人臍帶間充質干細胞來源外泌體的生物學特性研究*

楊向榮，　丁　娟，　徐正陽，　王　玨，　紀紅梅，　李玉云

1蚌埠醫(yī)學院臨床檢驗診斷學實驗中心，蚌埠　2330302蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，蚌埠　233004 3蚌埠醫(yī)學院醫(yī)學檢驗教研室，蚌埠　233030

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人臍帶間充質干細胞來源外泌體的生物學特性研究*

楊向榮1，丁娟1，徐正陽1，王玨2，紀紅梅1，李玉云3△

1蚌埠醫(yī)學院臨床檢驗診斷學實驗中心，蚌埠2330302蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，蚌埠2330043蚌埠醫(yī)學院醫(yī)學檢驗教研室，蚌埠233030

摘要：目的探討正常人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs)分泌的外泌體(exosomes)的免疫調節(jié)功能及對惡性腫瘤細胞體外增殖的影響。方法采用組織貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs，收集第3～6代hUC-MSCs上清液，使用超速離心法分離純化exosomes；通過電子顯微鏡觀察exosomes形態(tài)并分析其直徑和直徑分布范圍等特征；采用流式細胞儀檢測其表面hUC-MSCs來源的CD44、CD73標志物。將exosomes與正常人外周血單個核細胞共培養(yǎng)，采用MTT檢測exosomes對淋巴細胞增殖的影響，ELISA法檢測上清液中IL-4和INF-γ的分泌量。選擇慢性粒細胞白血病(CML)K562細胞株，加入exosomes共培養(yǎng)，應用MTT法、PI/AnnexinⅤ雙染流式法檢測exosomes對癌細胞體外生長增殖、凋亡的影響。結果組織貼壁法成功分離hUC-MSCs，傳代后呈長梭狀生長。電鏡觀察分離得到的exosomes為橢圓形膜性小囊泡，經統(tǒng)計得出其直徑在6.8～78.1 nm之間，且分布比較集中。流式細胞術測得exosomes高表達黏附分子CD44(54.1%)與干細胞標志物CD73(31.5%)，MTT和ELISA檢測結果表明，不同濃度的exosomes均抑制外周血單個核細胞增殖且抑制細胞因子IL-4和INF-γ的分泌，呈現(xiàn)劑量依賴性。體外實驗表明exosomes對K562細胞株具有抑制增殖、促進凋亡的作用。結論hUC-MSCs來源的exosomes具有免疫調節(jié)作用及抑制K562細胞增殖的作用。

關鍵詞：間充質干細胞；外泌體；免疫調節(jié)；增殖；凋亡

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs)是一類具有多向分化能力和自我更新能力的干細胞[1-2]。它在胚胎時期的第4～12天進入Wharton’s jelly并且活躍至胎兒娩出。因臍帶具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、倫理和法律方面的問題等諸多優(yōu)點，被廣泛用于hUC-MSCs的提取。同時，研究發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs的體外擴增和多向分化能力比其他組織來源的MSCs更強[2-3]。

胞外體(exosomes)是一種由真核細胞分泌到細胞外的、直徑約30～100 nm的膜性小囊泡，含有其來源細胞的胞膜、蛋白質、mRNA和微小RNA(miRNA)等成分，通過與鄰近的細胞膜融合進而將一個細胞的胞內物質傳遞到另一個細胞，從而在不同細胞間進行信息傳遞[4]。以往的實驗證明MSCs具有較好的組織損傷修復、機體免疫調節(jié)及促進新生血管的生長等作用[5]，那么其來源的exosomes可能也同樣具有對淋巴細胞增殖和細胞因子分泌的抑制作用。但是，國內對hUC-MSCs來源的exosomes的研究較少。本課題對hUC-MSCs來源的exosomes進行生物學特性研究，并對其免疫抑制和腫瘤抑制功能加以探索。

1材料與方法

1.1儀器及試劑

胎牛血清、細胞培養(yǎng)液DMEM/F12、青霉素、鏈霉素購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；PBS購自武漢博士德生物技術有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)及植物血凝素(PHA)購自Sigma公司；雙染細胞凋亡檢測試劑盒BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；0.22 μm無菌濾膜購自Salus公司；重水購自美國Cambridge Isotope Laboratories；CD-73 PE、CD-44PE購自BD公司；人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；改良Neubauer細胞計數(shù)板購自南京裕安公司；CX-201超凈工作臺(蚌埠凈化設備廠)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；ChemiDocXRS成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；FEI Tecnai 12型透射電子顯微鏡購自Philips公司；IL-4和INF-γ ELISA檢測試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)

