虎杖苷對小鼠急性心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

肖召文，　姜　昕，　付　珺，　馬　晶，　鄭　娜，　劉　杰，　鄒松峰，　董　鳴Δ

1深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理生理學(xué)系，深圳　5180602深圳市人民醫(yī)院老年病科，深圳　5180203武漢市中心醫(yī)院胸外科，武漢　430014

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實(shí)驗(yàn)研究

虎杖苷對小鼠急性心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

肖召文1#，姜昕2#，付珺3#，馬晶1，鄭娜1，劉杰1，鄒松峰1，董鳴1Δ

1深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理生理學(xué)系，深圳5180602深圳市人民醫(yī)院老年病科，深圳5180203武漢市中心醫(yī)院胸外科，武漢430014

摘要：目的探討虎杖苷對小鼠急性心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法結(jié)扎小鼠心臟左前降支，建立急性心肌梗死(AMI)模型，分為缺血組和虎杖苷治療組，另設(shè)正常組和假手術(shù)組。術(shù)后第8天分別檢測在體心電圖和心臟功能；術(shù)后第9天處死各組小鼠行血清肌鈣蛋白-T(Troponin-T)檢測；行TTC染色、Masson’s Trichrome染色等病理組織學(xué)檢測；Western blot檢測小鼠左心室心肌細(xì)胞Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶(ROCK)活性表達(dá)。結(jié)果術(shù)后第8天在體心電圖和超聲心動圖檢測顯示虎杖苷治療組心律失常發(fā)生率和心功能較缺血組有明顯改善；術(shù)后第9天Troponin-T檢測表明虎杖苷治療組血清肌鈣蛋白-T水平明顯低于缺血組；病理組織學(xué)檢測顯示虎杖苷治療組心肌纖維化和凋亡程度較缺血組明顯降低；Western blot檢測提示虎杖苷治療組ROCK活性較缺血組低。結(jié)論虎杖苷可顯著抑制心肌細(xì)胞缺血后纖維化和細(xì)胞凋亡的病理進(jìn)程，并且對急性心肌梗死后的心臟功能有顯著的改善，這種保護(hù)機(jī)制很可能與虎杖苷抑制急性心肌梗死時升高的ROCK活性相關(guān)。

關(guān)鍵詞：虎杖苷；急性心肌梗死；Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)具有突發(fā)性、高發(fā)病率、高致殘率、高致死率等特點(diǎn)，目前尚無任何根治缺血性心肌壞死的藥物和療法。

小G蛋白超家族，尤其是其亞家族成員RhoA及其激酶即Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶(Rho-associated-coiled-coil protein kinase，ROCK)在調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要的作用[1]。已有研究證實(shí)，心肌梗死后RhoA含量及其活性明顯增加，血管緊張素2過度激活導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，同時NOS活性減弱，NO生成減少等，都會影響AMI后心肌收縮和舒張功能?；⒄溶?polydatin，PD)是中藥虎杖的有效活性成分，又名虎杖4號或白藜蘆醇苷，其化學(xué)名為3，4′，5-三羥基芪-3-β-D-單葡萄糖苷(3，4，5-trihydroxystilbene-3-β-mono-D-glucoside)。相關(guān)研究表明，虎杖苷對急性心肌梗死模型心肌有明顯的保護(hù)作用[2]，但其具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探究虎杖苷保護(hù)小鼠心肌缺血模型缺血心肌的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級C57小鼠80只，雄性，6～8周齡，體重18～22 g，由深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)在深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心手術(shù)室進(jìn)行。

