（Day） n BCG H37Rv Control 1 5 2.02 ±0.17 2.21 ±0.05 2.32 ±0.04 3 5 2.18 ±0.13 2.34 ±0.12 2.47 ±0.07 5 5 1.94 ±0.05 2.30 ±0.03 2.35 ±0.01 7 5 1.31 ±0.121）2）1.04 ±0.141）2）2.05 ±0.12 9 5 1.24 ±0.091）2）1.15 ±0.061）2）2.27 ±0.07 11 5 1.04 ±0.161）2）1.28 ±0.111）2）2.23 ±0.03 13 5 2.09 ±0.11 2.35 ±0.13 1.97 ±0.11 15 5 2.42 ±0.03 2.06 ±0.07 2.24 ±0.08

3 討論

圖4 小鼠肺泡巨噬細胞Fn在不同時間段的蛋白表達水平Fig.4 Expression of Fn inmouse alveolarmacrophages in different phases

宿主巨噬細胞與結核桿菌之間相互作用的結果，決定了結核桿菌感染的后果以及結核病的發(fā)生與否。本實驗研究設想這一調(diào)控機制可能與調(diào)控宿主巨噬細胞的鐵代謝作用相關。當結核桿菌感染宿主巨噬細胞以后，一方面要從感染的宿主巨噬細胞內(nèi)攝取一定量的鐵，以保證自身在宿主巨噬細胞內(nèi)的生存、繁殖和分化的需要，同時另一方面還要調(diào)控感染宿主巨噬細胞的鐵代謝，以避免感染宿主巨噬細胞內(nèi)鐵含量增加或降低，避免宿主巨噬細胞發(fā)生應激和凋亡。感染宿主巨噬細胞發(fā)生應激和凋亡，能夠殺死寄生于其內(nèi)的結核桿菌，阻止結核桿菌在體內(nèi)的播散，并能激活鄰近未感染的巨噬細胞，增強機體對結核桿菌的殺傷能力［1］。

對于結核桿菌來說鐵是必需的，并且是有潛在毒性的營養(yǎng)物質(zhì)。由于在有氧條件下游離鐵并沒有在機體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。所以結核桿菌需要一套特殊的鐵攝取系統(tǒng)，來完成自身的復制。結核桿菌的鐵攝取系統(tǒng)嚴格地控制鐵代謝和胞內(nèi)鐵的水平，以防止鐵介導的毒性，導致結核桿菌死亡。結核桿菌合成兩個鐵貯存蛋白，鐵蛋白（BfrB）和細菌鐵蛋白（BfrA）。

蛋白的變化的反應是不明確的。有研究通過基因敲除方法，對結核桿菌BfrA和BfrB蛋白進行了功能測定。研究結果表明:結核桿菌的鐵蛋白并沒有維持鐵穩(wěn)態(tài)的作用，并且結核桿菌很容易受到因缺乏鐵而導致的鐵介導的毒性，無法在小鼠體內(nèi)形成慢性感染［2］。

鐵代謝的紊亂已被證明可以顯著地影響宿主對感染的免疫反應。在研究中，利用小鼠J774巨噬細胞過表達鐵轉(zhuǎn)運蛋白來研究鐵代謝對感染免疫中一氧化氮（NO）釋放的影響。在感染早期，過表達的鐵轉(zhuǎn)運蛋白顯著抑制胞內(nèi)的結核桿菌的生長。當巨噬細胞受到脂多糖（LPS）或結核桿菌的攻擊時，NO的合成增加，但巨噬細胞表達鐵轉(zhuǎn)運蛋白則明顯降低。當過表達鐵轉(zhuǎn)運蛋白的J744細胞受到脂多糖（LPS）或結核桿菌的攻擊時，iNOS蛋白的表達上調(diào)顯著降低。從而限制了這些巨噬細胞的殺菌活性。促炎性細胞因子γ干擾素可以扭轉(zhuǎn)鐵轉(zhuǎn)運蛋白的過度表達對NO抑制作用。這些研究結果提示了一種新的鐵轉(zhuǎn)運蛋白的作用在減弱巨噬細胞介導的免疫反應。

有實驗證據(jù)表明，鐵營養(yǎng)狀況影響巨噬細胞的先天免疫反應，包括產(chǎn)生一氧化氮（NO）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）。在結核桿菌感染后引起小鼠巨噬細胞iNOS的表達上調(diào)和NO生產(chǎn)增加［3-5］。Donovan等［6］通過使用螯合劑和外加鐵來操縱細胞的鐵的含量，表明宿主細胞鐵狀態(tài)和iNOS的表達之間呈反比關系。在他們的模型中，細胞內(nèi)鐵的含量增加iNOS活性下降，而鐵耗盡后又導致iNOS活性增強［6］。鐵對這種iNOS活性逆效應被認為是iNOSmRNA表達水平改變的結果［6］。

