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    四種中藥對(duì)結(jié)腸小袋蟲半數(shù)致死濃度的測(cè)定*

    2011-05-31 06:55:24楊沛沛王天奇閆文朝
    關(guān)鍵詞:小袋機(jī)率甲硝唑

    楊沛沛,王天奇,閆文朝,代 娟

    (河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003)

    結(jié)腸小袋蟲?。˙alantidiosis)是由結(jié)腸小袋蟲(Balantidium coli)感染引起的人獸共患寄生蟲病,呈世界性分布,主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),可引起宿主腹瀉,結(jié)腸潰瘍和穿孔[1-2]。目前已知人及33種動(dòng)物可感染該蟲。豬結(jié)腸小袋蟲感染非常普遍,感染率高達(dá)20%~100%[3-4]。臨床上,可用于抗結(jié)腸小袋蟲的藥物主要是硝基咪唑類化合物,由于它們有“三致”作用,我國(guó)農(nóng)業(yè)部已明確規(guī)定食品動(dòng)物禁用或限用這類藥物[5]。因此,如何控制食品動(dòng)物如豬的結(jié)腸小袋蟲病成為一個(gè)難題,為此,我們利用體外急性毒性試驗(yàn)方法中的機(jī)率單位法[6-7],測(cè)定了常山、五倍子、二花和烏梅4種中藥體外抗結(jié)腸小袋蟲的半數(shù)致死濃度,并進(jìn)行了比較,為開發(fā)應(yīng)用抗結(jié)腸小袋蟲中藥品種提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 蟲種 采自豫西地區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)自然發(fā)病的病豬糞便,直接鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量滋養(yǎng)體。

    1.1.2 試劑及藥品 DMEM 培養(yǎng)基,10.0g裝,Lot№1342967,GIBCOTM;小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)為100424;碳酸氫鈉,西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn),批號(hào)為100623,分析純;可溶性淀粉,北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基廠生產(chǎn),批號(hào)100517,用前取適量裝入潔凈小瓶中高壓滅菌;常山、五倍子、烏梅、二花購(gòu)自北京同仁堂(洛陽(yáng))有限公司;20g/L甲硝唑注射液,河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H41020499。

    1.2 方法

    1.2.1 DMEM培養(yǎng)液配制 用高壓滅菌雙蒸餾水溶解DMEM培養(yǎng)基,每1 000mL加碳酸氫鈉3.7 g。培養(yǎng)基用G6濾器過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。使用前根?jù)需要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7.0。

    1.2.2 結(jié)腸小袋蟲培養(yǎng) 取經(jīng)嚴(yán)格清洗和滅菌的小安瓿,每個(gè)小安瓿內(nèi)加DMEM培養(yǎng)液2.55mL、滅能小牛血清0.45mL、消毒淀粉40mg、青霉素、鏈霉素1萬(wàn)單位/mL。取糞便樣品少許接種于培養(yǎng)液內(nèi),在28℃條件下培養(yǎng)48h,鏡檢后發(fā)現(xiàn)大量活動(dòng)滋養(yǎng)體后用于試驗(yàn)研究,不用于試驗(yàn)時(shí)傳代轉(zhuǎn)接[8]。

    1.2.3 中草藥水提取物的制備 將備用的中藥各加10倍體積的水浸泡3h,之后用砂鍋文火煎煮2 h,將煎液用篩網(wǎng)濾出,余渣再加10倍體積水,文火煎煮2h,合并兩次煎液,再用文火濃縮到每mL相當(dāng)生藥0.5g。最后將煎好的藥液盛入瓶中加蓋高壓滅菌,冷卻后放入2℃~8℃條件下備用[9-10]。

    1.2.4 中藥抗結(jié)腸小袋蟲半數(shù)致死濃度的測(cè)定用DMEM培養(yǎng)液將中藥煎液稀釋成所需終濃度梯度的兩倍,取24個(gè)滅菌小安瓿,每安瓿加培養(yǎng)48h的蟲體懸液1mL,之后將其分為8組,每組3個(gè)平行。最后每個(gè)小安瓿內(nèi)加入相應(yīng)濃度的中藥煎液1mL。8組小安瓿內(nèi)中除對(duì)照外,其余7個(gè)為不同濃度中藥煎液。上述小安瓿加蓋后放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中,2、6、12h后取出觀察。觀察時(shí),將每個(gè)小安瓿內(nèi)液體充分混勻,吸取40μL滴于載玻片上,加蓋玻片,于100×鏡暗視野下計(jì)數(shù)30個(gè)視野活蟲數(shù)。試驗(yàn)時(shí)以甲硝唑?yàn)橘|(zhì)控藥物,以同樣方法檢測(cè)其不同時(shí)間的半數(shù)致死濃度。因沒有現(xiàn)有可參考的文獻(xiàn)資料,試驗(yàn)所使用的藥物濃度梯度是在多次預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的[11]。

    1.2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算 采用機(jī)率單位法計(jì)算LC50及其95%置信限[11]。以對(duì)照組(藥物濃度為0)3個(gè)平行樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所查獲的平均活蟲數(shù)(30個(gè)視野)為X,以相應(yīng)試驗(yàn)系列各濃度組3個(gè)平行樣品,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所查獲的平均活蟲數(shù)(30個(gè)視野)為Y,將(X-Y)/X的值換算為百分?jǐn)?shù),就是該濃度條件下的蟲體死亡率。根據(jù)死亡百分率-機(jī)率單位換算表,將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機(jī)率單位。在Excel圖表系統(tǒng)下,以橫軸表示濃度對(duì)數(shù),以縱軸表示機(jī)率單位,作XY散點(diǎn)圖。順著所獲得的散點(diǎn)作一趨勢(shì)線(直線),并自動(dòng)獲得該直線的回歸方程及決定系數(shù)R2。經(jīng)X2檢驗(yàn)回歸線符合要求后,可利用該方程求出死亡機(jī)率單位5(50%死亡率)時(shí)的藥物濃度對(duì)數(shù),查反對(duì)數(shù)表就可獲得LC50。同時(shí),利用回歸方程的斜率求出lgLC50的標(biāo)準(zhǔn)誤Sm,則lgLC50的95%置信限=lgLC50±1.96Sm,最后查反對(duì)數(shù)表就可獲得LC50的95%置信限。