1.1.2試劑和儀器1%戊巴比妥鈉溶液、LED冷光源(深圳市雷克曼生物技術(shù)有限公司)、光學(xué)顯微鏡(Leica)、氣管插管針芯(TERUMO)、靜脈置留針套管、肋間撐開器、TOPOTM小動物呼吸機(jī)(Kent Scientific Torrington，CT.06790，USA)、多道生理信號采集處理系統(tǒng)(RM6240BD，成都)、小動物超聲心動圖(Vevo 2100 Imaging System，Canada)?；⒄溶沼蓮V東海王制藥有限公司贈送。一抗pMYPT、MYPT、β-actin和所有二抗均購自Abcam公司(1：1 000)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠AMI模型的建立1%戊巴比妥鈉溶液按每10 g小鼠體重0.08 mL劑量行腹腔注射麻醉。麻醉成功后胸部備皮，氣管插管連接小動物呼吸機(jī)，肢體接通多道生理信號采集處理系統(tǒng)進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)。小鼠仰臥位，75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)域，鋪無菌手術(shù)巾單，自胸骨左緣第4肋間剪開皮膚及皮下組織，鈍性分離肌層。眼科剪在近胸骨處稍剪開3、4肋間肌層，肋間撐開器撐開兩側(cè)肋骨。破開胸膜，推開胸腺，在肺動脈主干和左心耳交界下方輕輕撕開少許心包，輕壓右側(cè)胸廓，充分暴露心臟。以左心耳下緣為標(biāo)志，平左心耳前下角，沿其邊緣尋找冠狀動脈左前降支，以8/0無損傷絲線穿過血管，連同少量心肌一同結(jié)扎，進(jìn)針深度控制在0.1 cm左右，寬度在0.10～0.15 cm，徹底止血，結(jié)扎瞬間可見小鼠左室前壁失去原有光澤呈現(xiàn)暗灰色或白色，同時結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌活動度減弱或消失。結(jié)扎后可見心電圖ST段抬高，持續(xù)記錄心電30 min。逐層關(guān)胸，拔掉氣管插管。術(shù)后仰臥放置、扯出舌頭以防窒息。假手術(shù)組為開胸后在左前降支部位只穿線不結(jié)扎。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組手術(shù)成功率為100%。取手術(shù)成功小鼠40只，隨機(jī)分為2組，每組20只，分別為缺血組和虎杖苷治療組。另取正常小鼠20只為正常組，取20只假手術(shù)小鼠設(shè)假手術(shù)組。虎杖苷治療組術(shù)后第2天開始予虎杖苷40 mg/kg每天灌胃1次，連續(xù)灌胃治療7 d。除虎杖苷治療組外其余各組均以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.2.3心電圖、小動物超聲心動圖測量心功能參數(shù)術(shù)中對各組小鼠分別進(jìn)行心電圖監(jiān)測，以出現(xiàn)典型ST段抬高作為手術(shù)結(jié)扎左前降支成功標(biāo)志。缺血組、虎杖苷治療組、假手術(shù)組和正常組在處死前即術(shù)后第8天分別進(jìn)行心電圖、小動物超聲心動圖測量。

1.2.4血清Troponin-T檢測、TTC染色和Masson’s Trichrome染色檢測術(shù)后第9天處死各組小鼠，提取血清行Troponin-T檢測比較心肌缺血性損傷差異；行TTC染色(氯化三苯基四氮唑染色)比較各組心肌梗死面積及形態(tài)學(xué)差異[3]；行Masson’s Trichrome檢測心肌纖維化差異。

1.2.5Western blot檢測ROCK活性大量前期研究表明，ROCK活性可以通過檢測其下游效應(yīng)蛋白MYPT磷酸化表達(dá)(p-MYPT)來實(shí)現(xiàn)。術(shù)后第9天分別處死小鼠，取左室心肌組織約100 mg，按100 mg/mL加入全蛋白提取液，加入10 μL PMBS，冰上勻漿30 min，4℃12 000 r/min離心30 min，取上清液20 μL BCA測定蛋白濃度。其余上清液加入等量2×上樣緩沖液，于95℃加熱5 min，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室溫孵育2 h，加入一抗，37℃、60 r/min搖動90 min，棄去一抗，用Tris-HCl緩沖液洗滌3次，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，1：1 000)37℃孵育1 h，棄去二抗，再用Tris-HCl緩沖液洗滌3次?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiScope 5300，上海勤翔)顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1心電圖改變

術(shù)后第8天對每組20只小鼠進(jìn)行心電圖(ECG)檢測，結(jié)果顯示缺血組發(fā)生顯著的病理性Q波、T波倒置和ST段抬高等室性心律失常，共17例；虎杖苷治療組發(fā)生室性心律失常10例，且ST段、T波改變較輕，無病理性Q波出現(xiàn)；正常組和假手術(shù)組均未見室性心律失常(圖1)。

缺血組可見明顯ST段抬高(箭頭所示)，而虎杖苷治療組未見明顯ST-T改變圖1　術(shù)后第8天各組心電圖監(jiān)測Fig.1 Electrocardiogram(ECG)monitoring in each group at 8 days after AMI

