鹿茸水提物減輕順鉑所致的小鼠腎損傷*

董思敏， 王海璐， 王全凱△， 張 晶△

(1吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118; 2長白山制藥股份有限公司，吉林 吉林 132100)

鹿茸水提物減輕順鉑所致的小鼠腎損傷*

董思敏1,2， 王海璐1， 王全凱1△， 張 晶1△

(1吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118;2長白山制藥股份有限公司，吉林 吉林 132100)

目的： 探討梅花鹿二杠茸和三岔茸水提物對順鉑(CDDP)所致小鼠腎損傷的影響。方法: 采用灌胃給藥方式，用順鉑(15 mg/kg)誘導小鼠腎損傷模型，測定小鼠腎臟指數(KI)、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量，并對腎臟組織進行HE染色，觀察腎臟病理學變化，研究梅花鹿二杠茸和三岔茸的水提物各劑量對小鼠腎損傷的影響。結果: 與順鉑組相比，各劑量鹿茸水提物可顯著降低CDDP誘導腎損傷小鼠SCr、BUN水平及腎臟MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性(P<0.05)；明顯改善腎組織病理學形態(tài)，減輕CDDP對腎小管上皮細胞的損傷程度，且同等濃度下，與三岔茸相比，二杠茸水提物能更好地改善腎功能及減輕病理損傷。結論: 鹿茸水提物減輕順鉑引起的小鼠腎損傷，其作用機制可能與鹿茸水提物增強小鼠腎臟組織的抗氧化能力有關。

鹿茸水提物； 順鉑； 腎毒性； 抗氧化作用

鹿茸為鹿科動物梅花鹿(CervusnipponTemminck)或馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角?；谷壮蕡A柱狀分枝，具一個分枝者習稱“二杠”，具二個分枝者，習稱“三岔”。鹿茸作為我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效[1]。

順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床化療最常用的藥物之一[2]，但其在腎組織內的蓄積可引起腎損傷[3]，其療效與用藥劑量成正比[4]。腎毒理學研究認為CDDP腎損傷主要與氧化應激機制有關[5]，其臨床應用劑量受到限制[6]。據報道，鹿茸水提物具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等作用[7]，其是否對CDDP誘導腎損傷有影響則未見報道。本研究旨在比較二杠茸和三岔茸水提物對CDDP腎毒性小鼠腎功能、腎組織形態(tài)學和氧化指標的影響，為鹿茸在CDDP腎毒性治療中的應用提供可靠的理論依據。

材 料 和 方 法

1 動物及實驗材料

64只清潔級健康ICR雄鼠(長春市億斯實驗動物技術有限責任公司)，體重(20±2)g。小鼠室溫飼養(yǎng)，每天更換墊料1次，自由飲食飲水。

梅花鹿二杠茸和三岔茸于2014年采購于吉林省吉云集團鹿產品加工有限責任公司，經吉林農業(yè)大學中藥材學院王全凱教授鑒定為梅花鹿(CervusnipponTemminck)茸。將鹿茸粉碎過80目篩，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑及儀器

順鉑(上海思域化工科技有限公司，純度>99%，pt>65%)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum crea-tinine，SCr)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射液(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司)；中性樹膠封片劑(武漢百浩天生物科技有限公司)；高效切片石蠟(上海華永石蠟有限公司)；無水乙醇、甲醛、二甲苯、蘇木素、伊紅，均為分析純。

TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；XSP-BM-8CA生物顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)；石蠟切片機(Leica)；DG5033A型酶聯免疫檢測儀(北京華運安特科技有限責任公司)；KQ-250DB臺式數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；1 mL無菌注射器配灌胃針頭(江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司)。

3 主要方法

3.1 給藥組溶液的配制 準確稱取二杠茸粉末及三岔茸粉末各10 g，分別置于錐形瓶內，以水為溶劑，室溫下超聲提取2次，每次用水100 mL，超聲提取0.5 h，過濾，合并提取液，將提取液冷凍干燥，即得二杠茸水提物和三岔茸水提物。精密稱取2種水提物各1 g、2 g和4 g，分別溶于100 mL水中，即得各樣品的低劑量(low dose, L;100 mg/kg)、中劑量(medium dose, M;200 mg/kg)和高劑量(high dose, H;400 mg/kg)。二杠茸水提物各劑量組分別為DL、DM和DH組；三岔茸水提樣各劑量組分別為TL、TM和TH組。

