關(guān)中奶山羊乳房炎滅活菌苗的制備及其免疫效果測定＊

牟 珊，李成山，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100）

乳房炎主要發(fā)生于泌乳動物，尤其在奶牛最為常見。近年來隨著奶山羊養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，奶山羊乳房炎問題表現(xiàn)的也日益突出［1－3］。據(jù)我們調(diào)查，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)關(guān)中奶山羊隱性乳房炎的發(fā)生率在30%～60%，而一旦奶山羊乳房炎呈現(xiàn)臨床癥狀不及時治療，通常導(dǎo)致乳房壞死甚至個體死亡。奶山羊乳房炎不僅給養(yǎng)殖場造成嚴重的經(jīng)濟損失，同樣也會導(dǎo)致羊乳品質(zhì)下降，微生物超標，引發(fā)食品安全問題。由于抗生素治療乳房炎的缺陷越來越明顯［4－6］，因此解決乳房炎問題的關(guān)鍵還在于有效的預(yù)防措施和手段。與奶牛乳房炎最大的不同之處在于，引起奶山羊乳房炎的病原菌種類相對較少。奶牛乳房炎的病原微生物種類至少在50中以上，包括細菌、真菌和病毒等，而奶山羊乳房炎的病原微生物則主要是葡萄球菌和大腸埃希菌［7］。據(jù)此我們認為，用疫苗預(yù)防奶山羊乳房炎是可行的。本研究以我們分離的關(guān)中奶山羊乳房炎地方菌株為材料，進行了相應(yīng)的疫苗研制及其免疫后的抗體測定工作，現(xiàn)將結(jié)果報告如下，以期為相關(guān)研究提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院免疫學實驗室從患乳房炎關(guān)中奶山羊乳汁中分離鑒定的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。

1.1.2 試驗用動物 成年泌乳期奶山羊，購自楊凌周圍關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖戶，經(jīng)診斷試劑檢驗為乳房炎陰性。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基為奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；無水乙醇、甲醛、雙氧水、吐溫－80（國產(chǎn)分析純），粗蜂膠，轉(zhuǎn)移因子（西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院免疫學實驗室所制）；LMT為蘭州隱性乳房炎診斷液）；BSA為陜西中美生物科技有限公司產(chǎn)品，HRP－兔抗羊IgG為北京奧博森生物有限公司產(chǎn)品，TMB為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 無菌操作臺，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床，半自動高壓滅菌鍋（YXQ－LS－1881）為上海博訊有限公司產(chǎn)品，粉碎機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52AA）為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品，凍干機（SIM），低速離心機（LD4－2A）為北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品，冷凍離心機為Sigma公司產(chǎn)品，制冰機，超聲波細胞破碎儀（sonics），漩渦儀，4℃、－20℃冰箱，酶標儀bio－Rad，微量移液槍（10μL～1 000μL），電磁爐，電子天平，顯微鏡，96孔微量反應(yīng)板等。

1.2 方法

1.2.1 蜂膠提取物的制備 天然蜂膠－20℃過夜，次日取出搗碎，經(jīng)粉碎機充分粉碎后，溶入750 mL／L的乙醇溶液中。24h后過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮蜂膠提取液至黏稠，－45℃真空冷凍干燥48h，即得蜂膠純化干物質(zhì)，密封4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將分離菌株接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)16h～18h。然后倒少量肉湯于普通瓊脂培養(yǎng)皿中，輕輕晃動使之均勻鋪于培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，用無菌針管吸出多余肉湯。37℃培養(yǎng)18h～24h，倒入少量無菌生理鹽水，刮取細菌，即為所擴菌液，4 000r／min離心10min，其去上清，用無菌生理鹽水稀釋，麥氏比濁法計數(shù)，調(diào)整兩種細菌濃度至2×1010／mL。

1.2.3 菌液滅活及滅活檢驗 制備好的菌液中按照3ml／L加入甲醛，大腸埃希菌菌液37℃滅活48 h，葡萄球菌菌液滅活96h。取少量滅活后的菌液接種于普通培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察有無細菌生長。