2.2心功能指標(biāo)的測定

術(shù)后第8天，小動物超聲心動圖測定各組小鼠心功能。與正常組比較缺血組左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和室間隔舒張末厚度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，表明缺血組小鼠心肌均明顯受損；而虎杖苷治療組與缺血組比較LVEF和室間隔舒張末厚度均明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)，提示虎杖苷對缺血心肌有明顯的保護(hù)作用。

2.3血清Troponin-T檢測、TTC染色和Masson’s Trichrome染色檢測結(jié)果

術(shù)后第9天處死各組小鼠。行血清Troponin-T檢測，虎杖苷治療組血清Troponin-T水平明顯低于缺血組(圖2)。TTC染色可見：正常組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)排列正常；缺血組心肌纖維凝固性壞死，出現(xiàn)核碎裂及核消失，肌質(zhì)均質(zhì)紅染呈不規(guī)則粗顆粒狀，心肌毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)輕度水腫可見少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，肌原纖維排列紊亂且呈波浪形，間有不規(guī)則的橫帶；虎杖苷治療組病變有明顯改善、梗死區(qū)域明顯縮小，心肌纖維斷裂和肌間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象較少，充血和水腫等癥狀基本消失，肌纖維組織結(jié)構(gòu)排列趨于正常組。Masson’s Trichrome染色提示梗死區(qū)膠原呈藍(lán)色、正常心肌組織呈紅色、細(xì)胞核呈褐色，缺血組與虎杖苷治療組相比，小鼠心肌呈現(xiàn)大片心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細(xì)胞壞死，且壞死區(qū)域被纖維組織取代(圖3)。

圖2　各組血清中Troponin-T水平比較Fig.2 The expression of Troponin-T in the serum in each treatment group

實(shí)驗(yàn)分組左室舒張末內(nèi)徑(mm)左室收縮末內(nèi)徑(mm)室間隔舒張末厚度(mm)左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF,100%)左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS,100%)正常組3.66±0.652.42±0.421.23±0.1170.65±13.2143.32±5.65缺血組4.56±0.34*3.61±0.54*0.86±0.08*45.23±15.87*18.26±3.65*虎杖苷治療組3.72±0.45#2.76±0.37#0.94±0.16#60.36±16.32#35.98±4.43#假手術(shù)組3.54±0.252.52±0.321.24±0.0971.15±12.7840.54±4.76

與正常組比較，*P<0.05；與缺血組比較，#P<0.05

2.4Western blot檢測p-MYPT蛋白激酶的表達(dá)

Western blot檢測提示，虎杖苷明顯降低了磷酸化的MYPT(p-MYPT)在AMI中的含量，提示虎杖苷治療組ROCK活性降低。各組MYPT總蛋白含量則無變化(圖4)。

3討論

在心腦血管系統(tǒng)，虎杖苷通過改善血液流變學(xué)、抗血栓形成、抗氧化、影響離子通道、調(diào)節(jié)蛋白激酶和一氧化氮(Nitric oxide，NO)等方式發(fā)揮抗心肌缺血/再灌注、保護(hù)心肌、抗缺血性腦損傷、改善學(xué)習(xí)記憶、抗腦出血損傷、抗動脈粥樣硬化等作用[4-7]。王月剛等[8]通過體外心肌細(xì)胞缺血缺氧模型得出虎杖苷對缺血缺氧作用下的心肌有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)蛋白激酶(PKC)的活性來發(fā)揮作用。金春華等[9]用體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞觀察到虎杖苷可以增加心肌的收縮幅度，增強(qiáng)心肌收縮力，其作用大小與臨床上常用的強(qiáng)心藥西地蘭相似。張松濤等[10]通過建立大鼠體外心臟缺血/再灌注(I/R)模型研究虎杖苷對I/R心臟血流動力學(xué)和生化指標(biāo)以及對超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影響，結(jié)果反映出虎杖苷具有明顯的恢復(fù)心臟供血、加強(qiáng)收縮力等功能，能增加機(jī)體清除氧化自由基的能力，通過激發(fā)抗氧化作用，減輕心肌細(xì)胞損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究通過結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，制成心肌缺血梗死模型。實(shí)驗(yàn)表明：虎杖苷能顯著拮抗由冠脈結(jié)扎引起的心律失常(圖1)；能顯著改善缺血心臟的心功能，提高虎杖苷治療組的左室射血分?jǐn)?shù)(表1)。由此可見，虎杖苷具有較強(qiáng)的生物活性，對心肌梗死及其繼發(fā)的心律失常和心肌細(xì)胞纖維化和凋亡起著重要的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制未見報道。

