人源食管鱗狀細胞癌移植瘤模型的建立及其增殖信號通路特征*

金玉茜， 李 珂， 尹學善， 謝祎飛， 王艷紅， 趙四敏, 4， 江亞南, 2， 趙繼敏, 2，趙 松， 田 芳, 2， 路 靜, 2， 劉康棟, 2△， 董子明, 2△

(1鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450001； 2河南省癌癥化學預防協同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000；3鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052； 4漯河高等醫(yī)學?？茖W校，河南 漯河 462000)

人源食管鱗狀細胞癌移植瘤模型的建立及其增殖信號通路特征*

金玉茜1▲， 李 珂1▲， 尹學善1， 謝祎飛1， 王艷紅1， 趙四敏1, 4， 江亞南1, 2， 趙繼敏1, 2，趙 松3， 田 芳1, 2， 路 靜1, 2， 劉康棟1, 2△， 董子明1, 2△

(1鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450001；2河南省癌癥化學預防協同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000；3鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052；4漯河高等醫(yī)學?？茖W校，河南 漯河 462000)

目的： 構建人食管鱗狀細胞癌組織來源的移植瘤模型，并了解其病理學特征和增殖相關的信號通路活化情況。方法: 將人食管癌組織移植于重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下，待移植瘤長成后對其進行鼠間連續(xù)傳代。觀察第1、第2、第3代移植瘤的生長特性。并對患者腫瘤組織、第1代和第3代移植瘤進行HE染色和CK5/6、p63、p40免疫組織化學染色分析。Western blot實驗檢測4例所建立的移植瘤中mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、Akt1、p-Akt (Ser473)、Erk1/2和p-Erk1/2的表達情況。結果: 成功建立移植瘤模型，移植瘤生長穩(wěn)定并能連續(xù)傳代。各移植瘤組織病理組織類型和CK5/6、p63、p40表達陽性與患者腫瘤組織一致。而在不同病人來源的移植瘤組織中信號轉導通路蛋白的活化程度差異有統(tǒng)計學意義。結論: 成功建立了人食管鱗狀細胞癌組織來源的食管癌移植瘤模型，初步論證該模型能夠反映患者的病理特征。

食管癌； 人源移植瘤； 增殖相關信號通路

食管癌是世界上最常見的 6 種惡性腫瘤之一，尤其是在中國，食管癌的發(fā)病率和死亡率都居于世界上最高的國家之一，嚴重威脅人民生命健康。我國食管癌的主要病理類型是食管鱗狀細胞癌(eso-phageal squamous-cell carcinoma，ESCC)[1]，其侵襲性強并缺乏有效的治療策略，晚期具有極高的死亡率[2]，5年存活率只有20～40%。轉移性食管癌的患者在使用化療和藥物治療的情況下平均存活期不足 1 年[2]。

在抗癌藥物和治療方案的臨床研究中，動物模型發(fā)揮了重要的作用，合適的動物模型將會促進藥物的研發(fā)和有效的治療方案的制定[3]。研究發(fā)現，人腫瘤細胞系的異體移植模型預測性較差，在腫瘤靶向藥物的研究中存在一定的局限性[4]。主要原因是建立的細胞系不能充分代表腫瘤的多樣性和個體化，并且細胞系在多次體外處理和傳代后，其組織學特征和遺傳學特征會發(fā)生改變[4]。直接將患者的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠而建立的人源性腫瘤模型則可以克服上述缺點[5-6]，可以模擬腫瘤患者對化療方案的反應。因此，建立與臨床ESCC特征相似的人源性腫瘤模型對于進一步了解食管癌的發(fā)生機制和篩選分子靶標及評價個體化靶向治療的療效具有重要意義。目前國內外已報道人源性腫瘤動物移植瘤模型在肺癌、乳腺癌和結腸癌等研究領域發(fā)揮重要作用，得到的移植瘤模型與臨床腫瘤的特征相似，而對食管鱗狀細胞癌移植瘤模型卻報道較少，缺乏對其的深入研究和系統(tǒng)評價[7]。