無菌取足月剖宮產胎兒臍帶，在超凈臺內用含有雙抗的PBS清洗臍帶3遍，洗去殘存血液，剔除臍帶動、靜脈和外包膜并將其剪碎至1 mm3大小，均勻接種于一次性培養(yǎng)瓶中，使用含10%FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)液置飽和濕度的37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每隔3天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)約10 d左右即有成纖維狀細胞從組織中爬出，待細胞長至80%融合時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取生長良好的P3～P6代細胞進行實驗。

1.3hUC-MSCs來源的exosomes的提取

將生長良好的P3～P5代hUC-MSCs在37℃、5%CO2的條件下使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h收集上清液。采用超速離心法，將培養(yǎng)上清液在4℃下300 g離心20 min去除死細胞，取上清液，于4℃條件下16 500 g離心20 min以去除細胞碎片及蛋白顆粒，將上清用0.22 μm濾膜除菌后，于4℃條件下120 000 g離心70 min，棄去上清，將得到的exosomes沉淀重懸于PBS中。以BCA法檢測其蛋白濃度，調整其蛋白濃度為1 g/L，于4℃保存1周或于-80℃冰箱中長期保存。

1.4電鏡觀察細胞形態(tài)

取20 μL exosomes懸液滴于載樣銅網光面上，室溫條件下靜置1 min，用濾紙從一側吸干液體，滴加20 g/L的磷鎢酸約20 μL于載樣銅網上，室溫負染1 min后濾紙吸干負染液，于白熾燈下烘烤約10 min，透射電鏡下觀察并拍照保存。

1.5流式細胞術檢測exosomes表面標志

將分離純化后的hUC-MSCs來源的exosomes與PE標記的鼠抗人CD73、CD44抗體室溫避光孵育30 min，用PBS洗滌1遍后，用1%的多聚甲醛重懸，上流式細胞儀檢測分析。

1.6MTT法檢測hUC-MSCs來源的exosomes對淋巴細胞增殖的影響

取健康志愿者外周血10 mL，使用Ficoll分離液分離外周血單個核細胞，經計數(shù)后用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞密度為1×106/mL備用。按每孔加入100 μL細胞懸液種于96孔板，然后加入終濃度為20 μg/mL的PHA(植物血凝素)以刺激淋巴細胞增殖。加入exosomes的劑量終濃度為1、10、50、100 μg/mL，以不加exosomes的孔作為陰性對照，另外以100 μL的PBS作為空白對照，每組均設3個復孔進行實驗。于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)72 h后每孔加入5 g/L MTT試劑20 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心后吸棄上清，然后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結晶顆粒完全溶解，酶標儀測定490 nm處吸光度(A)值，以對照組A值為100%得出各組相對抑制率。

1.7 ELISA檢測exosomes對細胞因子分泌量的影響

收集上述5組陽性對照及exosomes和淋巴細胞培養(yǎng)的上清液，ELISA檢測其中的IL-4和INF-γ的含量。具體操作方法參照IL-4和INF-γ試劑盒說明書。

1.8 hUC-MSCs來源的exosomes對K562細胞增殖、凋亡的影響

1.8.1 MTT法檢測增殖抑制作用慢性粒細胞白血病(CML)細胞株K562細胞采用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，調整細胞密度，以每孔加入100 μL細胞懸液(3 000～5 000個細胞)種于96孔板。加入exosomes的劑量終濃度為2.5、12.5、25、50 μg/mL，以不加exosomes的孔作為陰性對照，每組均設3個復孔進行實驗。置于37℃、5%CO2的條件下72 h后每孔加入5 g/L MTT試劑20 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后吸棄上清，然后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min，使結晶顆粒完全溶解，酶標儀測定490 nm處吸光度(A)值。

1.8.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率根據MTT結果，選取25 μg/mL exosomes濃度為實驗組濃度，進行凋亡分析。以每孔加入2 mL細胞懸液(40 000個細胞)種于6孔板，分實驗組與對照組兩組，加入exosomes后培養(yǎng)72 h，收集所有細胞至離心管中，2 000 r/min離心5 min，小心吸棄上清，再用預冷PBS清洗2次，離心沉淀，去上清，加入500 μL Binding Buffer使細胞懸浮，然后再加入Annexin Ⅴ-FITC及PI染液各5 μL，混勻。留出空白對照組和單染對照組，室溫避光孵育10 min，流式上機檢測。

