金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素CYP6家族基因的克隆及表達(dá)

田　甜，李　鑫，郭長(zhǎng)寧，侯　茜，王冠華，于建光

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素CYP6家族基因的克隆及表達(dá)

田甜，李鑫，郭長(zhǎng)寧，侯茜，王冠華，于建光

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 克隆并鑒定金紋細(xì)蛾(Phyllonorycter ringoniella)細(xì)胞色素CYP6家族基因，并觀察氯氟氰菊酯藥劑處理后mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，為金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素CYP6家族基因全長(zhǎng)cDNA的獲得，以及防止或延緩金紋細(xì)蛾抗藥性的產(chǎn)生提供理論依據(jù)?！痉椒ā?以GenBank上公布的CYP6家族基因編碼區(qū)序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并合成簡(jiǎn)并引物；利用RT-PCR擴(kuò)增獲得序列后在NCBI上進(jìn)行Blastx對(duì)比，根據(jù)P450基因命名法進(jìn)行命名并向GenBank提交序列獲得登錄號(hào)；利用點(diǎn)滴法和qRT-PCR技術(shù)，將金紋細(xì)蛾3齡幼蟲在氯氟氰菊酯(LC50=12.88 mg/L)條件下處理24 h后，觀察其體內(nèi)細(xì)胞色素P450基因的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】 成功擴(kuò)增出3個(gè)長(zhǎng)度分別為415，412和421 bp的cDNA片段。同源性分析表明，3條基因序列與CYP6AN5、CYP6B5和CYP6ab氨基酸相似性分別達(dá)61%，59%和71%，可將其初步均歸類為CYP6家族，并分別命名為phCYP6AN5、phCYP6B5和phCYP6ab，將序列信息提交至GenBank，獲得GenBank登錄號(hào)分別為KJ559411、KJ559412和KJ559413。藥劑處理對(duì)3種基因發(fā)生了不同的誘導(dǎo)或抑制作用，phCYP6AN5基因在受到藥劑處理后相對(duì)表達(dá)量顯著上升，而phCYP6B5和phCYP6ab在受到藥劑處理后相對(duì)表達(dá)量顯著下降?！窘Y(jié)論】 成功獲得3條金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素CYP6家族基因片段；誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)作用存在一定程度的特異性，對(duì)某種或幾種P450酶有效應(yīng)的化合物并不一定誘導(dǎo)其他類型的P450。

[關(guān)鍵詞]金紋細(xì)蛾；細(xì)胞色素P450；序列分析；基因表達(dá)

P450為一基因超家族，由多個(gè)基因家族組成,每個(gè)基因家族又包含若干個(gè)基因亞家族。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，昆蟲P450基因不斷被分離、克隆并體外表達(dá)，其結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)的調(diào)控及與昆蟲抗藥性關(guān)系的研究也不斷深入[1]。細(xì)胞色素P450是昆蟲體內(nèi)參與各類殺蟲劑及其他外源性和內(nèi)源性化合物代謝的主要解毒酶系——多功能氧化酶系的末端氧化酶，其可與底物結(jié)合，從NADPH傳遞電子到NAD-PH細(xì)胞色素P450還原酶[2]。

金紋細(xì)蛾(Phyllonorycterringoniella)是蘋果樹(shù)上一種常見(jiàn)的潛葉性害蟲，是東亞特有種。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，金紋細(xì)蛾的危害在我國(guó)日漸嚴(yán)重，已成為果園的主要害蟲之一。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于金紋細(xì)蛾的研究主要集中在田間發(fā)生規(guī)律、越冬蛹保存及其寄生蜂等方面[3-4]，而有關(guān)其分子生物學(xué)方面的研究卻鮮有報(bào)道。

細(xì)胞色素P450與昆蟲的抗藥性關(guān)系密切[5-6]，但目前有關(guān)細(xì)胞色素P450基因的克隆及其解毒作用的研究主要集中于家蠅、果蠅、棉鈴蟲上[7]。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素P450基因片段，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞色素P450基因在氯氟氰菊酯脅迫處理后的表達(dá)，為金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)的獲得，以及防止或延緩金紋細(xì)蛾抗藥性的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試蟲源

