流化床法制備水飛薊素納米結(jié)晶微丸

羅開沛， 李小芳， 楊　露， 向志蕓， 林　浩， 劉海霞

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

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流化床法制備水飛薊素納米結(jié)晶微丸

羅開沛， 李小芳*， 楊露， 向志蕓， 林浩， 劉海霞

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

摘要：目的 研究水飛薊素納米結(jié)晶微丸的最優(yōu)工藝參數(shù)及體外釋放度。方法 流化床法制得水飛薊素納米結(jié)晶微丸。以黏合劑用量、恒流泵轉(zhuǎn)速和霧化壓力為考察因素，以微丸的得丸率、上藥率和平均再分散粒徑為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，并進(jìn)行體外釋放度測定。結(jié)果 最優(yōu)工藝參數(shù)為羥丙甲基纖維素用量0.16％，恒流泵轉(zhuǎn)速9.5 r/min，霧化壓力0.12 MPa。微丸的得丸率（85.74±1.29）％，上藥率（86.43±1.52）％，平均再分散粒徑（251.6±3.8）nm，30 min內(nèi)藥物累積釋放度達(dá)90％以上。結(jié)論 該方法制成的水飛薊素納米結(jié)晶微丸兼顧了納米混懸劑和固體制劑的優(yōu)點(diǎn)，工藝簡單、可行，可為液體制劑固體化提供新的制備方法。

關(guān)鍵詞：水飛薊素；納米結(jié)晶；微丸；流化床法

水飛薊素（SM）是從水飛薊Silybum marianum L.種子中提取的黃酮木脂素類化合物，主要包括水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭4種成分，其中以水飛薊賓含有量最高，而且活性最大［1］?，F(xiàn)代研究表明，水飛薊素具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、抗癌等藥理作用［2-3］。然而，其溶解度僅為40 μg/mL，為難溶于水的藥物，不利于人體吸收。有文獻(xiàn)報(bào)道，德國產(chǎn)水飛薊素片（利加?。┑目诜Ч?，體外溶出速率慢，導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度低，而且國產(chǎn)水飛薊素膠囊及普通片劑同樣存在溶出速率慢的問題，影響了其療效發(fā)揮和臨床開發(fā)應(yīng)用［4-6］。

納米混懸劑（NS）是一種亞微米膠體分散體系的新型給藥系統(tǒng)，能夠增加藥物溶解度，提高生物利用度［7］。但由于它以液體形式存在，屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，攜帶、服用不便，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用和推廣。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑沉淀結(jié)合高壓均質(zhì)法制備水飛薊素納米混懸劑（SM-NS），再運(yùn)用流化床噴霧干燥技術(shù)將其制成水飛薊素納米結(jié)晶（SMNC）微丸，以期提高水飛薊素的溶出度，同時(shí)改善其納米混懸劑的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AH-100D高壓均質(zhì)機(jī)（加拿大ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司）；Nicomp 380ZLS激光粒度分析儀（美國PSS粒度儀公司）；微型流化床（遼寧醫(yī)聯(lián)新藥研究所）；LH-2D定時(shí)數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；UV-6000紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZG-6020真空干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥 水飛薊素對照品（西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號LC20150203，含有量為80.0％）；水飛薊賓對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-15020104）。微晶纖維素丸芯（杭州高成生物營養(yǎng)技術(shù)有限公司）；羥丙甲基纖維素（HPMC，上?？房蛋掠邢薰荆晃傅鞍酌福ㄉ虾Ｈ缂锟萍及l(fā)展有限公司）；聚維酮K30（PVP-K30）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 水飛薊素納米混懸劑的制備方法 采用溶劑沉淀結(jié)合高壓均質(zhì)法［8］制備水飛薊素納米混懸劑。取水飛薊素原料藥0.4 g，置于10 mL無水乙醇中，超聲溶解，作為油相，再取穩(wěn)定劑（聚維酮K30∶十二烷基硫酸鈉=2∶1）0.2 g溶于100 mL純水中，作為水相。將油相緩慢注入在一定條件下攪拌的水相中，持續(xù)攪拌10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇至無醇味，將制得的粗混懸劑于高壓均質(zhì)機(jī)1 000 Pa條件下均質(zhì)12次，得到水飛薊素納米混懸劑。

