Box-BehnKen響應(yīng)面法優(yōu)化紫穗槐根中總異黃酮提取工藝

趙昱瑋， 南敏倫， 于　淼， 司學(xué)玲， 呂　娜， 赫玉芳*

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.長(zhǎng)春三德天晟科技有限公司，吉林長(zhǎng)春130012；3.修正藥業(yè)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，吉林長(zhǎng)春130012；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130118）

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Box-BehnKen響應(yīng)面法優(yōu)化紫穗槐根中總異黃酮提取工藝

趙昱瑋1， 南敏倫1， 于淼2， 司學(xué)玲3， 呂娜4， 赫玉芳1*

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.長(zhǎng)春三德天晟科技有限公司，吉林長(zhǎng)春130012；3.修正藥業(yè)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，吉林長(zhǎng)春130012；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130118）

摘要：目的 優(yōu)化紫穗槐根中總異黃酮的提取工藝。方法 以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷為指標(biāo)，采用紫外分光光度法測(cè)定總異黃酮含有量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)紫穗槐總異黃酮提取率的影響。結(jié)果 最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70％，料液比1∶13，提取時(shí)間3 h，提取次數(shù)3次。在此條件下，紫穗槐根總異黃酮的提取率為5.59％。結(jié)論 該工藝簡(jiǎn)便可靠，提取率高，可為紫穗槐根中總異黃酮的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫穗槐；根；總異黃酮；提取工藝；Box-Behnken響應(yīng)面法

紫穗槐AmorPha fruticosa L.為豆科紫穗槐屬多年生落葉灌木，別名棉槐、椒條、棉條、穗花槐［1］，在我國(guó)東北、華北、西北地區(qū)及山東、安徽、江蘇、河南、湖北、廣西、四川等地均有栽培，其花清熱、涼血、止血［2］；葉微苦、涼，具有祛濕消腫功效，主治癰腫、濕疹、燒燙傷［3］。紫穗槐根系發(fā)達(dá)，可耐瘠、耐水濕，又有固氮、防風(fēng)固沙等作用［1］，其化學(xué)成分以黃酮為主，此外還含二苯乙烯苷、甘油酯、揮發(fā)油及多糖等［4-5］，在抗腫瘤、抗病毒、保肝、殺蟲等方面顯示出潛在的藥用價(jià)值［6-7］。該資源比較豐富，但尚無(wú)其總異黃酮提取工藝的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為自變量，總異黃酮提取率為因變量，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以期為紫穗槐根中總異黃酮的提取與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-759S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；BS2010S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；ZK-82A型電熱真空干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）。

毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（自制，含有量> 98％）。甲醇、無(wú)水乙醇、95％乙醇均為分析純（北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水。

紫穗槐根采自長(zhǎng)春凈月開發(fā)區(qū)，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成研究員鑒定為豆科植物紫穗槐AmorPha fruticosa L.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 總異黃酮的測(cè)定［8-9］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 吸取毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm處有最大吸收峰，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，于260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，空白溶液作為對(duì)照。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A），得到線性回歸方程為A=0.052 68 X +0.081 43，r=0.999 4，表明毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在5～25 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 含有量的測(cè)定方法 取供試品溶液適量，于260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算紫穗槐根提取液中總異黃酮的含有量，計(jì)算公式如下。

注：X為總異黃酮提取率（％），c為總異黃酮質(zhì)量濃度（μg/mL），m為取樣量（g）

2.1.5 供試品溶液的制備 將紫穗槐根藥材粉碎，過(guò)40目篩，精密稱取適量，乙醇回流提取，放冷，濾過(guò)，定容于250 mL量瓶中，再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

鄉(xiāng)鎮(zhèn)電視臺(tái)取材范圍狹窄。在取材不足的情況下，電視臺(tái)主要把新聞焦點(diǎn)聚焦在時(shí)政方面，其中又以縣級(jí)領(lǐng)導(dǎo)干部和正常政務(wù)活動(dòng)的鏡頭為主；而對(duì)于那些能夠反映基層群眾日常生活、思想風(fēng)貌、生存環(huán)境和社會(huì)心聲的民生類新聞的比重較少。新聞報(bào)道內(nèi)容單一，總體價(jià)值不高，這些與百姓利益沒(méi)有直接性關(guān)系的會(huì)議新聞?dòng)^眾不感興趣，影響了收視率。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，平行測(cè)定6次，測(cè)得RSD為1.8％，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，制備6份樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得RSD為1.5％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，在0、1、2、4、6、8、10 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得RSD為1.4％，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取含有量已知的供試品溶液6份，分別加入對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得平均回收率為99.8％，RSD為1.9％，表明該方法回收率良好。