供試蟲源來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室。金紋細(xì)蛾蟲疤葉采自陜西洛川果園，解剖蟲疤葉，將得到的蛹置于4 ℃冰箱保存。翌年4月，將蛹接種到蘋果樹(shù)上，在西北農(nóng)林科技大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光周期為16L/8D，相對(duì)濕度為(70±10)%。7月收集健康蟲源進(jìn)行試驗(yàn)。

抗藥試驗(yàn)蟲源處理參照毛細(xì)管點(diǎn)滴法[8]。首先在雙筒解剖鏡下挑取正在取食活動(dòng)的3齡幼蟲帶葉供試。將氯氟氰菊酯用丙酮稀釋后，用毛細(xì)管點(diǎn)滴器點(diǎn)滴處理幼蟲腹部后半部分的背面，并在點(diǎn)滴前先揭去這部分的外葉膜，以丙酮點(diǎn)滴處理為對(duì)照。毛細(xì)管點(diǎn)滴器容積為0.050～0.067 μL，每處理30頭，3個(gè)重復(fù)。處理后將試蟲放人培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，并置于恒溫室((25±2) ℃)中，24 h后鏡檢死亡率。

1.2主要試劑

上海生工生物公司的UNIQ-10柱式Trizol 總RNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒；Thermo公司的RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit；康為世紀(jì)的DM 2000 DNA Marker、瓊脂糖、2×ES Master mixTaq酶、UltraSYBR Mixture。本試驗(yàn)所用的PCR引物均由上海生工生物公司合成。

1.3P450基因克隆及mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

1.3.1引物設(shè)計(jì)本試驗(yàn)所用到的引物均使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。phA、phB和phC為根據(jù)P450基因保守序列設(shè)計(jì)的3對(duì)簡(jiǎn)并引物，預(yù)期cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為400 bp左右。phCYP6AN5-R和phCYP6AN5-F、phCYP6B5-R和phCYP6B5-F、phCYP6ab-R和phCYP6ab-F、β-actin-R 和β-actin-F為基因特異性引物，分別用于qRT-PCR分析。

1.3.2總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄1)滅菌和無(wú)菌處理。將試驗(yàn)器具用1/1 000 DEPC水浸泡24 h，在120 ℃、0.1 MPa下高溫滅菌20 min，之后置于烘箱內(nèi)60 ℃處理至干燥備用。

2)總RNA的提取。取30頭3齡中期金紋細(xì)蛾幼蟲快速放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中并快速向研缽中加入液氮。先緩緩研磨，待液氮揮發(fā)殆盡時(shí)加速研磨，如此反復(fù)2～3次，直至樣品完全變成白色粉末。將白色粉末用小勺小心移至盛有500 μL Trizol試劑的1.5 mL無(wú)菌離心管中，輕微振蕩混勻后室溫放置10 min。之后12 000 r/min、 4 ℃離心10 min。將上清液用移液槍移至另一新的1.5 mL離心管中，加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min。將上清液用移液槍移至另一新的1.5 mL離心管中，加入1/2倍上清液體積的無(wú)水乙醇，輕微顛倒混勻。同時(shí)將吸附柱放入收集管中，用移液槍將溶液全部加至吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min 室溫離心3 min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱放回收集管中，加入500 μL RPE Solution，靜置2 min，10 000 r/min 室溫離心30 s，倒掉收集管中廢液。重復(fù)該步驟一次。將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min 室溫空離心2 min，去除殘余的乙醇。將吸附柱放入另一干凈的1.5 mL 離心管中，在吸附膜中央懸空加入30 μL DEPC-treated ddH2O，靜置5 min，12 000 r/min 室溫離心2 min，將所得到的RNA溶液置于-70 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

3)第1鏈合成。在冰浴的無(wú)核酸酶的PCR管中加入2 μg總RNA，2 μL Oligo (dT)15，2 μL(2.5 mmol/L)dNTP，再加RNA-free ddH2O至14.5 μL，將上述溶液于PCR儀中70 ℃溫浴5 min后迅速在冰上冷卻2 min。然后12 000 r/min 室溫離心1 min，按順序加入以下組分：4 μL 5×Firstand Buffer(含DTT)，0.5 μL Rnasin，1 μL(200 U)TIANScript M-MLV，用移液槍輕輕混勻。然后于PCR儀中42 ℃溫浴50 min，之后加熱至95 ℃終止反應(yīng)。加入RNA-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋至50 μL，所得cDNA模板于-20 ℃保存待用。