    2 結(jié)果

    2.1 結(jié)腸小袋蟲的死亡過程

    在新鮮糞便樣品或培養(yǎng)液中的結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體可借助體表纖毛的擺動(dòng)作快速旋轉(zhuǎn)式前進(jìn)或原地轉(zhuǎn)動(dòng)。前行中的蟲體遇到障礙物可迅速掉頭;遇到適當(dāng)?shù)目p隙,可改變體形通過[8]。滋養(yǎng)體在一定濃度的藥物作用下,運(yùn)動(dòng)能力逐漸減弱,或原地緩慢旋轉(zhuǎn),或僅胞口處的纖毛小幅度擺動(dòng)。死亡的滋養(yǎng)體不能運(yùn)動(dòng),體表斜縱列纖毛變直,與體表接近垂直,表膜隨后破裂或消失,內(nèi)容物脫出(圖1)。

    圖1 結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體死亡狀態(tài)(400×)Fig.1 Death state of trophozoite of Balantidium coli(bar=50mm)

    2.2 半數(shù)致死濃度的測(cè)定結(jié)果

    表1~表5分別顯示4種中藥及甲硝唑不同時(shí)間對(duì)結(jié)腸小袋蟲的毒性效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)?;貧w方程經(jīng)X2檢驗(yàn)后,X20.05>X2,說(shuō)明濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位之間的線性關(guān)系均成立,并根據(jù)回歸方程最終確定了各種藥物不同時(shí)間的LC50及其95%置信限。圖2顯示4種中藥及甲硝唑不同時(shí)間抗結(jié)腸小袋蟲半數(shù)致死濃度的比較,2h的LC50由低到高排序?yàn)槲灞蹲?、常山、烏梅、二花?h和12h的LC50排序均為五倍子、烏梅、常山、二花。

    表1 常山水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲的毒性效應(yīng)Table 1 Toxicity of water extracts from Dichroa febrifugaagainst B.coli

    表2 五倍子水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲的毒性效應(yīng)Table 2 Toxicity of water extracts fromGalla chinensis against B.coli

    表3 烏梅水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲的毒性效應(yīng)Table 3 Toxicity of water extracts fromPrunus mume against B.coli

    表4 二花水提取物對(duì)結(jié)腸小袋蟲的毒性效應(yīng)Table 4 Toxicity of water extracts fromLonicera japonica against B.coli

    表5 甲硝唑?qū)Y(jié)腸小袋蟲的毒性效應(yīng)Table 5 Toxicity of metronidazole against B.coli

    3 討論

    結(jié)腸小袋蟲包括滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)階段,人及動(dòng)物食入包囊后,囊壁在消化液作用下被破壞,滋養(yǎng)體脫出,其以結(jié)腸及盲腸內(nèi)的淀粉、細(xì)菌及脫落的細(xì)胞為食,并以橫二分裂法及出芽生殖方式繁殖[8],當(dāng)人和動(dòng)物免疫力下降或腸道黏膜受損時(shí)侵入腸黏膜而引起發(fā)病[12-13]。藥物對(duì)滋養(yǎng)體有殺滅作用,而對(duì)包囊無(wú)效[14]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道未發(fā)現(xiàn)結(jié)腸小袋蟲對(duì)藥物有抗性[3],但有關(guān)結(jié)腸小袋蟲藥物敏感性的研究較少,更未見關(guān)于中藥抗蟲濃度的研究。

    本試驗(yàn)利用機(jī)率單位法,首次檢測(cè)了4種中藥抗結(jié)腸小袋蟲的半數(shù)致死濃度,為應(yīng)用中藥預(yù)防控制該蟲引起的感染提供了科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),4種中藥中,常山的2h和6h的LC50接近,且二者LC50的95%置信限有重疊,說(shuō)明其對(duì)結(jié)腸小袋蟲的毒性具有較好的速效性。而其他3種中藥3個(gè)時(shí)間的LC50差異較大,且隨時(shí)間延長(zhǎng),LC50大幅度減小,與甲硝唑的作用類似,沒有速效性。LC50越小,說(shuō)明藥物的作用效果越好,五倍子、常山和烏梅的不同時(shí)間的LC50均小于相應(yīng)時(shí)間二花的LC50,可作為抗結(jié)腸小袋蟲候選中藥。中藥水提取物是多種成分的混和物,在分離出單體之前難以確定是哪一種成分在起作用,也就無(wú)從知道其作用方式[9-10]。今后要用多種溶劑提取其有效成分,并進(jìn)行試驗(yàn),以確定上述中藥抗結(jié)腸小袋蟲的作用成分及其作用機(jī)制,并利用動(dòng)物試驗(yàn)尋找恰當(dāng)?shù)膭┝亢蛣┬汀?/p>

    圖2 不同藥物對(duì)結(jié)腸小袋蟲的半數(shù)致死濃度比較Fig.2 Comparison of LC50of different medicines against B.coli

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