3.2 CDDP溶液的配制 精密稱取CDDP 31.5 mg溶于21 mL氯化鈉注射液中，配制成1.5 g/L濃度的CDDP溶液，超聲30 min，使其充分溶解，得模型組溶液。

3.3 實驗動物分組及給藥 將實驗動物飼養(yǎng)1周調節(jié)其適應性，隨機分為8組，每組8只，灌胃(intragastric administration，ig)方式給藥，每次用藥體積均為0.01 mL/g?？瞻讓φ战M(control group，Con)和CDDP組第 1～8天均給予與給藥組等量的生理鹽水，每天1次；給藥組每天按照劑量ig給藥1次，連續(xù)給藥7 d，第8天正常喂養(yǎng)，并于第9天給藥1 h后對給藥組和CDDP組均單次ig CDDP溶液(15 mg/kg)。給予CDDP 72 h后解剖，解剖前12 h對小鼠禁食不禁水，按照給藥、造膜順序依次對各組小鼠進行眼球取血，4 000 r/min離心10 min分離血清，4 ℃保存待檢測主要腎功能指標；沿腹中線迅速解剖，用生理鹽水沖洗腎組織，濾紙吸干，稱重，于10%的甲醛溶液中固定5d，進行HE染色，觀察腎臟組織病理學改變。

3.4 觀察小鼠狀況及指標檢測 每天按照固定時間給藥后稱重，觀察小鼠狀態(tài)、毛色和活動情況，記錄各組小鼠攝食量、飲水量及體重變化，并按照公式：腎臟指數(kidney index，KI；%)=腎臟重量(g)/體重(g)×100%，計算各組小鼠腎臟指數。

BUN含量采用脲酶法，SCr含量采用肌氨酸氧化酶法，SOD活性測定采用WST-1法，GSH-Px活性測定采用微量酶標法, MDA含量測定采用TBA法，均嚴格按照試劑盒使用方法進行操作。

3.5 腎組織HE染色 將置于10%的甲醛溶液中固定的左腎臟組織取出，沿冠狀面切成兩半，將4 mm×3 mm×3 mm大小的腎塊置于包埋盒中，經流動水沖洗以除去甲醛，按照低濃度至高濃度乙醇脫水，二甲苯透明，置于60 ℃的軟蠟Ⅰ、Ⅱ及硬蠟Ⅰ、Ⅱ，將浸蠟的腎組織放入裝有熔化石蠟的包埋鐵盒內，晾干。石蠟切片機切片(片厚5 μm)，于30 ℃水浴鍋內展開后于80 ℃烘箱烘烤2 h，再進行HE染色，用中性樹膠封片，于光學顯微鏡(×400)下觀察腎臟組織細胞數量、形態(tài)、細胞間質等腎臟結構病理學改變并攝片。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 小鼠的一般情況

小鼠給予CDDP當天便出現攝食量和飲水量下降、活動量減少、體重減輕、卷曲拱背、精神稍有萎靡、形體消瘦、活動遲緩、毛色失澤等現象，而Con組生長情況良好，飲食正常，反應靈敏，無上述現象。治療組基本無上述現象，諸癥有所減輕，反應較靈敏。

2 鹿茸水提物對CDDP致小鼠腎損傷腎臟指數影響

腎臟指數是反映腎臟損傷程度的客觀指標，與Con組相比，CDDP組小鼠腎指數顯著升高(P<0.05)，體重減輕，腎臟有膨大現象，發(fā)生急性水腫，代謝器官受損嚴重；各給藥組小鼠腎指數趨于Con組水平而顯著低于CDDP組(P<0.05)。給藥組隨用藥劑量加大，腎指數依次減小，表現出一定的劑量依賴關系，同等濃度二杠茸水提物對CDDP引起的腎損傷減輕程度明顯優(yōu)于三岔茸水提物，見圖1。

Figure 1.The effect of the aqueous extract of velvet antler on kidney index (KI) of the mice treated with cisplatin. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsCDDP group.

