蒙古馬皮膚肥大細(xì)胞兩種染色方法的比較＊

趙一萍，莊 玉，芒 來＊，白東義，趙啟南

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

肥大細(xì)胞（mast cell，MC）定居在機體各個組織中，如皮膚、淋巴樣組織、子宮、膀胱、腸系膜、消化道的漿膜和黏膜下層、血管周圍以及肺組織。肥大細(xì)胞在與外界環(huán)境接觸的部位（皮膚，氣管和腸道等）中起著"第一道防線"的作用，在結(jié)締組織中扮演"微脈管系統(tǒng)信息傳遞者"作用［1］。肥大細(xì)胞被激活后，能迅速地、選擇性地產(chǎn)生恰當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)引發(fā)保護(hù)性先天免疫反應(yīng)和生理反應(yīng)［2］，并通過介質(zhì)導(dǎo)致快速的炎癥反應(yīng)，接著招募細(xì)胞因子和增加肥大細(xì)胞數(shù)目。國內(nèi)外對于不同物種、不同組織肥大細(xì)胞的研究非常廣泛［3－5］，但對于馬的研究相對較少，特別是國內(nèi)仍未見相關(guān)報道。本文就蒙古馬皮膚中肥大細(xì)胞的形態(tài)、分布進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究蒙古馬不同組織器官肥大細(xì)胞的分布、數(shù)量以及肥大細(xì)胞內(nèi)所含物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為深入探討肥大細(xì)胞在蒙古馬免疫功能上的作用提供組織形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 在內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市達(dá)茂旗、錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗牧區(qū)隨機選取9匹蒙古馬。

1.1.2 試劑與儀器 甲苯胺藍(lán)，藏紅O，其他試劑均為分析純；光學(xué)顯微鏡，輪轉(zhuǎn)式切片機等。

1.2 方法

1.2.1 切片標(biāo)本制備 馬匹局部麻醉進(jìn)行活體皮膚采樣，固定在Carnoy氏液中，固定1個月，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、制備5μm切片備用。

1.2.2 甲苯胺藍(lán)－藏紅 O染色法（RTB－S） 甲苯胺藍(lán)染液（toluidine blue）：0.5mol／L 鹽酸溶液配制pH 0.5的5g／L甲苯胺藍(lán)溶液。藏紅O復(fù)染液（safranin O）：0.125mol／L鹽酸配制的2.5mL／L的藏紅O染液。切片常規(guī)脫蠟至0.5mol／L鹽酸溶液漂洗5min，入常規(guī)甲苯胺藍(lán)染液中浸染30min，再入0.5mol／L的鹽酸溶液沖洗30s，藏紅O復(fù)染30s，快速脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、采集圖像。

1.2.3 改良甲苯胺藍(lán)－藏紅 O 染色法（MTB－S）切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水，入改良甲苯胺藍(lán)染液30s，蒸餾水迅速洗2次，950mL／L酒精分色（一般為5s）在鏡下控制。藏紅O復(fù)染5s（或30s），快速脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、采集圖像。

2 結(jié)果

從染色標(biāo)本可見蒙古馬皮膚內(nèi)存在大量的肥大細(xì)胞。在低倍鏡下觀察，肥大細(xì)胞主要分布于真皮結(jié)締組織和皮下組織中，多見于毛囊（圖1）、血管（圖2）、皮脂腺和汗腺（圖3）附近。肥大細(xì)胞大小不等，成簇分布或單一分布，呈近圓形、橢圓形、長梭形或不規(guī)則形態(tài)。高倍鏡下觀察（圖4），胞漿充滿藍(lán)紫色的圓形顆粒，胞質(zhì)中充滿大量的異染顆粒，顆粒密度與色深淺不一致。在相同倍鏡下觀察（圖1～3），改良甲苯胺藍(lán)－藏紅O染色法（圖2和圖3）比甲苯胺藍(lán)－藏紅O復(fù)染法（圖1）能夠更好的顯示肥大細(xì)胞，并且改良甲苯胺藍(lán)－藏紅O染色法復(fù)染5s（圖2）的效果優(yōu)于復(fù)染30s的效果（圖3）。

圖1 蒙古馬皮膚 MC，RTB－S染色（100×）Fig.1 Skin mast cells of Mongolia horse，RTB－S staining（100×）

圖3 蒙古馬皮膚MC，MTB－S染色（復(fù)染30s）（100×）Fig.3 Skin mast cells of Mongolia horse，MTB－S staining（30scounterstaining）（100×）