1.9統(tǒng)計學處理

2結果

2.1hUC-MSCs的原代培養(yǎng)及形態(tài)觀察

采用組織貼壁法原代培養(yǎng)hUC-MSCs約10 d左右，低倍鏡下即可觀察到形似成纖維樣細胞從組織塊中爬出，貼壁細胞的形態(tài)為多角形或梭形，培養(yǎng)約2～3周至細胞融合達到80%即可消化傳代，細胞消化傳代后呈魚群樣、長梭狀生長(圖1)。

A：組織貼壁法培養(yǎng)10 d后，成纖維樣細胞從組織塊中爬出；B：傳代培養(yǎng)hUC-MSCs呈單個長梭形圖1　hUC-MSCs的生長形態(tài)(×40)Fig.1 The morphology of hUC-MSCs(×40)

2.2hUC-MSCs來源的exosomes的形態(tài)觀察

透射電子顯微鏡觀察顯示，hUC-MSCs來源的exosomes呈圓形或橢圓形的膜性小囊泡，大小不一，直徑為6.8～78.1 nm，腔內顯示低電子密度成分(圖2)。

圖2　透射電鏡觀察hUC-MSCs來源的exosomes形態(tài)Fig.2 The morphology of hUC-MSCs-derived exosomes observed by transmission electron microscopy

2.3統(tǒng)計軟件分析exosomes半徑、直徑分布范圍

通過測量電鏡圖片中236個exosomes顆粒的直徑顯示，hUC-MSCs來源exosomes的直徑分布在6.8～78.1 nm的區(qū)間內，直徑25%分位數(shù)為13.5 nm，直徑75%分位數(shù)為18.7 nm，直徑中位數(shù)為16.1 nm，直徑平均數(shù)17.7 nm，標準誤差為9.5。同時也證明，分步離心結合超速離心的方法，對分離提hUC-MSCs來源exosomes具有較為理想的效果。見圖3。

2.4流式細胞術檢測exosomes表面標志

如圖4流式細胞儀檢測結果顯示hUC-MSCs來源的exosomes高表達粘附分子CD44(54.1%)和干細胞標志物CD73(31.5%)。

圖3　臍帶間充質干細胞來源exosomes的直徑(nm)區(qū)間分布統(tǒng)計圖Fig.3 Diameter distribution map of hUC-MSCs derivedexosomes(nm)

圖4　exosomes的免疫表型Fig.4 The immunophenotype of exosomes

2.5hUC-MSCs來源的exosomes對淋巴細胞增殖的影響

不同濃度的hUC-MSCs來源的exosomes與經PHA刺激的淋巴細胞共培養(yǎng)3 d后，MTT法檢測exosomes對淋巴細胞增殖的影響，如圖5所示，不同濃度的exosomes均抑制外周血淋巴細胞的增殖，隨著濃度的增加，抑制作用明顯，顯示劑量依賴性。

與對照組比較，*P<0.05圖5　不同濃度exosomes對淋巴細胞增殖的影響Fig.5 The effects of different concentrations of exosomes on lymphocyte proliferation

2.6ELISA法檢測exosomes對淋巴細胞分泌功能的影響

實驗結果顯示，經PHA刺激過后的淋巴細胞分泌IL-4達到(139.14±13.96)pg/mL，而加入終濃度為100 μg/mL exosomes后IL-4的濃度為(7.37±0.46)pg/mL。結果顯示hUC-MSCs來源的exosomes可以顯著降低外周血淋巴細胞分泌IL-4(P<0.01，n=3)。另外，未加入exosomes的經PHA刺激的淋巴細胞培養(yǎng)3 d后IFN-γ的濃度為(3 832.67±756.61)pg/mL，當加入終濃度為100 μg/mL的exosomes后IFN-γ的濃度為(269.00±7.66)pg/mL(P<0.01，n=3)。這些結果顯示，hUC-MSCs來源的exosomes具有抑制外周血淋巴細胞分泌IL-4和INF-γ的免疫功能，且具有劑量依賴性。見表1。

2.7 hUC-MSCs來源的exosomes對K562細胞株體外增殖、凋亡的影響

2.7.1增殖抑制作用不同濃度的hUC-MSCs來源的exosomes與K562細胞株體外共培養(yǎng)3 d后，MTT法檢測exosomes對其增殖的影響，如圖6所示，不同濃度的exosomes均抑制細胞的增殖，隨著濃度的增加，抑制作用明顯。