表 1　本研究中所用引物

1.3.3RT-PCR的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(25 μL):12.5 μL 2×ES Master mixTaq酶，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL 下游引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA模板，9.5 μL RNase-free water。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 30 s,45 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：均用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳條件：100 V，40 min。電泳結(jié)束后用EB染色并照相觀察。

1.3.4基因克隆與測(cè)序基因克隆采用上海生工生物公司的克隆試劑盒。將已純化的3對(duì)引物的PCR產(chǎn)物分別連接到pUCm-T載體后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞。根據(jù)藍(lán)白斑篩選原理，選擇白色菌落,用LB液體培養(yǎng)后選擇其菌液抽提質(zhì)粒DNA。3組產(chǎn)物每組挑取5個(gè)單克隆送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastx比對(duì)，進(jìn)行序列鑒定。

1.3.5實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增和定量方法qRT-PCR反應(yīng)體系為(25 μL)：12.5 μL 2×UltraSYBR Mixture，1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，9.5 μL RNase-free water。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，50個(gè)循環(huán)；熔解步驟：65 ℃開(kāi)始收集信號(hào)，每10 s升高0.5 ℃，到95 ℃結(jié)束。定量方法采用比較CT相對(duì)定量法[9]。該方法在假設(shè)目標(biāo)基因片段和持家基因片段擴(kuò)增效率一致的情況下，cDNA表達(dá)量為2-ΔΔCT(ΔCT=CT目標(biāo)基因-CT持家基因，ΔΔCT=ΔCT樣品-ΔCT參照物)。本研究采用組成性表達(dá)延伸因子β-actin作為內(nèi)參基因。

1.4數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)通過(guò)BIO-RAD IQ5熒光定量讀取數(shù)據(jù)，采用比較CT相對(duì)定量法[9]作為基因表達(dá)的相對(duì)指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件中單因素方差分析，進(jìn)行Duncan多重比較，通過(guò)OriginProPorable 8.5軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1金紋細(xì)蛾CYP6AN5、CYP6B5和CYP6ab基因的克隆及序列分析

2.1.1總RNA的提取與檢測(cè)以金紋細(xì)蛾幼蟲提取的總RNA檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，經(jīng)NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260/A280均在 1.8～2.0，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)以金紋細(xì)蛾總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，3條序列長(zhǎng)度分別為415，412和421 bp(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖 1金紋細(xì)蛾總RNA提取結(jié)果

1,2.提取的總RNA；M.DNA Marker DL2000

Fig.1Total RNA fromPhyllonorycterringoniella

1,2.Extraction of total RNA;M.DNA Marker DL2000

圖 2RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

1～3.不同引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DNA Marker DL2000

Fig.2Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

1-3.Amplified fragments of different primers;

M.DNA Marker DL2000

2.1.3序列鑒定與分析測(cè)序所得的3條序列片段經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastx比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果顯示：所克隆的基因片段全部屬于P450基因超家族，按照P450基因的命名法則[10]，可將其初步均歸類為CYP6家族，并分別命名為phCYP6AN5、phCYP6B5和phCYP6ab，將序列信息提交至GenBank，獲得GenBank登錄號(hào)分別為KJ559411、KJ559412和KJ559413。

表 2　所得3條金紋細(xì)蛾P(guān)450序列的最佳匹配

表3中9條氨基酸序列與所得的3條氨基酸序列進(jìn)行的同源性比對(duì)結(jié)果如圖3所示。

表 3　不同物種9個(gè)P450基因片段的最佳匹配

由圖3可知，這12條序列上游均含有對(duì)應(yīng)引物的AGFETSST(殘基1-8)區(qū)域，下游均含有對(duì)應(yīng)引物的P(F/L)GEGPR(殘基135-141)區(qū)域，氨基酸序列中部還含有P450蛋白的特征區(qū)域ExxR(殘基69-72)和PERF(殘基116-119)。

圖 3金紋細(xì)蛾CYP6氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

上游均含有對(duì)應(yīng)引物的AGFETSST(殘基1-8)區(qū)域，下游均含有對(duì)應(yīng)引物的P(F/L)GEGPR(殘基135-141)區(qū)域，

氨基酸序列中部還含有P450蛋白的特征區(qū)域ExxR(殘基69-72)和PERF(殘基116-119)。Ⅰ～Ⅲ和A1～A9代表的序列同表2和表3

Fig.3Comparison of acid sequences betweenPhyllonorycterringoniellaand other species