在本研究中，我們在重度聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠皮下移植人食管鱗狀細胞癌組織，建立了多例能傳代并能保持人食管癌臨床組織特征的人源食管鱗狀細胞癌移植瘤模型(patient-derived esophageal squamous-cell carcinoma xenograft，PDECX),并對這些模型的病理特征進行評價，檢測其腫瘤信號轉導通路激酶的激活情況，為食管癌臨床篩選新的靶向藥物和評價個體化靶向治療方案的療效提供依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 病理組織標本 病理標本取自從2013年8月～2014年3月鄭州大學第一附屬醫(yī)院的食管癌外科手術中ESCC患者的腫瘤組織?；颊咝g前均未接受過放療和化療。ESCC樣本均在患者簽署鄭州大學研究倫理委員會批準的書面知情同意和研究協議后獲取。手術新鮮組織標本被分為3個部分：(1) 植入SCID小鼠體內進行模型構建; (2)4%甲醛固定，制作石蠟以病理檢查及免疫組織化學分析; (3) -80 ℃凍存，用于DNA / RNA的提取。

1.2 實驗動物 實驗研究使用平均體重18～20 g的6～8周雌性CB17/SCID小鼠，均購自北京維通利華動物實驗有限公司(動物合格證編號：11400700067581)。動物房配備可調控空調和燈光(12 h周期)以使小鼠在恒溫恒濕的環(huán)境下生長。一個無菌籠中飼養(yǎng)4～5只小鼠并提供充足的水和食物?；\具、墊料、飼料、飲水均經高壓蒸汽滅菌。所有實驗程序均嚴格按無菌操作規(guī)程進行。

2 方法

2.1 人食管癌組織來源的移植瘤模型的構建 ESCC病理標本在切除后90 min內在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中運送到實驗室。標本用含有青霉素和鏈霉素的PBS沖洗。用無菌手術刀切成3個或4個小塊用于移植(每塊大小約10～15 mm3)。事先用0.3 mL 0.4%戊巴比妥鈉溶液將小鼠麻醉，待其進入麻醉狀態(tài)后將每塊腫瘤組織于頸背部以皮下植入的方式移植到SCID小鼠上，1只小鼠接種1塊腫瘤。移植之后，每周測量1次小鼠體重和腫瘤的大小。當腫瘤體積達到1 500 mm3后，將小鼠處死，于75%乙醇中浸泡，解剖并剝離該腫瘤(此為患者的第1代腫瘤組織)，給其拍照和稱重，再將此腫瘤切成3個或4個小塊(同前)移植到新1代的SCID鼠上(此為第2代移植瘤)。當移植瘤被穩(wěn)定傳代至3代或3代以上時則認為PDECX成功建立。

2.2 腫瘤生長的測量 移植瘤的大小用游標卡尺每周測量1次。腫瘤體積的計算使用公式V = LD×SD2/2，其中V是腫瘤體積，LD是腫瘤的最長直徑，SD是腫瘤的最短直徑。測量的腫瘤體積數據用于描繪腫瘤生長曲線。

2.3 病理組織學評估和免疫組織化學鑒定 所有構建成功的PDECX腫瘤組織離體后立刻被置于4%甲醛中固定24 h，隨后轉移至70%乙醇進行脫水處理，再用石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，通過HE染色進行病理學評價，同一連續(xù)切片用枸櫞酸鈉修復液進行抗原修復，再用鼠抗人CK5/6、p63和p40(1∶50)單抗4 ℃孵育過夜，第2天孵育 II抗(鼠IgG2a)，檢測組織中CK5/6、p63和p40的表達。所有結果均使用Olympus顯微鏡觀察。

2.4 Western blot實驗 液氮研磨移植瘤組織，用裂解液使組織裂解得到組織總蛋白，12 000 r/min離心組織蛋白15 min。取總蛋白50 μg于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離并轉移至聚乙烯二氟(PVDF)膜。隨后用含5%脫脂牛奶的1×TBST室溫封閉膜1 h，將膜置于I 抗稀釋溶液中4 ℃孵育過夜(anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-p70S6K、anti-p-p70S6K、anti-Akt1、anti-p-Akt (Ser473)、anti-Erk1/2和anti-p-Erk1/2的稀釋度均為1∶1 000)。II抗HRP-IgG在室溫下作用2 h，加ECL顯影。用曝光系統(tǒng)掃描膜，并用ImageJ軟件進行蛋白質條帶灰度的定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據處理，組間比較采用單因素方差分析，用方差齊性檢驗結果來表示組間差異，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 人組織源性食管鱗狀細胞癌移植瘤模型的建立