2.2 提取條件的確定

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在料液比1∶12，回流提取2次，每次1 h，50％、60％、70％、80％、90％乙醇條件下提取，放冷，濾過(guò)，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項(xiàng)下方法在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總異黃酮提取率分別為4.27％、5.12％、5.46％、5.48％、5.33％，故選擇70％乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 料液比 精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在70％乙醇，回流提取2次，每次1 h，料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16條件下提取，放冷，濾過(guò)，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項(xiàng)下方法在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總異黃酮提取率分別為4.38％、5.02％、5.56％、5.49％、5.50％，故選擇料液比為1∶12。

2.2.3 提取時(shí)間 精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共5份，在70％乙醇，料液比1∶12，回流提取2次，提取0.5、1、2、3、4 h條件下提取，放冷，濾過(guò)，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項(xiàng)下方法在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總異黃酮提取率分別為4.21％、4.85％、5.51％、5.55％、5.53％，故選擇提取時(shí)間為2 h。

2.2.4 提取次數(shù) 精密稱取紫穗槐根粉末5.0 g，共4份，在70％乙醇，料液比1∶12、提取2 h，提取1、2、3、4次條件下提取，放冷，濾過(guò)，定容于250 mL量瓶中。再精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.1.4”項(xiàng)下方法在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總異黃酮提取率分別為4.82％、5.48％、5.52％、5.61％，故選擇提取次數(shù)為2次。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)選最佳提取條件 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以紫穗槐根總異黃酮提取率為響應(yīng)值（X），選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）這4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平，并采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析［10-11］。因素水平見(jiàn)表1。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　因素水平

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

然后，利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行分析，得到回歸方程X=5.43 +0.19A+0.10B+0.18C+0.23D-0.027AB-0.045AC -0.11AD -0.012BC -0.092BD + 0.15CD-0.21A2-0.10B2-0.15C2-0.26D2。方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，一次項(xiàng)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)總異黃酮提取率的影響最大，p均<0.000 1；二次項(xiàng)中，提取次數(shù)影響最顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間次之，p均<0.01。另外，模型的失擬項(xiàng)不顯著（p = 0.001 8），而模型顯著（p<0.000 1），表明方法可靠；信噪比值為13.779，大于4，表明該模型能如實(shí)反映試驗(yàn)結(jié)果；相關(guān)系數(shù)r=0.928 0，表明回歸方程的擬合程度良好；RSD低于10％（2.26％），表明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

表3　方差分析

綜上所述，紫穗槐根總異黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.96％，料液比1∶12.27，提取時(shí)間2.90 h，提取次數(shù)2.62次，理論提取率值5.61％。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 考慮到實(shí)際可操作性，對(duì)上述條件進(jìn)行了修正，最終確定最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70％，料液比1∶13，提取時(shí)間3 h，提取次數(shù)3次。然后，以其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得紫穗槐根總異黃酮的平均提取率為5.59％，平均含有量為20.3％，與理論值（5.61％）相近，表明該工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 討論

Box-Behnken響應(yīng)面法可得到最優(yōu)的考察因素和響應(yīng)值，避免傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)存在的問(wèn)題，最終精確找到最佳點(diǎn)，并可靈敏地考察各因素間的交互作用［12］，彌補(bǔ)正交設(shè)計(jì)的缺限，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)提取紫穗槐根總異黃酮后，先采用單因素試驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)其提取率的影響，然后進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最后以Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸和方差分析，測(cè)得回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.928 0，表明方程擬合良好。根據(jù)響應(yīng)曲面及等高線圖，得到了各因素間的相互作用，可知其影響大小依次為提取次數(shù)>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>料液比。

驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該方法真實(shí)可信，誤差小。最終，確定最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70％，料液比1∶13，提取時(shí)間3 h，提取次數(shù)3次，在此條件下紫穗槐根總異黃酮提取率為5.59％，總異黃酮平均含有量為20.3％，高于單因素試驗(yàn)結(jié)果，可為紫穗槐根中總異黃酮的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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*通信作者：赫玉芳（1973—），女，博士，副研究員，從事植物化學(xué)研究與新藥開發(fā)，Tel：（0431）86058683，E-mail：hyf_ 1992@ 163.com

作者簡(jiǎn)介：趙昱瑋（1983—），男，碩士，從事植物化學(xué)研究與新藥開發(fā)。Tel：（0431）86058683，E-mail：yuwei5208@163.com

基金項(xiàng)目：吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2014 -Q40）

收稿日期：2015-06-01

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.048

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1177-03