1.2.4 疫苗的制備 蜂膠佐劑疫苗的制備：稱取一定量的蜂膠溶于750mL／L的酒精中，制成100 mg／mL的蜂膠溶液。把擴增好的濃縮大腸埃希菌和葡萄球菌菌液稀釋成1×1010個細菌／mL，1∶2混合，即為混合菌液。然后將制好的蜂膠溶液和混合菌液1∶1混合，濃度為0.5×1010個細菌／mL，再加入20mL／L的吐溫80，振蕩器上振蕩2h，使蜂膠溶液和菌液充分混合和乳化。4℃保存。轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗的制備：把擴增好的濃縮菌液與10mL轉(zhuǎn)移因子溶液混合，制成1×1010個細菌／10mL的菌液，即為轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗，4℃保存。無佐劑疫苗的制備：把濃縮的菌液稀釋成0.5×1010個細菌／mL即可，4℃保存。

1.2.5 奶山羊免疫試驗 12只泌乳奶山羊，隨機分為4組，即蜂膠佐劑組、轉(zhuǎn)移因子組、轉(zhuǎn)移因子＋蜂膠組、不加佐劑組。每組3只。免疫部位為乳房基部和腹股溝兩側(cè)。免疫劑量為：蜂膠組2mL／只，無佐劑組2mL／只，轉(zhuǎn)移因子組10mL／只，蜂膠＋轉(zhuǎn)移因子組每只同時注射1mL蜂膠疫苗和5ml轉(zhuǎn)移因子疫苗。一免后的第15d，同樣劑量同樣部位進行再次免疫。

1.2.6 樣本的采集 分別在免疫前及第一次免疫后3、7、10、15、18、22、25、30d采取所有羊的乳汁和血液樣本。分離乳清、血清，分別測定大腸埃希菌、葡萄球菌的抗體效價。

1.2.7 ELISA方法的建立 可溶性抗原的制備：分別接種大腸埃希菌和葡萄球菌于肉湯中，37℃搖床培養(yǎng)24h。10 000r／min離心，棄上清，菌泥用無菌生理鹽水洗滌并10 000r／min離心3次，最后加入適當?shù)腜BS制成細菌懸液。冰浴超聲300w，5s／5 s超聲破碎至菌液清亮。10 000r／min離心10min，取上清即為抗原蛋白溶液。上清中的蛋白含量為6 mg／mL（大腸埃希菌）、0.82mL（葡萄球菌）。

ELISA最佳反應(yīng)條件的摸索：用棋盤法確定抗原最佳包被濃度和樣本最佳稀釋度，以陽性樣本吸光值減去空白和陰性對照后，值最接近1.0的為最佳稀釋度，然后選擇其他最佳反應(yīng)條件。

1.2.8 樣本抗體效價的測定 大腸埃希菌及葡萄球菌抗體效價測定 按照本試驗建立的ELISA測定條件，分別測定樣品中相應(yīng)的抗體效價。P／N＞2.1判為陽性，否則判為陰性。

乳樣中IgA的測定：按照大連寶生奶山羊IgA試劑盒上的說明，檢測乳樣中IgA的含量。

1.2.9 攻毒試驗 第一次疫苗免疫后第31天進行攻毒試驗。分別取1×1010／mL濃度的大腸埃希菌、葡萄球菌活菌菌液各1mL混勻后，用滅菌脫脂棉蘸取適量涂抹試驗羊乳頭。連續(xù)在1周內(nèi)用LMT診斷液測定乳汁體細胞的變化情況，并觀察試驗羊的精神狀況、飲食欲、乳房外觀等變化。

2 結(jié)果

2.1 滅活效果檢驗

經(jīng)滅活處理的大腸埃希菌和葡萄球菌，接種普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，觀察無菌落生長，證明滅活效果徹底。

2.2 ELISA測定葡萄球菌和大腸埃希菌的最優(yōu)化條件

最終確定葡萄球菌和大腸埃希菌抗原的ELISA最佳包被濃度都為10μg／mL，抗原最佳包被條件為4℃包被24h，用10g／L的BSA作為封閉劑37℃封閉30min，樣本反應(yīng)時間為1h，酶標二抗的反應(yīng)最佳時間為45min，底物反應(yīng)時間為30 min。