2.2 水飛薊素納米混懸劑平均粒徑的測定 量取水飛薊素納米混懸劑適量，用純水稀釋一定倍數(shù)，搖勻，激光粒度分析儀測得其平均粒徑為191.4 nm，多分散指數(shù)為0.135，見圖1。

圖1　水飛薊素納米混懸劑的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of silymarin nanosuspension

2.3 水飛薊素納米結(jié)晶微丸的制備方法 取羥丙甲基纖維素適量溶解于純水中，作為黏合劑，靜置后加到納米混懸劑中混勻，得到上樣液。設(shè)定流化床鼓風(fēng)頻率18 Hz，流化溫度38～42℃，控制一定的霧化壓力，調(diào)節(jié)恒流泵適宜轉(zhuǎn)速，采用底噴方式噴入上樣液，保持連續(xù)攪拌。丸芯載藥完成后，繼續(xù)鼓風(fēng)30 min，取出置于真空干燥箱中，40℃下干燥2 h，即得。

2.4 水飛薊素納米結(jié)晶微丸得丸率的測定 取出干燥后的載藥微丸，稱定質(zhì)量M1，于20～24目篩網(wǎng)過篩后，得到篩分微丸，稱定質(zhì)量M2，計(jì)算得丸率。計(jì)算公式為得丸率=（M2/M1）×100％。

2.5 水飛薊素納米結(jié)晶微丸上藥率的測定［9］微丸增重減去黏合劑和穩(wěn)定劑的總重，得到主藥實(shí)際固含有量，所得值再除以主藥理論固含有量，再乘以100％即為上藥率。計(jì)算公式為上藥率=［（載藥微丸量-穩(wěn)定劑量-黏合劑量-空白丸芯量）/理論主藥固含有量］×100％。

2.6 水飛薊素納米結(jié)晶微丸平均再分散粒徑的測定 稱取微丸適量，溶于蒸餾水中，振搖，0.8 μm微孔濾膜過濾，稀釋一定倍數(shù)，測定其平均再分散粒徑和多分散指數(shù)。

2.7 藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及含有量測定

2.7.1 對照品溶液及空白輔料溶液的制備 精密稱取水飛薊賓對照品10.0 mg，置于100 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，超聲溶解，制得每1 mL含0.1 mg對照品的溶液。再稱取一定量空白輔料，置于25 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，制得空白輔料溶液。

2.7.2 測定波長的選擇 精密量取水飛薊賓對照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在286 nm波長處有最大吸收。再精密量取空白輔料溶液適量，在286 nm波長處掃描，發(fā)現(xiàn)無吸收峰，表明輔料對藥物無干擾。

2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置于10 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，在286 nm波長處測定吸光度，以水飛薊賓質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C），吸光度為縱坐標(biāo)（A）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.053 1C-0.004 7，r=0.999 5，表明水飛薊賓在4.00～14.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7.4 含有量測定 稱取微丸（約含水飛薊賓3 mg）適量，置于100 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，測定其吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含藥量。

2.8 水飛薊素納米結(jié)晶微丸工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.8.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9-10］和前期試驗(yàn)，選擇黏合劑用量（X1）、恒流泵轉(zhuǎn)速（X2）、霧化壓力（X3）作為考察因素，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。以微丸得丸率（Y1，最大值為優(yōu)）、上藥率（Y2，最大值為優(yōu)）和平均再分散粒徑（Y3，最小值為優(yōu)）為指標(biāo)，分別設(shè)置權(quán)重為30、30、40分，總分為100分，以綜合評分值（T）對各項(xiàng)測定結(jié)果進(jìn)行加權(quán)。計(jì)算公式為Dmax=Yi/Ymax（最大值為優(yōu)）；Dmin=Ymin/Yi（最小值為優(yōu)）；T= DY1×30 +DY2×30 +DY3×40，其中Yi為各項(xiàng)測定值，Ymax為該項(xiàng)最大值，Ymin為該項(xiàng)最小值，D為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

