miRNA-181a在人肺腺癌細胞中的表達及對細胞功能的影響

趙 鐸， 金 柱， 宋亞亞， 高寶安

(三峽大學(xué)呼吸病研究所，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸科，湖北 宜昌 443003)

miRNA-181a在人肺腺癌細胞中的表達及對細胞功能的影響

趙 鐸， 金 柱， 宋亞亞， 高寶安△

(三峽大學(xué)呼吸病研究所，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸科，湖北 宜昌 443003)

目的： 研究微小RNA-181a(miRNA-181a)在不同人肺腺癌細胞中的表達及其轉(zhuǎn)染人肺腺癌耐藥細胞A549/DDP后對其細胞功能的影響及機制。方法: 利用實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-181a在人正常肺上皮細胞系BEAS-2B、人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、人肺腺癌耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP中的表達；利用pGenesil-miRNA-181a真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和空載組；分別采用實時熒光定量PCR、MTT法、流式細胞術(shù)、Transwell實驗以及Western blot法檢測miRNA-181a轉(zhuǎn)染前后的表達情況、對A549/DDP細胞活力、細胞周期、細胞侵襲能力和順鉑(DDP)作用下的細胞生長抑制率、細胞凋亡率的影響以及對A549/DDP細胞中miRNA-181a的靶基因bcl-2和p53蛋白表達的影響。結(jié)果: miRNA-181a在A549和A549/DDP中的表達量顯著低于BEAS-2B(P<0.05)，且在A549/DDP中表達量最低；miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后其表達顯著升高(P<0.05)且能夠抑制A549/DDP細胞活力、細胞周期和細胞侵襲能力(P<0.05)，同時升高DDP作用下A549/DDP細胞的生長抑制率和細胞凋亡率(P<0.05)；miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后抑制Bcl-2蛋白的表達而促進P53蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論: miRNA-181a可能參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，miRNA-181a可作為人肺腺癌治療的新靶點。

微小RNA-181a； A549/DDP細胞系； 細胞周期； 細胞凋亡； 細胞侵襲

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度一般為18～23個堿基構(gòu)成的非編碼單鏈RNA分子，它們在轉(zhuǎn)錄后能夠調(diào)控目的基因的表達，參與到細胞的凋亡、增殖、分化、發(fā)育和代謝等生理過程中[1]。已有研究報道[2]，在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了miRNA表達量的改變，提示其可能參與到腫瘤的發(fā)病機理中，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥等相關(guān)，發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用。大量研究表明[3]，miRNA的異常表達會促進腫瘤的發(fā)生和進展，在非小細胞肺癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等多種惡性腫瘤中具有重要臨床價值。miR-181a在多種組織臟器中選擇性的表達，具有功能多樣、生物學(xué)效應(yīng)顯著等特點。有研究表明[4]miR-181a能夠調(diào)控癌細胞的增殖和凋亡，如在急性髓系細胞白血病細胞中過表達miR-181a會顯著降低細胞的增殖和代謝活性，而抑制miR-181a表達對急性髓細胞樣白血病細胞增殖和代謝活性卻沒有產(chǎn)生影響。在人惡性膠質(zhì)瘤細胞U87MG對放射物的敏感性研究中，也發(fā)現(xiàn)輻射處理后的U87MG細胞Bcl-2發(fā)生上調(diào)，而miR-181a下調(diào)；而過表達miR-181a則會下調(diào)Bcl-2蛋白，所以調(diào)控miRNA-181a的表達對于臨床治療腫瘤具有重要的參考價值[5]。肺癌是當今腫瘤死亡的重要原因，而其中以非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)為主，這與其容易產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[6]。但目前對于miRNA-181a在NSCLC細胞中的表達情況尚不確定，其在NSCLC細胞增殖、侵襲、凋亡及耐藥性等細胞功能中發(fā)揮的作用也未知。因此，本研究選擇人肺腺癌細胞A549及耐藥A549/DDP為NSCLC細胞系的研究對象，檢測miRNA-181a在不同NSCLC細胞中的表達情況及對相關(guān)細胞功能的影響。

