兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及肝內(nèi)示蹤＊

張芙蓉，屠慧渭，錢 波，孫 何，金立方

（紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興 312000）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于多種組織中，骨髓是最常用的MSCs體外分離培養(yǎng)的組織來源。MSCs具有較強的增殖潛能和多向分化潛能，同時在造血支持和免疫調(diào)控等方面也發(fā)揮著重要的作用［1－2］。此外，MSCs可以自體取材，體外擴增，具有良好的可塑性也不涉及倫理爭議，是組織工程和細胞治療的理想種源細胞。MSCs在體外可分化為脂肪、成骨、軟骨等中胚層的組織細胞，近10年的研究顯示MSCs還可跨胚層分化為內(nèi)胚層的肝樣細胞，試驗顯示移植后的MSCs能改善肝臟疾病動物模型的臨床癥狀［3－8］。若干MSCs肝內(nèi)移植示蹤方法已有應(yīng)用，如Y染色體探查應(yīng)用于不同性別間細胞移植［9］，ALU序列應(yīng)用于不同種屬間細胞移植［10］，以及應(yīng)用cre－Lox方法結(jié)合GFP標(biāo)記細胞顯像等放射性同位素標(biāo)記細胞移植后的肝內(nèi)分布［11］。這些方法的確立可在不同程度上說明移植細胞的存活和增殖情況，同時為進一步評價骨髓MSCs移植對于肝臟再生和功能恢復(fù)的作用提供依據(jù)。但這些方法也存在一定的缺陷，如Y染色體只能應(yīng)用于不同性別間細胞移植的探查，而綠色熒光蛋白（green flurescence protein，GFP）示蹤細胞熒光較弱，影響觀察效果。攜帶有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green flurescence protein，EGFP）的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞時不但可整合入宿主細胞染色體內(nèi)，具有轉(zhuǎn)染穩(wěn)定、安全無毒等優(yōu)點，且熒光強度高，可直接觀察。兔子是重要的人類肝臟疾病動物模型，本試驗將帶有EGFP的慢病毒載體感染兔骨髓MSCs，觀察其感染效率及細胞活力，示蹤其在肝損傷兔受體肝組織內(nèi)的分布和整合，進一步為MSCs治療提供理論依據(jù)和試驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭大白兔，體重2.5kg左右，年齡5個月～8個月，雌雄不分，來自紹興文理學(xué)院實驗動物基地，動物飼養(yǎng)繁殖及試驗操作處理符合國際試驗動物評估和認證委員會（AAALAC）及紹興文理學(xué)院動物倫理委員會的標(biāo)志和規(guī)定，觀察1周后正常的新西蘭大白兔用于試驗研究。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離 無菌條件下，對兔剪毛、備皮、碘伏消毒后，利用骨髓穿刺針垂直進針，直至感覺有突破或者落空感，證明針尖已經(jīng)進入骨髓腔，拔出針芯，利用事先肝素化的10mL無菌注射器回抽，收集一定量的兔股骨骨髓。迅速轉(zhuǎn)移到實驗室，無菌條件下，按骨髓液與紅細胞裂解液（Tiangen公司）為1∶3的比例加入紅細胞裂解液，充分混勻，待紅系細胞充分裂解后放入離心機，配平后以1 200 r／min離心5min后棄掉上清。再加入無血清培養(yǎng)基重懸沉淀液，以1 200r／min離心5min后棄掉上清，最后加入含100mL／L FBS（Hyclone公司）的α－MEM培養(yǎng)液（Invitrogen公司）重懸細胞。待接種培養(yǎng)。

1.2.2 MSCs的培養(yǎng) 將上述重懸的細胞以1×105cells／mL的密度接種于鋪蓋有明膠（Sigma－Aldrich公司）的塑料培養(yǎng)瓶，α－MEM＋10mL／L FBS＋青鏈雙抗（Sigma－Aldrich公司），在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司）中培養(yǎng)。倒置顯微鏡（Nikon ECLIPSE公司）下每天觀察細胞生長情況并記錄。1d后半換液去除未貼壁細胞的同時并去除未貼壁細胞。待細胞匯合至80%以上時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸去，PBS液沖洗兩次，用0.5g／L的胰酶（Sigma－Aldrich公司）＋0.1 g／L的EDTA（Sigma－Aldrich公司）的消化液消化3 min～5min，待消化基本完全，輕輕利用移液管收集細胞至離心管，1 200r／min的速度離心5min后棄掉上清，用含100mL／L FBS的α－MEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)后，1∶2或者1∶3的比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況換液。