圖1 鹿茸水提物對小鼠腎臟指數的影響

3 鹿茸水提物對接受CDDP灌胃小鼠BUN和SCr含量的影響

與Con組相比，給予CDDP后，CDDP組小鼠BUN和SCr含量明顯升高(P<0.05)，說明造模成功；各劑量鹿茸水提取物給藥組與CDDP組相比， BUN和SCr的含量均有所下降，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，且存在劑量依賴關系,說明鹿茸水提物能減輕CDDP誘導小鼠急性腎損傷，且同等濃度下二杠茸水提物作用效果優(yōu)于三岔茸水提物，見圖2。

4 鹿茸水提物對接受CDDP灌胃小鼠腎組織中SOD、MDA和GSH-Px的變化

與Con組相比，CDDP組小鼠腎組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)；而各給藥組小鼠腎組織中SOD和GSH-Px活性與CDDP組相比均有所升高，MDA含量有所下降，除DL、TM和TL組外，其余各組的SOD活性與CDDP組相比差異均具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；除TL組外，其余各組的GSH-Px活性與CDDP組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；各劑量鹿茸水提取物給藥組的MDA含量與CDDP組相比差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，表明二杠茸、三岔茸水提物都能顯著抑制順鉑引起的腎臟組織 SOD、GSH-Px活性下降和MDA 含量升高；且作用強度存在劑量依賴關系，同等濃度下二杠茸水提物作用效果優(yōu)于三岔茸水提物，見圖3。

Figure 2.The effects of the aqueous extract of velvet antler on BUN and SCr levels in the mice treated with CDDP. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsCDDP group.

圖2 鹿茸水提物對CDDP所致小鼠血清BUN、CRE含量的影響

Figure 3.The effects of the aqueous extract of velvet antler on the activitiy of SOD and GSH-Px, and the content of MDA in the mice treated with CDDP. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsCDDP group.

圖3 鹿茸水提物對CDDP所致小鼠腎組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

5 腎組織HE染色觀察

在分別給予生理鹽水、鹿茸水提物或CDDP 72 h后，觀察8組小鼠腎臟組織的病理改變。結果發(fā)現Con組小鼠的腎組織結構清晰，腎小管排列規(guī)則，腎間質及腎小球無充血和炎細胞浸潤；CDDP組與Con組相比則出現大面積壞死區(qū)域，細胞排列疏松、紊亂，刷狀緣消失，部分細胞核消失，腎小管出現明顯的萎縮、擴張，壞死的腎小管上皮細胞明顯增多，腎近曲小管上皮細胞有空泡變性、壞死，胞質疏松，局部細胞壞死，管腔可見脫落上皮細胞，腎小管出現蛋白管型，管腔狹窄，出現典型的急性腎損傷病理表現；各劑量鹿茸水提取物給藥組小鼠的腎組織病理損害明顯減輕，隨著鹿茸水提物濃度的增加，腎損傷程度減輕，細胞核明顯增多，聚集現象減輕，細胞排列逐漸規(guī)則，腎小管萎縮程度逐漸減輕，壞死的腎小管上皮細胞明顯減少，空泡變性明顯減少，細胞排列較規(guī)則，胞質疏松程度減少，腎小球和腎小管結構逐漸趨于完整，同等濃度二杠茸水提物作用效果優(yōu)于三岔茸水提物，見圖4。

Figure 4.HE staining of the renal tissues in the mice (×400).