材 料 和 方 法

1 細胞株與試劑

人正常肺上皮細胞系BEAS-2B、人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、人肺腺癌耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、含0.25% EDTA的胰酶購自HyClone；TRIzol提取RNA試劑盒購自成都天根公司；NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、OpenArray MicroRNA Real-Time PCR Master Mix購自Invitrogen；Transwell Permeable Supports購自Corning；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)購自Sigma；細胞周期檢測試劑盒、Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自北京鼎國生物公司；兔抗人Bcl-2、 P53、β-actin的I抗購自Santa Cruz；HRP標記山羊抗兔IgG的II抗購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 分別將購買的人正常肺上皮細胞系BEAS-2B、人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、人肺腺癌耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞快速復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。每隔12 h后更換新培養(yǎng)基1次，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并等細胞貼壁生長至80%以上后進行細胞傳代培養(yǎng)。將傳代的細胞進行連續(xù)培養(yǎng)并進行后續(xù)實驗。

2.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-181a的表達 分別將處于增殖期的BEAS-2B、A549、A549/DDP細胞經(jīng)含0.25%的胰酶消化后，900 r/min離心5 min后收集細胞。在各組細胞中加入1 mL的TRIzol提取液，按照試劑盒步驟提取總 RNA，設(shè)計合成miRNA-181a莖環(huán)特異逆轉(zhuǎn)錄引物為5’-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-CGCTCACCG-3’；利用miRNA-181a特異性引物和NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。由Invitrogen設(shè)計合成miRNA-181a和內(nèi)參照U6實時熒光定量PCR的引物，miRNA-181a上游引物為5’-GCCGAAACATTCAACGCTATC-3’，下游引物為5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參照U6上游引物為5’-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。利用OpenArray MicroRNA Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明書分別加入miRNA-181a引物或內(nèi)參照U6引物、逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板，置于ABI7300熒光實時定量PCR儀上進行擴增檢測。miRNA-181a和內(nèi)參照U6均設(shè)置3個復(fù)孔，每個樣品進行3次重復(fù)檢測，采用2-ΔΔCt方法對miRNA-181a相對表達量進行計算比較。

2.3 miRNA -181a過表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及檢測 從miRNAs目標靶基因數(shù)據(jù)庫中(http://www.mirbase.org)獲得人miRNA-181a基因序列為5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’， 經(jīng)由Invitrogen合成并構(gòu)建帶綠色熒光標記的pGenesil-miRNA-181a真核表達質(zhì)粒。用培養(yǎng)基調(diào)整A549/DDP細胞濃度為5×108/L，每孔2 mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長至50%以上后用于轉(zhuǎn)染。將Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和合成構(gòu)建的miRNA-181a表達載體以2∶1體積比列混合后瞬時轉(zhuǎn)染至各孔A549/DDP細胞中，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和pGenesil空載組。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并繼續(xù)培養(yǎng)以備后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后按照上述步驟方法提取各組細胞中的總RNA， miRNA181a逆轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)后利用實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后各組A549/DDP細胞中miRNA-181a表達的變化。

2.4 MTT法檢測細胞活力和抑制率 將miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后12 h的細胞(5×107/L)每孔 200 μL接種于96孔板中，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和空載組。先繼續(xù)分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后，在每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，在每孔中加入150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min后，置于酶標儀上測定570 nm波長各孔的吸光度(A)值。每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔。同時將miRNA-181a轉(zhuǎn)染24 h的A549/DDP細胞接種于96孔板中，在細胞貼壁生長后各組細胞更換含不同濃度(0、5、10、15、20 μmol/L)順鉑的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后按照相同的方法測定各組細胞在570 nm處的A值，并計算各組細胞在順鉑作用下的生長抑制率，按照公式計算各組細胞生長抑制率(%)=(1-加藥組A值)/未加藥對照組A值×100%。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡 收集miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP 24 h后的各組細胞經(jīng)PBS重懸后制成單細胞懸液，先加入70%預(yù)冷的乙醇在4 ℃固定12 h后，離心棄上清并清洗去乙醇，用500 μL的PBS重懸細胞加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)和RNaseA(50 mg/L)室溫避光孵育30 min后經(jīng)流式細胞儀上樣測定各組A549/DDP細胞周期并計算各周期百分比。同時收集miRNA-181a轉(zhuǎn)染24 h后的各組細胞，根據(jù)2.4實驗更換含10 μmol/L DDP的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在各組細胞中加入細胞凋亡檢測試劑(5 μL FITC標記的Annexin V和10 μL PI)，37 ℃下避光孵育20 min后，PBS洗滌1次并重懸經(jīng)流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