2.3 乳汁中IgA抗體的測定

乳汁中分泌性IgA在乳腺免疫中發(fā)揮著極其重要的作用［8－9］。sIgA通過結(jié)合病原菌表面參與黏附宿主乳腺上皮細胞的相關(guān)抗原分子，使得病原菌喪失粘附上皮細胞并進入組織的能力，從而發(fā)揮其免疫功能。因此，準確測定乳汁中sIgA含量是評估乳腺免疫功能的重要指標之一。山羊免疫乳房炎滅活疫苗后，乳汁中sIgA含量是否升高，也是評估該疫苗的關(guān)鍵指標之一。本試驗結(jié)果顯示，各個免疫組的sIgA含量均在免疫后不斷上升，與免疫前有明顯差異；含佐劑的疫苗免疫后sIgA上升明顯高于不含佐劑的疫苗，表明佐劑能夠有效促進疫苗免疫后sI－gA的產(chǎn)生，蜂膠和轉(zhuǎn)移因子二者的效果差異不大。但是，在針對疫苗的再次免疫應(yīng)答中，不含佐劑疫苗、蜂膠疫苗免疫后1周內(nèi)sIgA的含量會出現(xiàn)短暫的下降階段，而轉(zhuǎn)移因子協(xié)同疫苗的再次免疫應(yīng)答則不會導(dǎo)致sIgA含量的下降，表明轉(zhuǎn)移因子在乳房炎疫苗免疫中的佐劑效應(yīng)還是優(yōu)于蜂膠（圖1）。

2.4 血液和乳汁中葡萄球菌抗體的測定結(jié)果

本次試驗使用的山羊均為成年泌乳期的奶山羊，考慮到試驗期僅1個月，因此試驗中未設(shè)空白對照組和鹽水注射對照組。更重要的是，本試驗的目的是弄清楚滅活疫苗配合不同佐劑免疫后的效果差異。結(jié)果顯示，與免疫前相比，各免疫組山羊血液和乳汁中均產(chǎn)生了抗葡萄球菌的抗體，并且隨著時間延長，抗體效價呈不斷提高的特征；綜合分析佐劑效果，轉(zhuǎn)移因子無論在促進血液還是乳汁中特異性抗體效應(yīng)方面都優(yōu)于蜂膠，并且對提高乳汁中特異性抗體效價的作用更佳；從抗體產(chǎn)生量分析，再次免疫效果更好，尤其對乳汁中特異性抗體而言更是如此。此外，乳汁中的抗體效價總是稍低于血液中相應(yīng)的抗體效價1～2個低度（圖2、圖3），提示通過測定血液中特異性抗體效價，基本可以了解乳汁中的抗體效價。

2.5 血液和乳汁中大腸埃希菌抗體的測定結(jié)果

用滅活大腸埃希菌免疫刺激機體產(chǎn)生抗體的研究報道很多，但如何提高乳汁中相應(yīng)抗體效價方面，這方面的文獻還不是很多。本研究結(jié)果顯示，盡管轉(zhuǎn)移因子和蜂膠佐劑在提高血液大腸埃希菌抗體效價方面似乎作用不是很顯著，但轉(zhuǎn)移因子卻可以顯著提高乳汁中大腸埃希菌的抗體效價（圖4、圖5）。

2.6 攻毒試驗結(jié)果

圖1 乳汁中IgA的變化Fig.1 Kinetic analysis of milk sIgA

圖2 血清中葡萄球菌抗體變化Fig.2 Kinetic analysis of blood serum antibody to Staphylococcus

圖3 乳汁中葡萄球菌抗體的變化Fig.3 Kinetic analysis of milk antibody to Staphylococcus

圖4 血清中大腸埃希菌抗體的變化Fig.4 Kinetic analysis of blood serum antibodiy to Escherichia coli

攻毒試驗結(jié)果顯示，添加轉(zhuǎn)移因子或蜂膠的疫苗免疫組的6只羊在細菌攻擊后其精神狀況、飲食欲、乳房外觀等與攻擊前一樣，其乳汁中的體細胞也都沒有超過2×105／mL；單獨用疫苗免疫的3只羊，其中2只的精神狀況、飲食欲、乳房外觀等與添加佐劑的疫苗免疫相同，剩余的1只羊精神出現(xiàn)輕度沉郁、食欲不佳等表現(xiàn)，乳房外觀略有發(fā)紅現(xiàn)象，但這種變化在攻毒后第5天開始減輕，第7天基本恢復(fù)正常。這只羊乳汁中的體細胞在細菌攻擊后出現(xiàn)升高，最高時達到5×105／mL，乳汁呈淡黃色，但到了第7d，乳汁中白細胞已經(jīng)降到了3×105／mL，乳汁顏色也恢復(fù)正常。