1.2.3 MSCs的鑒定

1.2.3.1 細胞表面分子CD73和CD105測定 培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞消化后取1×106個細胞，分成4組，40mL／L多聚甲醛固定（Sigma－Aldrich公司）10min～20min，然后分別用帶有PE熒光標(biāo)記的CD73（SH3）（BD Pharmingen公司）和CD105（SH2）（BD Pharmingen公司）抗體孵育30 min，以1 200r／min的速度離心后并用PBS液重新懸浮細胞，流式細胞儀分析（BD Biosciences公司）。

1.2.3.2 細胞分化鑒定

（1）成骨誘導(dǎo)分化及鑒定 取第4代細胞，4孔培養(yǎng)板每孔接種2×104個細胞，待80%～90%融合時換成成骨分化培養(yǎng)基，包括0.1μmol／L的地塞米松（Sigma－Aldrich公司）、50mg／L的維生素C（Sigma－Aldrich 公 司 ）、10mmol／L 的 β－磷 酸 甘 油 鈉（Sigma－Aldrich公司）進行聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔日換液，培養(yǎng)14d和21d后，用鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡下進行觀察。

（2）成脂誘導(dǎo)分化及鑒定 取第4代細胞，4孔培養(yǎng)板每孔接種2×104個細胞，24h后換成脂肪分化培養(yǎng)基，含100mL／L FBS的 L－DMEM（Invitrogen公 司），0.25μmol／L 地 塞 米 松 （Sigma－Aldrich公司），50μmol／L吲哚美辛（Sigma－Aldrich公司），0.5mmol／L 3－異丁基－1－甲基黃嘌呤（Sigma－Aldrich公司），10mg／L 牛胰 島素（Sigma－Aldrich公司），每3d換液，誘導(dǎo)2周后，細胞經(jīng)PBS洗滌，40mL／L多聚甲醛固定30min，進行油紅染色檢測脂肪沉積，倒置焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 MSCs的轉(zhuǎn)染 在無抗生素條件下，將攜帶有EGFP報告基因的慢病毒載體（Invitrogen公司生產(chǎn)，由中國科學(xué)院昆明動物研究所惠贈，病毒滴度為4.8×107TU／mL）以不同 MOI值（病毒數(shù)／細胞數(shù)）添加到培養(yǎng)基中，與MSCs共培養(yǎng)8h，換新鮮培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，LSM 5105META）下進行觀察。

1.2.5 兔急性／亞急性肝功能衰竭模型的建立及MSCs的移植 12只新西蘭成年大白兔（雌5只，雄7只），兔耳緣靜脈注射D﹣氨基半乳糖2.5mmol／kg，建造急性／亞急性肝功能衰竭模型。24h后耳緣靜脈內(nèi)注射0.1mL MSCS細胞液，濃度為1×108／mL。在移植后第3天（處死2只）、第7天（處死3只）和第15天（處死3只）處死兔子，收集肝組織，5 μm厚冰凍組織切片或HE染色，激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）進行表示。統(tǒng)計分析采用SPSS 10.0軟件進行One－Way ANOVA分析。P＜0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 兔MSCs體外的穩(wěn)定傳代

兔MSCs在含有100mL／L胎牛血清的培養(yǎng)基中可在24h內(nèi)貼壁生長，外觀呈梭形（圖1A），經(jīng)過48h的靜止期后開始快速增殖，呈螺旋狀，倍增時間約為30h，約7d～8d可達80%～90%的匯合（圖1 B）。細胞可在體外連續(xù)傳10代以上，仍具有增殖和分化的潛能。

2.2 兔MSCs表面抗原分析

經(jīng)免疫細胞化學(xué)分析，體外培養(yǎng)的MSCs表達CD105（圖2A）和CD73（圖2B），符合間充質(zhì)干細胞的表面抗原特征。

2.3 兔MSCs體外分化能力鑒定

MSCs在脂肪細胞分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)后可見細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微小、分散的脂滴，2周后脂滴增大并匯合。多聚甲醛固定，油紅染色，脂滴可被油紅染色（圖3A），說明MSCs具備向脂肪細胞分化的潛能。

MSCs在成骨細胞分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)中培養(yǎng)可見細胞聚集，21d后，多聚甲醛固定，聚集區(qū)可被茜素紅染色（圖3B），說明MSCs具備向骨細胞分化的潛能。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)（100×）Fig.1 Morphology of BM－MSC（100×）