2.6 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 收集miRNA-181a轉(zhuǎn)染24 h后的A549/DDP細胞，并用培養(yǎng)基重懸稀釋細胞濃度為1×108/L，然后每孔200 μL種植于預(yù)先用1 g/L的,Matrigel膠包被的Transwell板上室中，下室中為加入含20%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基600 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。等培養(yǎng)結(jié)束后用4%的多聚甲醛固定小室的濾膜，并擦去上表面的細胞，用結(jié)晶紫染色液染色10 min后，PBS洗滌3次，在顯微鏡下觀察各組A549/DDP細胞侵襲穿過濾膜的細胞，并隨機拍照計數(shù)各組細胞的侵襲率。細胞侵襲率=(各組平均侵襲細胞數(shù)/未處理對照組侵襲細胞數(shù))×100%。

2.7 Western blot法檢測miRNA-181a靶基因蛋白的表達 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞24 h后，消化離心收集細胞，并用PBS洗滌1次，加入RAPI細胞裂解液裂解各組細胞并提取總蛋白，利用BCA試劑盒測定各組細胞中總蛋白濃度。各組取30 μg總蛋白進行10%的SDS-PAGE 2 h后，進行半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉30 min后孵育多克隆兔抗人Bcl-2、P53、β-actin的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌 5 min 3次；然后室溫孵育HRP標記的山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000)2 h，再用TBST洗滌3次后用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，并曝光掃描拍照，用Quantity One軟件分析各組A549/DDP細胞中miRNA-181a靶基因蛋白Bcl-2和P53的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行分析，并用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。符合正態(tài)分布兩組間計量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析，用SNK-q進行均數(shù)之間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA-181a在不同細胞系中的表達

miRNA-181a在BEAS-2B細胞中相對表達量為1.05±0.03，而A549細胞中miRNA-181a相對表達量顯著下降為0.35±0.06，與BEAS-2B細胞相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；而A549/DDP細胞中miRNA-181a相對表達量也顯著下降為0.13±0.05，與BEAS-2B、A549細胞系相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of miRNA-181a in different cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsBEAS-2B group;#P<0.05vsA549 group.

圖1 miRNA-181a在BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞中的表達

2 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后的表達情況

上述實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-181a在A549/DDP細胞中表達量最低，為進一步研究miRNA-181a對人非小細胞肺癌細胞功能的影響，將pGenesil-miRNA-181a真核表達質(zhì)粒通過瞬時轉(zhuǎn)染至A549/DDP細胞中。在倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)miRNA-181a空載組和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞48 h后發(fā)綠色熒光，說明miRNA-181a能夠轉(zhuǎn)染至A549/DDP細胞中，轉(zhuǎn)染效率均達80%以上，而未轉(zhuǎn)染組細胞中未見綠色熒光。同時利用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后其表達量顯著增加。與未轉(zhuǎn)染組和空載轉(zhuǎn)染組相比，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組中miRNA-181a表達量上升約(14.93±0.96)倍(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of miRNA-181a in transfected A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖2 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后細胞的表達變化

3 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞活力的影響

MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染組的A549/DDP細胞活力受到抑制，顯著低于未轉(zhuǎn)染組和空載組，并呈時間依賴性(P<0.05)。當DDP濃度為10 μmol/L時，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組的細胞生長抑制率已顯著升高(P<0.05)，但未轉(zhuǎn)染和空載組在DDP作用濃度上升為20 μmol/L時，其細胞生長抑制率才顯著升高，說明miRNA-181a轉(zhuǎn)染增強了A549/DDP細胞對DDP的敏感性，見圖3、4。

4 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后能夠抑制細胞周期中增殖期(S+G2/M期)比率。與未轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞相比，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組中A549/DDP細胞中G0/G1期百分比顯著升高(P<0.05)，而S+G2/M期百分比顯著下降(P<0.05)?？蛰d組中A549/DDP細胞G0/G1期和S+G2/M期百分比值與未轉(zhuǎn)染對照組相比無明顯變化，見圖5。

5 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP在DDP作用下細胞凋亡的影響

利用流式細胞術(shù)檢測在10 μmol/L的DDP作用下各組細胞的細胞凋亡情況，結(jié)果顯示miRNA-181a轉(zhuǎn)染組中A549/DDP細胞的凋亡率為(58.96±4.45)%，明顯高于未轉(zhuǎn)染組和空載組(P<0.05)，見圖6。

6 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞侵襲能力的影響

Transwell檢測各組A549/DDP細胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染能夠降低A549/DDP細胞的侵襲能力，結(jié)果見圖7。與未轉(zhuǎn)染組和空載組的細胞相比，miRNA-181a轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞的侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

Figure 3.The effect of miRNA-181a transfection on the cell activity of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfec-ted group;#P<0.05vsnegative group.