我們進行了15例ESCC病理組織的接種和傳代，其中成功建立移植瘤模型并穩(wěn)定傳代共8例，成功率53.33%。成功建立移植瘤模型的小鼠如圖1所示。成功建立的移植瘤模型均可以穩(wěn)定傳代，其第1代(P1)和第2代(P2)移植瘤生長較緩慢，自第3代(P3)及以后移植瘤生長速度較快并穩(wěn)定。其中病例1號移植瘤腫瘤體積生長曲線如圖2所示，P1、P2和P3的生長時間分別為91 d、91 d和62 d。

2 PDECX模型與患者原始腫瘤的病理特征和免疫組織化學的鑒定比較

通過HE染色和免疫組織化學方法比較患者病理組織與移植瘤組織的病理特征、鱗狀細胞癌標志蛋白的表達情況，其中2號病例移植瘤與原患者腫瘤組織對比結果如圖3所示。HE染色顯示患者腫瘤組織(P0)中有不同程度的角化珠出現，細胞間可見細胞間橋，而P1和P3代移植瘤組織與患者腫瘤組織的病理分化程度基本一致。CK5/6、p40和p63染色結果提示各項指標在P0、P1和P3腫瘤組織中均呈現出陽性表達，結果具有一致性。

3 Western blot檢測移植瘤信號轉導通路相關蛋白

用Western blot實驗檢測移植瘤組織中的主要腫瘤信號轉導通路的激活情況，包括mTOR、Akt、p70S6K和Erk1/2的蛋白總量和磷酸化水平，其結果如圖4所示。每一例移植瘤組織的各種信號轉導通路蛋白激活情況并不相同，磷酸化的mTOR蛋白在4、6號病例移植瘤中的水平較高，而在3、5號病例移植瘤中幾乎測不出；磷酸化的p70S6K蛋白在6號病例移植瘤中幾乎測不出，而在其余3例中有不同程度的檢出；磷酸化的Akt (Ser473)在4號病例移植瘤中水平較高，在6號病例移植瘤中水平很低；磷酸化的Erk1/2蛋白在這4例移植瘤組織中均存在，但其含量各有不同。經方差分析顯示，各例移植瘤磷酸化mTOR、P70S6K、Akt和Erk1/2均有顯著差異(P<0.01)。每一例移植瘤取3個組織塊檢測以上信號通路蛋白水平，共檢測3次，取3次平均值作圖。

Figure 1.A tumor-bearing mouse of a successful ESCC xenograft.

圖1 成功建立ESCC移植瘤模型的荷瘤小鼠

Figure 2.Growth curves of the ESCC xenografts in the SCID mice.

圖2 SCID小鼠體內ESCC移植瘤的腫瘤體積生長曲線

Figure 3.The histological images of the original patient’s tumors and the first passage and third passage xenografts from sample No.2. The top row images showed histological sections (HE) of the esophageal patient tissue (P0), the first (P1) and the third passage (P3) xenograft tissues in the SCID mice. The second, third and last row of images showed immunohistochemistry for CK5/6, p40 and p63 in the esophageal patient tissue (P0), and the first (P1) and third passage (P3) xenograft tissues, respectively.

圖3 2號病例患者原始腫瘤組織與第1代和第3代移植瘤的組織學比較結果

討 論

食管癌一種具有高死亡率的癌癥,其發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多途徑、多階段發(fā)展演進模式[8]。目前食管鱗狀細胞癌治療的基本方法仍然是手術。使用放化療聯合的治療方法及新輔助化療雖然在臨床試驗中得到了進展，但治療效果仍然有限[9-10]。此外，使用西妥昔單抗與放化療結合的治療方法在IB/II期的臨床試驗中取得進展[11]，但在之后IIB/III期的臨床試驗中卻沒有成功[12]。而其它食管鱗狀細胞癌的新治療藥物的療效仍處于研究過程中[13-14]。因此，目前臨床上對于食管鱗狀細胞癌的治療依然沒有好的靶向治療方案。