巨噬細胞的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)通過吞噬和降解受損或衰老的紅細胞來獲得鐵［7］。鐵被吸收后可以被存儲在鐵蛋白中。巨噬細胞通過鐵轉(zhuǎn)運蛋白將鐵轉(zhuǎn)運出胞內(nèi)進入血漿［8，9］。到目前為止，鐵轉(zhuǎn)運蛋白是唯一已經(jīng)被確立的鐵的轉(zhuǎn)出通道［10-12］。本實驗對結核分枝桿菌感染后的小鼠肺泡巨噬細胞的鐵蛋白和鐵轉(zhuǎn)運蛋白進行測定，研究鐵代謝在結核分枝桿菌感染過程中的作用。

本實驗利用ELISA方法和Western blot技術檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞Fn表達，結果顯示:于模型建成后第7、9、11天，H37Rv組與BCG組的小鼠肺泡巨噬細胞Fn表達量明顯減低，并且于第7天時表達量最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。利用ELISA方法檢測各組小鼠肺泡巨噬細胞FNP表達，結果顯示:不同毒力菌株感染小鼠肺泡巨噬細胞后，各感染組內(nèi)巨噬細胞 FPN隨處理時間延長表達逐漸降低;于感染第5天開始下降明顯，第7、9天最低。H37Rv株組和BCG組表達相似，于第5、7、9天明顯低于正常對照組FPN的表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

通過研究發(fā)現(xiàn)，結核桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞以后，巨噬細胞內(nèi)鐵代謝發(fā)生一系列改變。鐵蛋白與鐵轉(zhuǎn)運蛋白都呈下降趨勢，這與結核桿菌急性感染宿主以后需要爭奪小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)的鐵元素有關。小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)鐵元素含量的改變，使機體發(fā)生一系列的感染免疫反應，來對抗結核桿菌的感染。通過本實驗的研究也為我們提供了治療結核病的新思路與方法。

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［收稿2013-10-11 修回2013-12-27］

（編輯 張曉舟）

Effect on expression of macrophages ferroportin and ferritin in mouse alveolar macrophages by m ycobacterium tuberculosis

ZHUANGRui，WANGXia，ZHANGFeng，BAOYin，ZHANGLe，WUFang，WUJiang-Dong，ZHANGChun-Jun，ZHANGHui，LIWen-Juan，LIANGChen，F(xiàn)ANChao，ZHANGWan-Jiang.DepartmentofPathophysiology，Medical School，ShiheziUniversity/LaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases，ShiheziUniversity，Shihezi832002，China

Objective:To discuss the change of ferritin（Fn）and ferroportin expression quantity and time-related feature in the alveolarmacrophages ofmice，infected with different virulence ofMycobacterium Tuberculosis infected.Methods:The prepared bacteria of H37Rv or BCG were injected intravenously into themice tails.On the day 1，3，5，7，9，11，13 and 15，the lavage fluidswere collected and the alveolar macrophages were obtained from each group of mice.The expression of FPN and Fn were detected with ELISA and/orWestern blotanalysis.Results:The expression of Fn in the group ofeither H37Rv or BCG infectedmicewas decreased on the day 7，9 and 11，and was lowest on the day 7，which showed significantly statistical difference compared to that on the other days（P ＜0.05）.The expression of FNP in the infected mousemacrophage was decreased gradually，which was obvious on the day 5.The expression levels reached to the lowest on the day 7 and 9.The expression wasmuch lower than that in the negative control group（P ＜0.05）.Conclusion:The expression of Fn and FPN inmacrophages isolated from lungs ofmice infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv or BCG become decreased，and there is no difference between these two infected mouse groups.

book=592,ebook=328

Mycobacterium tuberculosis;Macrophage;Ferritin;Ferroportin

R378

A

1000-484X（2014）05-0591-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.004

莊 睿（1986年－），男，主要從事感染性疾病的病理生理學研究，E-mail:z176103165@163.com。

及指導教師:張萬江（1967年－），男，教授，醫(yī)學博士，博士生導師，主要從事感染性疾病的發(fā)病機制與防治研究，E-mail:zwj1117@sina.com。