3 討論

3.1 固定液與染色方法

范春玲等［6－7］等研究證明，Carnoy氏液是一種良好的顯示肥大細(xì)胞的固定液。因此，本試驗采用Carnoy氏液作為固定液。本研究發(fā)現(xiàn)，利用改良甲苯胺藍(lán)－藏紅O染色法比甲苯胺藍(lán)－藏紅O復(fù)染法能夠更好的顯示肥大細(xì)胞（圖1～圖3），這可能是因為甲苯胺藍(lán)被煮沸10min后再逐滴滴入高錳酸鉀，得到了充分氧化的結(jié)果；其中改良甲苯胺藍(lán)－藏紅O染色法復(fù)染5s的效果優(yōu)于復(fù)染30s的效果（圖2與圖3），圖3中大部分肥大細(xì)胞被藏紅O染成紅色，而圖2中肥大細(xì)胞仍呈藍(lán)紫色，清晰可見。

3.2 馬肥大細(xì)胞的研究

對于馬肥大細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)描述，最早見于Mair T S等［8］報道，證明在馬呼吸黏膜和肺中肥大細(xì)胞的顯微和超微結(jié)構(gòu)特征與其他物種描述相似，并且肥大細(xì)胞內(nèi)顆粒包含兩種類型與人肥大細(xì)胞相似。在本研究中也得到了蒙古馬皮膚肥大細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)與很多其他物種描述的類似，如兔［9］，鼠［10］等。Winder N C等［7］證明，對于鑒別肥大細(xì)胞，組織固定在Carnoy氏液中優(yōu)于固定在福爾馬林中，并通過分析正常和病理馬肺樣本肥大細(xì)胞的切片，發(fā)現(xiàn)與正常樣本相比，肥大細(xì)胞在輕度和中度慢性支氣管炎樣本上有少量增加，在輕度、中度和重度毛細(xì)支氣管炎和肺胸膜纖維化中，小的和大的支氣管周圍也觀察到肥大細(xì)胞的增加，纖維化的肺泡隔膜上肥大細(xì)胞的增加最顯著，大約是正常組織的4倍。

圖2 蒙古馬皮膚 MC，MTB－S染色（復(fù)染5s）（100×）Fig.2 Skin mast cells of Mongolia horse，MTB－S staining（5scounterstaining）（100×）

圖4 蒙古馬皮膚 MC，MTB－S染色（復(fù)染5s）（400×）Fig.4 Skin mast cells of Mongolia horse，MTB－S staining（5scounterstaining）（400×）

馬肥大細(xì)胞的研究與其他物種肥大細(xì)胞的研究一樣，也主要集中在過敏性疾病中。肥大細(xì)胞表面的特異性受體FcεRI和IgE結(jié)合后，過敏原通過和肥大細(xì)胞上IgE結(jié)合而激活肥大細(xì)胞，使其脫顆粒釋放血管活性物質(zhì)、炎癥介質(zhì)等［11］。Langner K F等［12］證明，在診斷馬匹夏季濕疹，利用效應(yīng)細(xì)胞（肥大細(xì)胞，嗜堿粒細(xì)胞）檢測過敏癥比通過ELISA血清學(xué)分析要精確，為臨床上檢測過敏反應(yīng)應(yīng)用提供了依據(jù)。Wagner B等［13］研究表明，在馬不同年齡階段，IgE都是肥大細(xì)胞和嗜堿顆粒致敏反應(yīng)的主要免疫球蛋白；在年齡小的馬上，IgG（T）抗體不能在肥大細(xì)胞和嗜堿顆粒的致敏反應(yīng)中起重要的作用，其在成年馬上的作用機理也不清楚。對于肥大細(xì)胞相關(guān)基因正在進(jìn)行研究［14］，這將更深層次挖掘肥大細(xì)胞的作用機理。

馬肥大細(xì)胞在機體防御反應(yīng)及先天免疫中的作用研究報道比較少，這將成為馬肥大細(xì)胞研究的新的方向，從而為馬抗病、抗逆性的研究提供新的思路。本研究雖然只是對蒙古馬皮膚肥大細(xì)胞不同染色方法的進(jìn)行了比較研究，但這為蒙古馬肥大細(xì)胞介質(zhì)的釋放、凋亡及其功能等研究奠定了基礎(chǔ)。

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