食管癌細胞系的異體移植模型在藥物篩選和機制研究上有所應用[15-16]，但這些細胞系有著因長時間的體外培養(yǎng)而失去原始腫瘤特征的問題。此外，大多數食管癌細胞系是食管腺癌來源，這與中國患者以ESCC的病理特征為主的情況不相符。人源性移植瘤模型是直接將新鮮人腫瘤組織接種到免疫缺陷小鼠中而建立起來的，這與傳統(tǒng)人癌細胞系建立的腫瘤動物模型相比，可以更好地保持人腫瘤組織的原始生物學特征和組織學特征，可以反映患者的遺傳多樣性[17]。因此，建立臨床相關的ESCC動物異種移植腫瘤模型是及其必要的。本研究建立的是一組中國病人來源的ESCC異種移植小鼠模型，為篩選臨床新藥物和選擇有效的臨床治療方法提供臨床前平臺。

Figure 4.Activated mTOR, Akt, p70S6K and Erk1/2 in the established esophageal tumor xenografts determined by Western blot. Mean±SD.n=3.

圖4 已建立食管癌移植瘤組織的信號通路磷酸化表達情況，包括mTOR、Akt、p70S6K和Erk1/2

在本實驗中，成功建立了移植瘤模型，并且移植瘤生長情況在第3代及以后保持穩(wěn)定，這與國內外其它研究中肺癌和乳腺癌等移植瘤模型的生長情況一致[18]。在免疫組織化學鑒定中，本實驗檢測了CK5/6、p40和p63蛋白的表達情況。CK5/6被用于從肺癌中區(qū)分上皮樣的間皮癌。p40由p63基因編碼翻譯，選擇性強，因此其診斷的特異性好。p63蛋白在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其通過Akt蛋白激酶信號通路控制細胞周期以使食管鱗狀細胞癌細胞增殖[19]。臨床上檢測p63的表達水平用于ESCC的確診以及預后評估[20]。在我們的實驗中，根據組織學和免疫組化鑒定中各個移植瘤組織切片的CK5/6、p40和p63染色結果顯示P3腫瘤組織與患者原代腫瘤組織的染色情況即表達水平均為基本一致，這表明了ESCC移植瘤模型保留了與其原代即人腫瘤組織一致的組織病理學特征。因此可證明，我們使用最小限度的患者腫瘤組織成功地建立了ESCC的異種移植腫瘤模型。

ESCC的化療有許多副作用，需要更多創(chuàng)新和有效的治療策略。然而，ESCC腫瘤發(fā)生的分子機制還沒有被完全闡明。許多信號通路參與ESCC的細胞生長、凋亡以及血管的生成和侵襲[21-22]，例如Akt/mTOR、Erk1/2信號通路。現已發(fā)現Akt在食管腫瘤中具有比在相應的正常組織中更強的持續(xù)活性。mTOR信號通路對于ESCC的增殖和轉移至關重要[23]，因此Akt/mTOR信號通路可能是一個治療食管癌患者的有效治療靶向。檢測移植瘤模型中信號轉導通路的磷酸化情況則可以反映出ESCC患者腫瘤組織信號轉導通路的活化情況，為將來患者是否能夠采取靶向治療及預測療效建立實驗平臺。因此，本研究檢測了4例移植瘤組織中細胞轉導通路蛋白mTOR、Akt、p70S6K和Erk1/2的表達和磷酸化情況。本實驗中Akt和p-Akt、mTOR和p-mTOR檢測結果顯示，病例4號移植瘤組織中p-mTOR和p-Akt的表達水平均高于其它3例，因此我們可以從各例腫瘤組織中挑擇出Akt/mTOR通路蛋白高磷酸化水平的腫瘤組織，以用于進一步研究ESCC中Akt/mTOR通路作用和評價該通路抑制劑的效果。在PI3K/Akt/mTOR信號通路中，活化的mTOR通過磷酸化蛋白翻譯過程中的某些因子來參與多項細胞功能，其中最主要的是4EBP1和p70S6K。在這4例移植瘤中，p70S6K的磷酸化水平均有不同，在病例6號移植瘤中幾乎不表達。細胞外信號調節(jié)激酶Erk1/2信號通路是調控細胞生長的重要通路[24]。Erk1/2的磷酸化可通過針對不同的調節(jié)因子控制轉錄以誘導增殖、分化和防止細胞凋亡[25]。我們的結果顯示這4例腫瘤中p-Erk1/2在病例5號和病例6號中幾乎不表達，而在病例4號腫瘤中卻表達很高。因此，像原始患者腫瘤組織一樣，PDECX中各移植瘤瘤組織雖然有著相同或者相似的病理特征，卻存在著不同信號轉導通路的激活，這可以從一定程度上解釋臨床食管癌患者為何對一線化療方案反應敏感性不同，進而為臨床篩選新的靶向藥物和評價個體化靶向治療療效提供平臺。