圖3 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞活力的影響

Figure 4.The effect of miRNA-181a transfection on A549/DDP cell growth inhibition rate under DDP treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖4 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞在DDP作用下生長抑制率的影響

Figure 5.The effect of miRNA-181a transfection on the cell cycle of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖5 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞周期的影響

Figure 6.The effect of miRNA-181a transfection on the cell apoptosis of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖6 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP在DDP作用下細胞凋亡的影響

Figure 7.The effect of miRNA-181a transfection on the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖7 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞侵襲能力的影響

7 miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞中Bcl-2和P53蛋白表達的影響

Western blot法檢測miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞對miRNA-181a的靶基因bcl-2和p53蛋白表達的影響，結(jié)果見圖8。與未轉(zhuǎn)染組和空載組比較， miRNA-181a轉(zhuǎn)染組A549/DDP細胞P53蛋白表達量顯著升高，而Bcl-2蛋白表達量顯著下降 (P<0.05)。

討 論

miRNA作為一種進化上高度保守的小分子RNA，雖然不被翻譯但能夠顯著調(diào)控其它基因表達，目前miRNA與腫瘤的相關(guān)性研究受到廣泛關(guān)注，而部分miRNA可能成為腫瘤治療新的靶點[7-8]。miRNA-181家族在肝癌、胃癌、乳腺癌、白血病等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮抑癌或促癌的重要作用，并與多種惡性腫瘤的耐藥性、臨床診斷及預(yù)后密切相關(guān)[9]。miRNA-181a是miRNA-181家族中重要成員之一，在基因組中表現(xiàn)進化保守性，參與細胞的分化調(diào)控，它能夠抑制多種細胞增殖并促進細胞凋亡，且在不同組織細胞中具有表達差異[10-11]。目前關(guān)于miRNA-181a在非小細胞肺癌中的表達情況及在非小細胞肺癌細胞中的功能研究尚少見。因此，本研究檢測miRNA-181a在不同非小細胞肺癌細胞中的表達，并利用miRNA-181a真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞，以揭示其在非小細胞肺癌細胞中發(fā)揮的作用。

Figure 8.The effect of miRNA-181a transfection on the protein expression of Bcl-2 and P53 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

圖8 miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞對miRNA-181a靶基因蛋白Bcl-2和P53表達的影響

以往研究表明，miRNA-181a在不同腫瘤中表達具有差異性，其在乳腺癌、胃癌中表達量顯著升高，而在口腔鱗狀細胞癌中低表達[12-13]。本研究為揭示miRNA-181a在人非小細胞肺癌中表達差異，選用人正常肺上皮細胞BEAS-2B為對照，檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-181a在人肺腺癌細胞A549及耐藥細胞A549/DDP中表達量顯著低于BEAS-2B細胞，說明miRNA-181a在非小細胞肺癌細胞中低表達，推測其可能在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用。為進一步驗證這一結(jié)論，選擇表達量最低的A549/DDP為研究對象并通過轉(zhuǎn)染miRNA-181a，使其在A549/DDP中高表達。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染后能夠抑制A549/DDP細胞活性，并顯著提高A549/DDP的增殖抑制率，直接說明miRNA-181a在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用，與馮春來等[14]關(guān)于miRNA-181a影響A549/DDP細胞順鉑耐藥性的研究具有一致性。

細胞生長受到細胞周期的調(diào)控，細胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和細胞分裂暫停期(G0期)，其中S期長短可以反映細胞增殖能力強弱[15]。相關(guān)研究[16]表明miRNA均能發(fā)揮調(diào)控細胞周期的作用。本研究中miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后，其G0/G1期顯著增加，但反映細胞增殖狀態(tài)的S+G2/M期顯著下降，說明上述miRNA-181a 抑制A549/DDP細胞活力是其通過阻滯細胞周期而發(fā)揮作用的。而在低濃度(10 μmol/L) DDP作用下，未轉(zhuǎn)染組和空載組A549/DDP細胞凋亡率較低，但miRNA-181a轉(zhuǎn)染后其凋亡率顯著上升，說明miRNA-181a提高順鉑作用下A549/DDP細胞的生長抑制率可能是通過促進細胞凋亡發(fā)揮作用的。