表1不同濃度exosomes對淋巴細胞分泌IL-4和

Table 1The effects of different concentrations of exosomes

組別IL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)對照組139.14±13.963832.67±756.611μg/mL87.65±10.96**2605.33±684.3110μg/mL18.72±7.60**1156.33±557.14**50μg/mL14.49±1.78**441.33±139.84**100μg/mL7.37±0.46**269.00±7.66**

與對照組比較，**P<0.01

與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖6　不同濃度的exosomes對K562細胞增殖的影響Fig.6 The effects of different concentrations of exosomes on K562 cells proliferation

2.7.2促凋亡作用hUC-MSCs來源的exosomes與K562細胞株體外共培養(yǎng)3 d后，流式上機檢測exosomes對其凋亡的影響，如圖7所示，exosomes具有促進K562細胞凋亡的作用，實驗組的早期凋亡率(Q3：7.55%)、晚期凋亡率(Q2：5.09%)以及總凋亡率(Q2+Q3：12.64%)均高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義。

圖7　間充質干細胞來源exosomes對K562細胞凋亡的影響Fig.7 The effects of hUC-MSCs-derived exosomes on K562 cells apoptosis

3討論

人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)因來源和功能上的多重優(yōu)勢而成為干細胞研究中的熱點。我們的前期研究顯示，hUC-MSCs可以影響淋巴細胞和其他免疫細胞的功能，與淋巴細胞共培養(yǎng)時可以抑制其增殖[6-7]，并能降低淋巴細胞的分泌功能，這種作用可能同樣存在于來源于其的exosomes上。

Exosomes是真核細胞內多泡體與來源細胞膜融合后分泌到細胞外的膜性小囊泡，直徑約30～100 nm，含有來源細胞的脂類、蛋白及微小RNA等成分[8]，在細胞間信息傳遞發(fā)揮著重要作用[9]。Exosomes的功能取決于其來源細胞，如腫瘤細胞來源的exosomes可以攜帶相應的腫瘤抗原，具有抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用[10]。

本實驗采用超速離心法[11]成功分離純化hUC-MSCs來源的exosomes，進行了形態(tài)學的觀察和流式細胞學的檢測，透射電子顯微鏡觀察顯示，hUC-MSCs來源的exosomes呈圓形或橢圓形的膜性小囊泡，大小不一，直徑為20～100 nm，腔內顯示低電子密度成分，流式細胞儀檢測結果顯示hUC-MSCs來源的exosomes高表達黏附分子CD44和干細胞標志物CD73，與其來源細胞hUC-MSCs的細胞表面標志相似。研究發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs來源的exosomes具有抑制細胞免疫反應的作用，這在腫瘤逃逸和誘導免疫耐受方面必定起一定的作用。以往研究表明，exosomes免疫抑制的機制可能包括：① Fasl陽性的exosomes能誘導T細胞的凋亡，而抗-Fasl能夠阻斷T細胞凋亡，這可能是一種由于膜結合的免疫抑制分子介導的免疫抑制作用[12]。②帶有NKG2D配體的exosomes能夠通過下調NK細胞上的NKG2D受體的表達量而起到免疫抑制的作用[13]。但免疫抑制作用具體的機制還有待進一步研究。

本實驗采用MTT法檢測不同濃度的hUC-MSCs來源的exosomes與經PHA刺激的淋巴細胞共培養(yǎng)體系中exosomes對淋巴細胞增殖的影響，結果顯示不同濃度的exosomes均抑制外周血淋巴細胞的增殖，且具有劑量依賴性。所以我們認為hUC-MSCs來源的exosomes在體外環(huán)境中可能抑制T細胞的增殖和誘導T細胞的凋亡，從而發(fā)揮其具有hUC-MSCs相似的免疫抑制作用。為了進一步探明hUC-MSCs來源的exosomes對外周血淋巴細胞免疫功能的影響，我們采用ELISA法進一步檢測不同濃度的exosomes與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)3 d后上清液細胞因子的水平，結果表明共培養(yǎng)上清液中IL-4和INF-γ的濃度較對照組明顯降低，同樣具有劑量依賴性，說明hUC-MSCs來源的exosomes還能通過抑制Th細胞的功能，從而下調T淋巴細胞的免疫功能，對機體的免疫反應起著抑制作用。這也驗證了hUC-MSCs來源的exosomes在抑制宿主抗移植物排斥反應，減輕局部的炎癥反應，延長受體的術后生存時間方面具有重要意義[14]。