2.8.2 模型擬合 應(yīng)用Design-Expert軟件分析數(shù)據(jù)，得到多元線性回歸方程Y1=77.29 -0.54X1+ 3.33X2-0.39X3，r=0.186 4，p=0.333 9；Y2= 80.53 +0.95X1+3.62X2+0.015X3，r=0.349 4，p=0.069 4；Y3=294.62 +3.61X1+1.73X2+ 25.27X3，r=0.129 1，p=0.516 7；T=80.89 -0.48X1+1.78X2-2.20X3，r=0.101 0，p=0.624 7；擬合二次多項(xiàng)式回歸方程Y1=84.24 -0.54X1+ 3.33X2-0.39X3-0.84X1X2+1.26X1X3+2.17X2X3-2.75X21-5.62X22-1.82X23，r=0.894 5，p= 0.000 8；Y2=81.25 +0.95X1+3.62X2+0.015 X3-2.32X1X2+1.54X1X3+0.21X2X3-2.59X21-1.28X22+2.81X23，r=0.935 0，p<0.000 1；Y3= 232.55 +3.61X1+1.73X2+25.27X3-26.65X1X2-31.00X1X3-29.02X2X3+19.68X21+27.53X22+ 43.69X23，r=0.941 9，p<0.000 1；T=89.55 -0.48X1+1.78X2-2.20X3+1.68X1X2+4.12X1X3+ 3.76X2X3-3.92X21-5.18X22-3.58X23，r=0.941 9，p<0.000 1，二次多項(xiàng)式回歸方程的p值和相關(guān)系數(shù)均較大，表明該模型顯著性較高，擬合度良好，可進(jìn)行工藝預(yù)測和分析。綜合評分方差分析結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)失擬項(xiàng)不顯著（p>0.05），表明該模型可替代實(shí)際試驗(yàn)值來對結(jié)果進(jìn)行分析。

表3　方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.8.3 工藝參數(shù)優(yōu)化及預(yù)測 根據(jù)回歸方程，繪制以得丸率、上藥率、再分散粒徑和綜合評分對自變量的三維效應(yīng)面圖，見圖2～5。由圖可知，隨著霧化壓力和轉(zhuǎn)速的增大，得丸率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而轉(zhuǎn)速對其影響較大；上藥率隨著轉(zhuǎn)速和黏合劑用量的增大而增大；微丸再分散粒徑隨黏合劑用量的增大而增大，當(dāng)霧化壓力逐漸增大時(shí)，其呈先減小后增大的趨勢，壓力達(dá)到0.15 MPa時(shí)更明顯；綜合評分隨黏合劑用量、恒流泵轉(zhuǎn)速和霧化壓力的增大，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。綜上所述，最優(yōu)工藝參數(shù)為羥丙甲基纖維素用量0.16％，恒流泵轉(zhuǎn)速9.46 r/min，霧化壓力0.12 MPa，綜合評分預(yù)測值90.20。另外，由于恒流泵轉(zhuǎn)速精確到0.1 r/min，因此確定轉(zhuǎn)速為9.5 r/min。

圖2　得丸率的三維效應(yīng)曲面圖Fig.2 3D response surface chart of yield of pellets

圖3　上藥率的三維效應(yīng)曲面圖Fig.3 3D response surface chart of layering efficiency

2.8.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)篩選的最優(yōu)工藝參數(shù)，制備3批微丸，均為表面均勻、光潔、飽滿的黃色小丸，得丸率（85.74±1.29）％，上藥率（86.43± 1.52）％，平均再分散粒徑（251.6±3.8）nm，多分散指數(shù)0.184±0.015（n =3），綜合評分實(shí)際值89.19，與預(yù)測值90.20偏差1.12％，表明該數(shù)學(xué)模型可信度高，預(yù)測性良好。按“2.7.4”項(xiàng)下方法，計(jì)算微丸中水飛薊素的含有量為（35.16± 1.07）％（n =3）。綜合考慮，最終擬定微丸含藥量為35.00％。

2.9 體外測定方法 按照《中國藥典》2010年版二部溶出度測定法中的第二法（槳法），對微丸和原料藥進(jìn)行測定。分別稱取微丸150 mg、原料藥52.5 mg，以人工胃液為溶出介質(zhì)，控制轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度（37±0.5）℃，分別于5、10、20、30、40、50、60 min取樣5 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾并稀釋，同時(shí)補(bǔ)充等溫等體積的新鮮介質(zhì)，測定樣品溶液吸光度，計(jì)算藥物的累積溶出度，結(jié)果見圖6。由圖可知，在30 min內(nèi)，微丸累積釋放度達(dá)到90％以上，而原料藥在60 min內(nèi)的累積釋放度僅為34.87％，表明將水飛薊素制成微丸能有效提高其溶出度。