圖4 小鼠腎組織HE染色觀察

討 論

中醫(yī)學認為，CDDP腎毒性屬中醫(yī)“藥毒”、“腎虛”范疇。CDDP毒性的本質是腎的精氣不足[8]。采用CDDP等腎毒性藥物化療會造成機體組織的損傷[9]，減少腎小球濾過率，升高BUN和SCr水平[10]，引起腎血管收縮、腎功能損害等癥狀；其主要靶位是腎小管上皮細胞[11]，早期往往首先損害腎近曲小管，導致腎小管細胞結構和功能紊亂等病理改變[12]。西醫(yī)多通過選擇給藥時間、控制給藥速度和改變給藥途徑等方法緩解CDDP腎毒性，下午或者傍晚使用CDDP對腎臟的損傷程度最小，毒性最低，這與機體對藥物的生物處理和反應呈現出的時間依賴性有關[13]。

機體過量產生活性氧被認為是化療藥物毒副作用的根源[14]。通常情況下，SOD可通過歧化作用清除CDDP代謝過程所產生的氧自由基，保護細胞免受超氧化物自由基的損傷[15]。GSH-Px是體內重要的保護酶類，在細胞保護酶系統(tǒng)中的作用是清除氧自由基[16]，能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[17]。脂質過氧化主要產物MDA，其含量變化可反映體內自由基代謝的異常及脂質過氧化速率，因此，MDA含量高低既反映機體脂質過氧化的程度，也間接反映受自由基攻擊致腎損害的嚴重程度[18]。在本實驗中，CDDP組小鼠腎組織中的SOD及GSH-Px活性降低，而MDA含量明顯升高，CDDP促進腎組織脂質過氧化形成，使體內抗氧化能力降低，體內不能清除過多的自由基，從而促進了氧化應激，加重了腎損傷[19]。

鹿茸水提物可通過清除氧自由基、對抗脂質過氧化反應來減輕CDDP所致的腎功能損傷，促進腎小管的修復。結果表明，預先給予鹿茸水提物能顯著抑制CDDP所致的脂質過氧化，改善了體內的抗氧化能力，減輕了CDDP對腎臟的氧化損傷。鹿茸水提物的抗氧化作用可能是其減輕CDDP所致小鼠腎臟損傷的重要機制，其中所含的多糖和蛋白質的抗氧化作用可能也是其增效減毒作用的藥理作用物質基礎，且二杠茸水提物的藥效優(yōu)于三岔茸，為梅花鹿茸在臨床上的應用提供了新的理論依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Protective effect of aqueous extract of velvet antler on cisplatin-induced nephrotoxicity in mice

DONG Si-min1,2, WANG Hai-lu1, WANG Quan-kai1, ZHANG Jing1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2ChangbaishanPharmaceuticalCo.Ltd,Jilin132100,China.E-mail:zhjing0701@163.com; 13944125038@163.com)

AIM: To study the protective effect of aqueous extract of 2-branched and 3-branched velvet antler on cisplatin (CDDP)-induced nephrotoxicity in mice. METHODS:The mouse model of renal injury was induced by intragastric administration of CDDP at the dose of 15 mg/kg. After treatment, kidney index (KI), serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), the activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), and the content of malondialdehyde (MDA) in the kidney were determined. The renal pathological changes were observed with HE staining. RESULTS: Aqueous extract of velvet antler at the tested dose markedly decreased BUN, SCr and the content of MDA, and elevated the activity of SOD and GSH-Px in the mice pretreated with CDDP (P<0.05). The pathological changes of the renal tissues were improved obviously, and the injury of the epithelial cells of renal tubules was mitigated. The effect of the aqueous extract of 2-branched velvet antler on renal function and cisplatin-induced nephrotoxicity was better than that of 3-branched one at the same concentration. CONCLUSION: The aqueous extract of 2-branched and 3-branched velvet antler has a certain protective effect on cisplatin-induced nephrotoxicity, which may be associated with increasing the anti-oxidative capability of mouse renal tissue.

Aqueous extract of velvet antler; Cisplatin; Nephrotoxicity; Anti-oxidation

1000- 4718(2016)08- 1466- 05

2016- 01- 11

2016- 06- 13

吉林省科技計劃發(fā)展項目(No. 20140204063YY； No. 20130102058JC)

R285.5； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.022

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 張晶 Tel： 0431-84533358; E-mail： zhjing0701@163.com; 王全凱Tel： 0431-84533087; E-mail： 13944125038@163.com