一系列研究表明，exosomes發(fā)揮其功能主要有3種機制，第一種是依賴膜表面信號分子的信息轉運[15]。這種依賴于膜表面的信號分子的方式常見于免疫系統(tǒng)中。另一種是依賴于膜融合后的內容物釋放發(fā)揮功能，當exosomes與細胞膜融合后，其內容物釋放到細胞內發(fā)揮作用[16-17]。除了上述兩種方式外，exosomes還可以通過釋放內部的信號分子作用于細胞膜表面的受體，發(fā)揮其功能。本實驗結果顯示，hUC-MSCs來源的exosomes具有抑制K562細胞生長、促進其凋亡的作用，這可能與多種機制共同作用有關，具體作用方式尚待進一步探究。有研究結果表明MSC能保存腫瘤細胞的自我更新能力，影響惡性疾病的進程。臨床上對惡性腫瘤患者大劑量應用MSC治療方案可能會因此而造成腫瘤壁龕的形成[18]。但間充質干細胞來源的外體可能能夠避免這種狀況的發(fā)生。這對于研究腫瘤細胞在體內的增殖與遷移過程中間充質干細胞等基質細胞的作用也提供了重要的實驗依據。

本實驗所用的hUC-MSCs來源的exosomes表現(xiàn)出抑制外周血淋巴細胞的增殖，同時也降低了其分泌細胞因子IL-4和INF-γ的水平，還能抑制血液系統(tǒng)腫瘤細胞的生長，促進其凋亡，說明其具有多種方式的免疫抑制作用和抑瘤作用，然而具體機制和應用還需要進一步的探索。從某種意義上說，細胞分泌exosomes可以看作是機體的另一種調節(jié)方式。目前，exosomes的研究逐步應用于臨床，但是還有許多問題需要解決，如需要進一步實驗證明exosomes應用于臨床的安全性，明確exosomes中各種物質的成分及作用機制，如何快速獲得純度較高的exosomes，以及臨床使用的劑量等問題。但是，隨著對exosomes研究的深入，hUC-MSCs來源的exosomes可能會成為臨床治療的一顆“新星”，對“無細胞”干細胞治療提供新的思路。

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(2015-09-29收稿)

Biological Characteristics of Exosomes Secreted by Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stromal Cells

Yang Xiangrong，Ding Juan，Xu Zhengyangetal

ClinicalLaboratoryandDiagnosticCenterofBengbuMedicalCollege，Bengbu233030，China

AbstractObjectiveTo investigate the immune-regulatory function of exosomes secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)and their effect on in vitro proliferation of tumor cells.MethodshUC-MSCs were isolated by tissue adhesion method and cultured.The supernatants of hUC-MSCs at 3rd，4th，5th and 6th passage were harvested for isolation and purification of exosomes by using ultracentrifugation.The electron microscopy was used to observe the morphology of exosomes and analyze their features such as the diameters of exosomes and the diameter distribution range.The immunophenotype of CD44 and CD73 on hUC-MSCs was detected by flow cytometry.Additionally，the exosomes were cultured with peripheral blood lymphocytes and their effect on lymphocyte proliferation was measured by MTT assay.The production of IL-4 and INF-γ from the co-culture system was detected by ELISA.Chronic granulocytic leukemia cells K562 were treated with exosomes for 72 h，and then the effects of exosomes on tumor proliferation and apoptosis were assessed by MTT and Annexin Ⅴ-FITC/PI.ResultshUC-MSCs were successfully separated from tissues by tissue adhesion method and they grew spindle-shaped after passage.The electron microscopy revealed that the exosomes were elliptical membrane vesicles with their diameter at 6.8-78.1 nm，and their distribution was in a concentrated manner.Flow cytometry showed high expression of the adhesion molecule CD44(54.1%)and the stem cell marker CD73(31.5%)on hUC-MSCs.MTT and ELISA showed that exosomes at different concentrations could inhibit the proliferation of peripheral blood lymphocytes and the secretion of cytokines IL-4 and INF-γ and the effect was in a dose-dependent manner.Furthermore，in vitro experiments showed that exosomes from hUC-MSCs could suppress the growth of tumor cells and promote their apoptosis.ConclusionhUC-MSC-derived exosomes have immune-regulatory functions and they can inhibit the proliferation of K562 cells.

Key wordsmesenchymal stem cells；exosomes；immunomodulatory；proliferation；apoptosis

中圖分類號：R329

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.008

*蚌埠醫(yī)學院研究生科研創(chuàng)新計劃(No.Byycx1409)；安徽省大學生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項目(No.AH201410367024)

楊向榮，女，1989年生，碩士研究生，E-mail：996929735@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：bbmcyxr@sina.com