A、B和C分別為正常組、缺血組和虎杖苷治療組心肌組織TTC染色大體觀；D、E和F分別為正常組、缺血組和虎杖苷治療組心肌組織Masson’s Trichrome染色切片圖(×20)圖3　各組心肌大體解剖及組織染色切片圖Fig.3 Gross examination and histological staining of myocardial tissues in each group

圖4　Western blot檢測各組p-MYPT及MYPT的表達(dá)Fig.4 The expression of p-MYPT and MYPT in each group

本研究中，血清Troponin-T檢測提示虎杖苷可明顯降低血清Troponin-T水平，對缺血性心肌起明顯的保護(hù)作用(圖2)。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)虎杖苷在AMI中可明顯抑制心肌細(xì)胞纖維化和凋亡(圖3)。Western blot檢測提示，虎杖苷顯著降低RhoA/ROCK信號通路下游靶蛋白p-MYPT(磷酸化MYPT)在AMI中的活性(圖4)?？梢?，在缺血損傷后，缺血心肌RhoA表達(dá)上調(diào)，ROCK活性增加。而虎杖苷可抑制ROCK活性，從而引起冠脈平滑肌松弛，改善冠脈狹窄區(qū)域心肌血流量，抑制心肌細(xì)胞纖維化和凋亡，緩解心肌細(xì)胞電生理的不均一性從而降低不同類型心律失常的發(fā)生。

綜上所述，虎杖苷極有可能是通過抑制升高的ROCK活性達(dá)到對心肌梗死后心肌的保護(hù)作用。這種抑制，既可能是直接對激酶的抑制也可能是對ROCK上游的抑制，對于其具體作用機(jī)制和靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示。

本研究探討了虎杖苷對心律失常和心肌缺血的保護(hù)作用，初步揭示了虎杖苷對小鼠急性心肌梗死所致心律失常、心肌凋亡和心肌纖維化的保護(hù)作用機(jī)制。提示虎杖苷及其化學(xué)結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物有望成為抗心律失常及抗心肌缺血的潛在藥物，為進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用價值奠定了基礎(chǔ)。

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(2015-08-07收稿)

Polydatin Protects Myocardiocytes from Acute Myocardial Infarction Injury in Mice

Xiao Zhaowen1#，Jiang Xin2#，F(xiàn)u Jun3#etal

1DepartmentofPathophysiology，HealthSciencesCenter，ShenzhenUniversity，Shenzhen518060，China；2DepartmentofGeriatrics，ShenzhenPeople’sHospital，Shenzhen518020，China3DepartmentofThoracicSurgery，WuhanCentralHospital，Wuhan430000，China

AbstractObjectiveTo investigate the protective effect of polydatin against acute myocardial infarction(AMI)and the underlying mechanism.MethodsAMI models were established in C57 mice by ligating the left anterior descending coronary artery.Animals were randomly divided into four groups：normal group(NC group)，AMI group(AMI group)，polydatin treatment group(AMI+PD group)and sham group.Echocardiography and electrocardiogram were performed 8 days after operation.Nine days after the operation the animals were sacrificed for detection of serum Troponin-T levels.Tetrazolium(TTC)staining and Masson’s Trichrome staining were used for detection of pathological changes and Western blot to measure the expression of Rho-associated-coiled-coil protein kinase(ROCK)in myocardiocytes in mouse left ventricule.ResultsEchocardiography and electrocardiogram showed polydatin could significantly improve the incidence of arrhythmia and the cardiac function when compared with AMI group.The expression level of Troponin-T was much lower in AMI+PD group than in AMI group at 9 days after operation.Histopathological examination showed that myocardial fibrosis and apoptosis were significantly reduced in AMI+PD group than that in AMI group.The ROCK activity was significantly lower in AMI+PD group than that in AMI group.ConclusionPolydatin can inhibit the development of fibrosis and apoptosis after myocardial ischemia and significantly improve the cardiac function.The protective mechanism may involve the inhibitory effect of polydatin on the increased activity of ROCK in AMI.

Key wordspolydatin；acute myocardial infarction；Rho-associated-coiled-coil protein kinase

中圖分類號：R541.4

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.012

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202529)；2013年度深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(No.201302032)

#同為第一作者

肖召文，男，1974年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：1337626275@qq.com；姜昕，女，1974年生，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：jiangxinsz@163.com；付珺，男，1979年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，E-mail：007fj@sina.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：dongm@szu.edu.cn