肺癌細胞侵襲是其腫瘤惡性的生物標志，A549/DDP作為具有多藥耐藥性的非小細胞肺癌細胞系，具有較強的侵襲能力[17]。但本研究中，miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后，檢測發(fā)現(xiàn)其侵襲能力顯著下降，侵襲率為未轉(zhuǎn)染組和空載組的1/3,說明miRNA-181a能夠抑制A549/DDP的侵襲能力。已有研究利用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Cbcl-2和p53是miRNA-181a發(fā)揮促凋亡作用的下游靶基因，并能夠被miRNA-181a調(diào)控表達[18]。為進一步研究miRNA-181a對A549/DDP細胞功能發(fā)揮作用的機制，利用Western blot法檢測miRNA-181a轉(zhuǎn)染對A549/DDP細胞中Bcl-2和P53表達的影響。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因編碼的產(chǎn)物，發(fā)揮促進癌細胞存活的作用，并能夠抑制細胞凋亡[19]。而抑癌基因p53是一種抑制細胞癌變的基因，并是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，其產(chǎn)物P53蛋白發(fā)揮抑癌作用[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-181a轉(zhuǎn)染A549/DDP后，細胞中Bcl-2表達顯著下降而P53蛋白表達上升，說明miRNA-181a能夠通過抑制A549/DDP細胞Bcl-2表達且促進P53表達而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，本研究證實miRNA-181a在人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞中低表達且以A549/DDP為甚，而高表達miRNA-181a可抑制A549/DDP的細胞活力、細胞周期、侵襲能力，提高順鉑作用下的生長抑制率和凋亡率，作用機制可能與抑制Bcl-2蛋白且促進P53蛋白表達有關(guān)。本研究表明miRNA-181a在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌作用，其可能會成為非小細胞肺癌治療的新靶點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Expression of miRNA-181a in human lung adenocarcinoma cells and its effect on cell function

ZHAO Duo, JIN Zhu, SONG Ya-ya, GAO Bao-an

(InstituteofRespiratoryDisease,ChinaThreeGorgesUniversity,DepartmentofRespiration,YichangCentralPeople’sHospital,Yichang443003,China.E-mail: 222xiaozhao@163.com)

AIM: To study the expression of microRNA (miRNA)-181a in different human lung adenocarcinoma cell lines, and to investigate the effect of miRNA-181a on cell function and its mechanism in human lung adenocarcinoma drug resistant cell A549/DDP. METHODS: Real-time PCR was used to detect the expression of miRNA-181a in BEAS-2B cells, A549 cells and A549/DDP cells. The A549/DDP cells were transfected with pGenesil-miRNA-181a eukaryotic expression plasmid. At the same time, the untransfection group and negative transfection group were also set up. The expression of miRNA-181a, cell viability, cell growth inhibition and apoptosis rate duringcis-diamminedichloroplatinum (DDP) treatment, cell cycle, cell invasion, the protein expression of miRNA-181a target genesbcl-2andp53 in the A549/DDP cells were determined by real-time fluorescence quantitative PCR, MTT assay, flow cytometry, Transwell method and Western blot, respectivly. RESULTS: The expression of miRNA-181a in A549 cells and A549/DDP cells was significantly lower than that in BEAS-2B cells, and the lowest expression level was observed in A549/DDP cells (P<0.05). The expression of miRNA-181a in A549/DDP cells was significantly increased after transfection with pGenesil-miRNA-181a (P<0.05). The cell viability, cell cycle and invasion ability of the A549/DDP cells were inhibited after miRNA-181a transfection (P<0.05). The cell growth inhibition rate and apoptotic rate of the A549/DDP cells were increased (P<0.05). The expression of Bcl-2 was reduced, but the expression of P53 was increased after transfection with miRNA-181a in A549/DDP cells (P<0.05). CONCLUSION: miRNA-181a may be correlated with the development of human lung adenocarcinoma. miRNA-181a can serve as a new target for treatment of lung cancer.

MicroRNA-181a; A549/DDP cell line; Cell cycle; Apoptosis; Cell invasion

1000- 4718(2016)08- 1395- 08

2015- 12- 24

2016- 05- 25

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.009

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