圖4　再分散粒徑的三維效應(yīng)曲面圖Fig.4 3D response surface charts of particle size of redispersion

圖5　響應(yīng)值的三維效應(yīng)曲面圖Fig.5 3D response surface charts of response value

圖6　微丸和原料藥的累積釋放曲線Fig.6 Accumulative release curves of pellets and raw medicine

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇聚維酮K30聯(lián)合十二烷基硫酸鈉作為穩(wěn)定劑，發(fā)現(xiàn)其效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用。其中，聚維酮K30在處方中作為空間立體穩(wěn)定劑，提供立體穩(wěn)定效應(yīng)；十二烷基硫酸鈉作為靜電穩(wěn)定劑，提供電荷排斥效應(yīng)［11-12］。在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以吐溫-80為穩(wěn)定劑也能達(dá)到較好的效果，但因其是黏稠液體，給干燥固化帶來了一定困難，因此不選用該液體輔料。

納米混懸劑穩(wěn)定性差一直是限制其應(yīng)用和開發(fā)的瓶頸問題，故將其固體化已成為新的發(fā)展方向。目前，固化方法主要有冷凍干燥［13］、噴霧干燥［14］和真空干燥［15］等，但均有一定缺陷，如冷凍干燥成本、能耗較高，干燥周期較長；噴霧干燥工藝復(fù)雜，收率較低；真空干燥使成品凝結(jié)成塊，納米晶體聚集嚴(yán)重。針對以上問題，流化床噴霧干燥是一種有前途的固化技術(shù)，具有噴霧干燥和一步制粒的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了干燥粉末再制粒的過程，也可進(jìn)一步制成其他固體制劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所得水飛薊素納米結(jié)晶微丸的得丸率和上藥率均較高，再分散性能較好，平均粒徑小且分布較窄，能夠快速釋藥，可為其他液體制劑固體化提供新的制備方法。

納米混懸劑固化后，較固化前的平均粒徑和多分散指數(shù)均有所增大，可能是在干燥過程中隨著水分散失，形成納米晶體的同時(shí)，存在“固化損傷”，導(dǎo)致部分粒子間發(fā)生不可逆的聚集和增長［16］。文獻(xiàn)［17］報(bào)道，在納米混懸劑中加入適量的膠體可顯著抑制納米晶體的團(tuán)聚，有效防止固化時(shí)粒徑增大，至于能否改善微丸的再分散性能，還在進(jìn)一步研究中。

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網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-10-23

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20151023.1454.002.html

Preparing silymarin nanocrystal pellets by fluid-bed method

LUO Kai-pei， LIXiao-fang*， YANG Lu， XIANG Zhi-yun， LIN Hao， LIU Hai-xia
（College of pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine；Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine；Key Laboratory of Systematic Research，DeveloPment and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan p rovince—State Key Laboratory Breeding Base，Chengdu 611137，China）

ABSTRACT：AIM To study the best technology parameters for silymarin nanocrystal pellets and their in vitro release rate.METHODS Silymarin nanocrystal pelletsweremade by fluid-bed method.Considering the yield of pellets，layering efficiency and average particle size of redispersion as the indices，central composite design-response surfacemethod was applied to investigating the adhesive consumption，speed of constant flow pump and atomizing pressure for optimizing technology parameters and determining release rate in vitro.RESULTS The technology parameterswere thus optimized，viz.，the HPMC consumption was 0.16％，the speed of constant flow pump was 9.5 r/min，and atomization pressurewas0.12 MPa.The yield of pelletswas（85.74±1.29）％，layering efficiency was（86.43±1.52）％，average particle size of redispersion was（251.6±3.8）nm，and the accumulative release rate of drug reached more than 90％within 30 min.CONCLUSION The silymarin nanocrystal pelletsmade by thismethod reveal the superiorities of both nanosuspension and solid preparation.This simple and feasible technology can be applied to solidifying the liquid preparation.

KEY WORDS：silymarin；nanocrystal；pellets；fluid-bed method

*通信作者：李小芳（1964—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型、新技術(shù)。Tel：13808195110，E-mail：lixiaofang918@163.com

作者簡介：羅開沛（1991—），男，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿⑿聞┬?、新技術(shù)。Tel：15351218131，E-mail：luokaipei@126.com

基金項(xiàng)目：四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（15ZA0094）

收稿日期：2015-06-16

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.012

中圖分類號：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1024-06