圖2 MSCs表面抗原分析Fig.2 Analysis of surface antigens of MSCs

2.4 兔MSCs的轉(zhuǎn)染結(jié)果

慢病毒轉(zhuǎn)染后培育48h后，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（圖4B）。不同感染復(fù)數(shù)（multiplicit of infection，MOI）對 MSGS轉(zhuǎn)染效率見表1，其中當(dāng)MOI值等于6時可使81.25%的細胞轉(zhuǎn)染EGFP標(biāo)記，達到最高的轉(zhuǎn)染效率，且該標(biāo)記不會隨細胞分裂丟失，可穩(wěn)定表達。

圖3 MSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細胞（A，200×）和成骨細胞（B，100×）Fig.3 MSCs induced to differentiate into fat cells by oil red staining（A，200×）and into osteoblasts by alizarin red staining（B，100×）

圖4 攜帶有EGFP報告基因的慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染MSCs（B），A為B相應(yīng)的可見光圖片，200×Fig.4 MSCs were transected by lentiviral vector with EGFP reporter gene（B）and A is phase contrast microscopy of B，200×

表1 不同的MOI值下的轉(zhuǎn)染效果Table 1 Different MOI values have different transfection efficiency

2.5 MSCs的肝內(nèi)觀察

耳緣靜脈注射D﹣氨基半乳糖3d后，處死兔子，肝組織切片HE染色結(jié)果顯示正常肝組織結(jié)構(gòu)受到破壞，肝組織多個區(qū)域肝細胞壞死或凋亡（圖5 A，白色箭頭所指的區(qū)域），部分兔子出現(xiàn)死亡或昏迷等臨床現(xiàn)象，表明兔肝組織發(fā)生不同程度的急性／亞急性肝衰。通過冰凍切片的觀察，可在受體肝組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)綠色熒光的細胞。移植的第3天在受體肝組織內(nèi)可見少量的EGFP標(biāo)記的供體細胞（圖5 B），移植的第7天EGFP標(biāo)記的細胞數(shù)量有所增加（圖5C），移植的第15天可見大量的EGFP標(biāo)記的細胞（圖5D）。細胞熒光強度并不隨移植的時間延長而減弱。

圖5 兔急性／亞急性肝衰竭模型的建立（100×）及供體MSCs在受體肝組織內(nèi)的分布（200×）Fig.5 Establishment of acute／subacute liver failure of rabbit model and observation of transplanted MSCs in receipt liver

3 討論

應(yīng)用成熟肝細胞移植治療肝臟疾病已有10多年時間，大多數(shù)臨床病例可以看到癥狀改善，并維持一年以上，但成熟肝細胞來源有限，很大程度限制了其應(yīng)用，而以干細胞為來源細胞移植相比成熟肝細胞有許多優(yōu)勢。MSCs是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可分化為具有功能的組織細胞并應(yīng)用于器官損傷的治療。近期研究顯示，在特定條件下，MSCs可被誘導(dǎo)分化為肝細胞或類肝樣細胞。國內(nèi)外眾多學(xué)者都已經(jīng)證實移植的MSCs可定居于肝臟并分化為肝細胞或類肝樣細胞，應(yīng)用骨髓MSCs治療肝病的臨床試驗近幾年已有少量病例報道，證實骨髓MSCs分化來源的肝細胞移植可以降低死亡率，改善肝功能［3－8］。

若干體內(nèi)移植細胞示蹤方法已有應(yīng)用，如Y染色體探查應(yīng)用于不同性別間細胞移植，ALU序列探查和熒光原位雜交技術(shù)（FISH）應(yīng)用于不同種屬間移植、放射性同位素標(biāo)記移植細胞以及應(yīng)用GFP標(biāo)記細胞顯像。這些方法的確立可在不同程度上說明移植細胞的存活和增殖情況，但均存在不同程度的缺陷。Y染色體探查及ALU序列探查因其自身的特點而無法廣泛使用［9－14］。與其他病毒載體系統(tǒng)相比，慢病毒具有能夠轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細胞并穩(wěn)定表達治療基因，無明顯免疫反應(yīng)等特點，同時能偶轉(zhuǎn)染廣泛的組織、能夠被濃縮成高滴度等優(yōu)點。EGFP作為報告基因具有觀察簡單方便和直觀的優(yōu)點，EGFP在470nm波長處可吸收激發(fā)光，在510 nm發(fā)射綠色熒光，只要有足夠的表達，可以直接在冰凍的組織切片下觀察，甚至直接在活體狀態(tài)下觀察，克服了傳統(tǒng)GFP方法及其他報告基因需要底物及維持時間短的缺點［15］。本研究結(jié)果表明EGFP標(biāo)記的細胞在受體肝組織內(nèi)呈一定的分布，在不使用GFP抗體的情況下可在冰凍組織切片里直接觀察，是一種簡單高效的示蹤細胞的方法。