圖5 乳汁中大腸埃希菌抗體的變化Fig.5 Kinetic analysis of milk antibody to Escherichia coli

3 討論

乳房炎主要由病原菌通過乳頭感染乳腺組織而引起，機體抗御乳房炎病原菌感染的免疫力量包括抗體、中性粒細胞等吞噬細胞［10］。在感染早期，清除乳腺組織病原菌的力量是中性粒細胞等吞噬細胞，特異性免疫應(yīng)答一旦啟動，在特異性抗體的協(xié)同作用下，清除乳腺病原菌效果更佳?？贵w在其中的作用主要包括調(diào)理這樣、ADCC和中和作用，抗體效價越高，其作用越強大。因此，測定抗體效價是評估乳房炎疫苗免疫效果的關(guān)鍵指標之一。參與清除乳房炎病原菌的抗體不僅包括IgG，還有sIgA，IgG主要參與清除乳腺組織中病原菌過程，其發(fā)揮作用的方式有ADCC、調(diào)理作用和中和作用，sIgA則通過中和乳汁中的細菌發(fā)揮其免疫功能［11－12］。因此，本研究主要測定了免疫乳房炎疫苗后血液IgG和乳汁sIgA的變化，研究結(jié)果表明，疫苗免疫可以顯著增強血液和乳汁中的抗體效價，從而使機體更有效抵制乳房炎病原菌侵襲，降低乳房炎發(fā)生率。攻毒試驗表明，疫苗免疫保護效果顯著，添加佐劑可顯著提高疫苗免疫效果。疫苗中添加佐劑是提高疫苗免疫效果的常用手段，常用的佐劑包括鋁膠鹽佐劑、白油、蜂膠等［13－14］。但較理想的佐劑不但要具備無毒副作用、能被機體完全吸收和促進抗體產(chǎn)生的效應(yīng)，還應(yīng)當具有改善提高機體免疫能的作用［15］。因此，本研究選擇并測試了蜂膠和轉(zhuǎn)移因子的佐劑效果。試驗結(jié)果表明，分別采用這兩種佐劑協(xié)同疫苗免疫奶山羊后，轉(zhuǎn)移因子通常在免疫后2d即可被機體完全吸收，而蜂膠佐劑則在免疫后14d還存在殘留。檢查接種部位發(fā)現(xiàn)接種轉(zhuǎn)移因子佐劑部位組織完全正常，而蜂膠佐劑部位不僅存在殘留，且呈現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)特征。更重要的是，與單獨免疫疫苗相比，轉(zhuǎn)移因子不僅能和蜂膠一樣夠顯著提高血液中疫苗特異性抗體效價，它在提高乳汁中sI－gA效價方面的作用明顯優(yōu)于蜂膠，并且抗體效價不受疫苗再次免疫的影響而出現(xiàn)暫時下跌。因此，我們認為轉(zhuǎn)移因子更適合作為乳房炎滅活疫苗佐劑。

需要指出的是，本試驗采用的奶山羊?qū)儆诔赡昝谌樯窖?，并且來自散養(yǎng)戶。雖然試驗前經(jīng)試劑測試都屬于乳房炎陰性，但其血液中都存在一定量的大腸埃希菌和葡萄球菌抗體。這些抗體是奶山羊生活中接觸大腸埃希菌和葡萄球菌而產(chǎn)生的，其未必都一定與乳房炎有關(guān)，由于本試驗采用的ELISA方法無法區(qū)別大腸埃希菌和葡萄球菌的血清型，因此測出來免疫前的奶山羊體內(nèi)存在這些細菌抗體效價，這種情況在評估乳房炎疫苗免疫效果時很難避免，因為到了泌乳期年齡的奶山羊很難也無法避免其體內(nèi)不含有這兩種常見細菌的抗體。但依據(jù)本研究結(jié)果分析，其并未對本試驗結(jié)果產(chǎn)生多大影響，尤其乳汁中的sIgA在本試驗中呈現(xiàn)典型的再次應(yīng)答規(guī)律。因此，試驗前保證奶山羊乳房炎陰性和個體健康是關(guān)鍵條件，體內(nèi)抗體不是主要影響因素。一個有意思的問題是，迄今為止尚缺乏一個為大家所普遍接受的標準，即奶山羊乳汁中特異性抗體效價達到多少時，就可以有效防止相應(yīng)病原菌的感染而發(fā)生乳房炎？雖然針對不同細菌要求的抗體效價不同，但找到這一標準無疑有助于對乳房炎疫苗免疫效果的評估和乳房炎的防治，本研究將就此開展進一步的工作。

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