綜上所述，人源性移植瘤模型的建立模擬了臨床人食管鱗狀細胞癌的病理特征，是一種較為理想的人腫瘤動物模型[17, 26]。在本研究中，我們成功地建立了多例中國患者來源的ESCC移植瘤模型，所建立的腫瘤模型能穩(wěn)定傳代并保持患者腫瘤組織的病理特征。同時，ESCC腫瘤中信號轉導通路不同的激活情況也反映了患者群體中的個體差異性。因此這些移植瘤模型為研究ESCC的分子機制以及闡明食管癌腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關鍵信號通路提供了一個重要的平臺，而且移植瘤模型還可用于篩選人食管癌靶向藥物和評價臨床食管癌治療方案的合理性，為臨床進一步開展患者個體化治療提供了臨床前平臺。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Establishment of patient-derived esophageal squamous-cell carcinoma xenograft in mice and characteristics of signaling pathways related to proliferation in SCID mice

JIN Yu-xi1, LI Ke1, YIN Xue-shan1, XIE Yi-fei1, WANG Yan-hong1, ZHAO Si-min1, 4, JIANG Ya-nan1, 2, ZHAO Ji-min1, 2, ZHAO Song3, TIAN Fang1,2, LU Jing1, 2, LIU Kang-dong1, 2, DONG Zi-ming1, 2

(1SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;2HenanProvincialCooperativeInnovationCenterforCancerChemoprevention,Zhengzhou450000,China;3DepartmentofThoracicSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;4LuoheMedicalCollege,Luohe462000,China.E-mail:kdliu@zzu.edu.cn；dongzm@zzu.edu.cn)

AIM: To establish and characterize the patient-derived esophageal squamous-cell carcinoma xenograft (PDECX) in mice. METHODS: The samples of human esophageal cancer were grafted into severe combined immunodeficient (SCID) mice. The xenografts were transferred to SCID mice when the first passage of xenografts grew up. The growth of tumors in the first, second and third passages was observed. HE staining was performed. The expression of CK5/6, p63 and p40 in the patient samples, and the first and third passages of the xenografts were detected by immunohistochemical analysis. The expression of mTOR, p-mTOR, p70S6K, p-p70S6K, Akt1, p-Akt (Ser473), Erk1/2 and p-Erk1/2 were determined by Western blot.RESULTS: The PDECX was successfully established. The positive expression of CK5/6, p63 and p40 in the xenografts was consistent with that in the patients’ samples. The levels of phosphorylated and total proteins of proliferation-related signaling pathways were different in the xenografts from different patients.CONCLUSION: The PDECX model adequately reflects the tumal heterogeneity that is observed in the patients.

Esophageal carcinoma; Patient-derived tumor xenograft; Proliferation-related signaling pathway

1000- 4718(2016)08- 1450- 07

2015- 11- 16

2016- 04- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81372269； No. 81572812)；河南省高校創(chuàng)新人才項目(No. 13HASTIT022)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(No. 201410459075)

R730.23; R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.019

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 劉康棟 Tel: 15036033760; E-mail: kdliu@zzu.edu.cn； 董子明 Tel: 13903811199; E-mail: dongzm@zzu.edu.cn

▲并列第1作者