本研究利用攜帶EGFP報告基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓來源MSCs，轉(zhuǎn)染后的兔骨髓MSCs的生長狀態(tài)、增殖與轉(zhuǎn)染前基本一致，說明慢病毒載體攜帶EGFP轉(zhuǎn)染在一定范圍內(nèi)不影響兔骨髓MSCs的生長特性，這與已有的文獻報道基本一致［16－17］。試驗結(jié)果還顯示慢病毒轉(zhuǎn)染效果與轉(zhuǎn)染MOI值相關(guān)，在一定范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨MOI值的增大而提高，但超過一定值后，轉(zhuǎn)染的陽性率反而出現(xiàn)下降。原因可能是使用過高的MOI值（即提高病毒濃度）導(dǎo)致病毒的細胞毒性致使細胞死亡，致使轉(zhuǎn)染效率降低。

［1］Terai S，Ishikawa T，Omori K，et al.Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy［J］.Stem Cell，2006，24：2292－2298.

［2］趙程程，范東燕，葉海青.大鼠胰腺間充質(zhì)干細胞的分離鑒定及體外誘導(dǎo)成脂和成骨研究［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（8）：11－16.

［3］Ghaedi M，Lotfi A S，Soleimani M.Establishment of lentivi－ral－vector－mediated model of human alpha－1antitrypsin delivery into hepatocyte－like cells differentiated from mesenchymal stem cells［J］.Tissue Cell，2010，42（3）：181－189.

［4］Stock P，Brückner S，Ebensing S，et al.The generation of hepatocytes from mesenchymal stem cells and engraftment into murine liver［J］.Nat Protoc，2010，5（4）：617－627.

［5］Ishikawa T，Banas A，Hagiwara K，et al.Stem cells for hepatic regeneration：the role of adipose tissue derived mesenchymal stem cells［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2010，5（2）：182－189.

［6］王豪勛，馬 軍，段芳齡，等.骨髓間充質(zhì)干細胞治療肝硬化的動物實驗研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2006，l5（4）：365－368.

［7］Sato Y，Arak H，Kato J.Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion［J］.Blood，2005，106（2）：756－763.

［8］Lyra A C，Soares M B，Silva L F，et al.Feasibility and safety of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with advanced chronic liver disease［J］.World J Gastroenterol，2007，13（7）：1067－1073.

［9］Alison M R，Poulsom R，Jeffery R，et al.Hepatocytes from non－h(huán)epatic adult stern cells［J］.Nature，2000，406（6793）：257.

［10］Aurich L，Mueller L P，Aurich H，et al.Functional integration of hepatocytes derived from human mesenchymal stem cells into mouse livers［J］.Gut，2007，56（3）：405－415.

［11］Harris R G，Herzog E L，Bruscia E M，et al.Lack of a fusion requirement for development of bone marrow－derived epithelia［J］.Science，2004，305（5680）：90－93.

［12］Prasher D C，Eckenrode V K，Ward W W，et al.Primary structure of the aequorea victoria green－fluorescent protein［J］.Gene，1992，111（2）：229－233.

［13］Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression［J］.Science，1994，263（5148）：802－805.

［14］段 峰，王茂強.干細胞標(biāo)記示蹤技術(shù)的研究進展［J］.國際醫(yī)學(xué)放射學(xué)雜志，2009，32（6）：563－566.

［15］宗兆文，程天民.綠色熒光蛋白標(biāo)記在干細胞移植中的應(yīng)用［J］.中國臨床康復(fù)，2006，29（10）：141－143.

［16］Yan Z Q，Hang D H，Guo C A，et al.Fate of mesenchymal stem cells transplanted to osteonecrosis of femoral head［J］.J Orthopaedic Res，2009，27（4）：442－446.

［17］Huang W Y，Aramburu J，Douglas P S，et al.Transgenic expression of green fluorescence protein can cause dilated cardimyophthy［J］.Nat Med，2000，6（5）：482－483.