Upstream contains the corresponding primer AGFETSST (residues 1-8),downstream contains corresponding primer P(F/L)

GEGPR(residues 135-141),central amino acid sequence contains P450 protein characteristic regions ExxR (residues 69-72) and

PERF (residues 116-119).The suquenle of Ⅰ-Ⅲ and A1-A9 are the same with table 2 and 3

2.2藥劑處理后金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的變化

2.2.1PCR產(chǎn)物熔解曲線及熒光定量PCR擴(kuò)增效率的一致性研究采用熒光染料SYBR GreenⅠ作為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的熒光化學(xué)物質(zhì)，由于它可以與任何雙鏈DNA(如引物二聚體或非特異目標(biāo)產(chǎn)物)結(jié)合，易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)[11]。因此，必須利用熔解曲線觀察產(chǎn)物的生成情況，確認(rèn)檢測(cè)基因所用引物的特異性。本試驗(yàn)中所比較的3個(gè)P450基因和1個(gè)持家基因(β-actin)的熔解曲線都只有1個(gè)峰，表明其擴(kuò)增產(chǎn)物只有1個(gè)。用cDNA系列稀釋液測(cè)定這4個(gè)基因的熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)目標(biāo)基因與持家基因擴(kuò)增效率的一致性，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率一致，表明這3個(gè)P450基因的擴(kuò)增效率是一致的，因此可以采用比較CT相對(duì)定量法(即2-ΔΔCT法)進(jìn)行基因表達(dá)量的比較。

2.2.2細(xì)胞色素P450基因相對(duì)表達(dá)量的比較金紋細(xì)蛾3齡幼蟲在氯氟氰菊酯LC50=12.88 mg/L條件下處理24 h后，其體內(nèi)細(xì)胞色素P450基因的相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。由圖5可見(jiàn)，細(xì)胞色素P450基因在未受到藥劑處理和受到藥劑處理?xiàng)l件下均有表達(dá)。phCYP6AN5基因在受到藥劑處理后相對(duì)表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明該藥劑在LC50=12.88 mg/L條件下處理24 h后對(duì)phCYP6AN5基因起到一定誘導(dǎo)作用，而phCYP6B5和phCYP6ab在受到藥劑處理后的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明該藥劑處理24 h后，對(duì)這2個(gè)基因產(chǎn)生了抑制作用，并且前者大于后者。

圖 4金紋細(xì)蛾phCYP6AN5、phCYP6B5和phCYP6ab和

β-actin基因?qū)崟r(shí)定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4Standard curves ofphCYP6AN5,phCYP6B5,and

phCYP6abofPhyllonorycterringoniellaand

β-actinby real-time PCR amplification

圖 5金紋細(xì)蛾3齡幼蟲細(xì)胞色素P450基因的

相對(duì)表達(dá)情況

*表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)

Fig.5Relative expression of cytochrome P450 genes of

Phyllonorycterringoniella3rd larvae exposed

Compared with blank control,* indicates significant

difference(P<0.05)

3討論

本研究利用RT-PCT技術(shù)克隆得到3條金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素P450 CYP6家族基因序列，同源性分析表明，3條基因序列與CYP6AN5、CYP6B5和CYP6ab氨基酸相似性分別為61%,59%和71%。

從第一個(gè)昆蟲CYP6家族基因CYP6A1被分離鑒定，迄今為止，已有大量研究證明CYP6家族與昆蟲的抗性密切相關(guān)。而這一特性與CYP6家族成員的作用底物密不可分。例如，家蠅(Muscadomestica) CYP6A1的誘導(dǎo)物為苯巴比妥和胡椒基丁醚[2]；CYP6A2和CYP6D1的作用底物為苯巴比妥和吡蟲啉[12]；CYP6A8和CYP6A9的誘導(dǎo)底物為巴比妥[13]；黑鳳蝶(Papilioprotenor) CYP6B1和CYP6B3的誘導(dǎo)物為花椒毒素[14]；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera) CYP6B2的誘導(dǎo)物則為薄荷油[15]。不同種類的誘導(dǎo)底物使得這些CYP6家族成員可以介導(dǎo)多種外源有害化合物的代謝。于是，對(duì)昆蟲抗性的重視也使得CYP6家族成為過(guò)去幾十年昆蟲P450s研究的重點(diǎn)。本研究對(duì)金紋細(xì)蛾細(xì)胞色素CYP6家族基因進(jìn)行克隆與分析，從而為后續(xù)對(duì)其抗性研究提供依據(jù)。

誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)作用存在一定程度的特異性，對(duì)某種或幾種P450酶有效應(yīng)的化合物并不一定誘導(dǎo)其他類型的P450。例如，家蠅CYP6A1 mRNA和CYP6D1編碼的蛋白P450LPR均可被苯巴比妥(PB)和增效醚(pbo)誘導(dǎo)，但均不被萘、環(huán)戊二烯類(如狄氏劑或艾氏劑)、DDT誘導(dǎo)，而乙醇僅能誘導(dǎo)CYP6A1[16]。在黑鳳碟(Papiliopolyxenes)中，CYP6B1只能被線性呋喃香豆素所誘導(dǎo)，而CYP6B3也可以被角型的呋喃香豆素誘導(dǎo)[17]。另外，同一誘導(dǎo)劑也可能同時(shí)對(duì)多種酶產(chǎn)生誘導(dǎo)，表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)的重疊性。例如北美黑尾鳳碟(Paliopolyxene)CYP6B1基因mRNA的誘導(dǎo)劑黃原毒素(xanthotoxin)[17]，也可誘導(dǎo)P450LPR[16]。

本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在LC50=12.88 mg/L的氯氟氰菊酯誘導(dǎo)處理24 h后，金紋細(xì)蛾體內(nèi)不同細(xì)胞色素P450基因的相對(duì)表達(dá)量不同，可能是因?yàn)槁确杈挣ツ撤N成分與這3種細(xì)胞色素P450基因的某些作用位點(diǎn)發(fā)生了結(jié)合，抑制或促進(jìn)了相關(guān)基因的表達(dá)。至于細(xì)胞色素P450基因之間的具體功能和調(diào)控模式，以及在不同種類藥劑或者同一種藥劑不同質(zhì)量濃度處理后是否具有同樣的表達(dá)趨勢(shì)，還需要進(jìn)一步的探討和研究。

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Cloning and expression of cytochrome CYP6 gene fromPhyllonorycterringoniella

TIAN Tian,LI Xin,GUO Chang-ning,HOU Qian,WANG Guan-hua,YU Jian-guang

(CollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract：【Objective】 This study cloned and identified cytochrome CYP6 gene from Phyllonorycter ringoniella,and observed the change of mRNA relative expression after cyhalothrin treatment to provide information for obtaining full length cDNA of CYP6 gene and preventing or delaying its drug resistance.【Method】 Degenerate primers were designed and synthesized based on the available coding region of CYP6 family genes in GenBank database.Blastx comparison on NCBI was conducted after getting the fragments by RT-PCR method,and they were named according to P450 gene nomenclature before being submitted to GenBank for registration number.At last,the relative expression of cytochrome P450 genes was quantified after the 3rd instars of Phyllonorycter ringoniella were disposed in cyhalothrin(LC50=12.88 mg/L)for 24 hours by spot method and qRT-PCR.【Result】 Three cDNA fragments with lengths of 415,412,and 421 bp were successfully obtained,and the similarities of amino acids were 61%,59% and 71%,respectively by homology analysis.They were named phCYP6AN5,phCYP6B5 and phCYP6ab and preliminarily grouped to CYP6 family.The login numbers of KJ559411,KJ559412 and KJ559413 were obtained from GenBank.The expression of phCYP6AN5 after treatment increased,while that of phCYP6B5 and phCYP6ab decreased.【Conclusion】 This study successfully constructed three cytochrome CYP6 family genes and they had specificity to inducing agents.The compounds that were effective to P450 enzyme may not necessarily work for other types of P450.

Key words：Phyllonorycter ringoniella;cytochrome P450;sequence analysis;gene expression

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)01-0111-07

[中圖分類號(hào)]Q785

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[通信作者]李鑫(1957-)，男，陜西岐山人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹(shù)害蟲管理與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化研究。

[作者簡(jiǎn)介]田甜(1988-)，女，天津薊縣人，在讀碩士，主要從事果樹(shù)害蟲分子生物學(xué)研究。

[基金項(xiàng)目]陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2008K01-04)；世界銀行資助項(xiàng)目(Y/SHYL/XY/050)

[收稿日期]2014-05-23

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.017

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.034.html

E-mail：tian14720962@hotmail.com

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