慢病毒載體介導(dǎo)的降鈣素基因相關(guān)肽轉(zhuǎn)染對心臟干細(xì)胞活力的影響*

榮季冬， 李 玲， 龍仙萍， 鄧文文， 石 蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

慢病毒載體介導(dǎo)的降鈣素基因相關(guān)肽轉(zhuǎn)染對心臟干細(xì)胞活力的影響*

榮季冬， 李 玲， 龍仙萍， 鄧文文， 石 蓓△

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

目的： 探討攜帶降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的慢病毒體外轉(zhuǎn)染對大鼠c-kitpos心臟干細(xì)胞(c-kit+CSCs)活力的影響。方法: 無菌條件下取出SD大鼠的心耳，采用酶消化法結(jié)合免疫磁珠法獲取c-kit+CSCs，并通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定；將攜帶目的基因的重組慢病毒載體(Lv-EGFP-CGRP)及空病毒載體(Lv-EGFP)分別轉(zhuǎn)染至c-kit+CSCs，實驗分為3組： Lv-EGFP-CGRP-CSCs組、Lv-EGFP-CSCs組和CSCs組；在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，采用流式細(xì)胞技術(shù)測定其轉(zhuǎn)染率，采用ELISA測定各組培養(yǎng)上清液中CGRP的濃度，采用CCK-8法檢測慢病毒轉(zhuǎn)染對c-kit+CSCs活力的影響。結(jié)果: 成功分離培養(yǎng)獲取c-kit+CSCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定顯示其高表達c-kit(為91.0%)，低表達CD45及CD34；成功轉(zhuǎn)染慢病毒的大鼠c-kit+CSCs可表達綠色熒光，48 h后可穩(wěn)定表達，感染復(fù)數(shù)(MOI)值為20時，熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)染率達80%以上；ELISA結(jié)果示，Lv-EGFP-CGRP-CSCs組細(xì)胞上清液CGRP分泌量較Lv-EGFP-CSCs組和CSCs組增加(P<0.01)； CCK-8檢測細(xì)胞活力的結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染不影響c-kit+CSCs的活力。結(jié)論: 攜帶CGRP的慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染至c-kit+CSCs，轉(zhuǎn)染Lv-EGFP-CGRP后的c-kit+CSCs可合成和分泌CGRP蛋白至上清液中，且轉(zhuǎn)染后c-kit+CSCs的活力未受影響。這為基因工程細(xì)胞療法治療心肌梗死提供了新的理論及實驗依據(jù)。

降鈣素基因相關(guān)肽； 慢病毒載體； 心臟干細(xì)胞； 細(xì)胞活力

c-kit+心臟干細(xì)胞(c-kitposcardiac stem cells，c-kit+CSCs)具有心臟組織的特異性，有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的潛能，被認(rèn)為可能是細(xì)胞移植治療心肌梗死最理想的種子細(xì)胞[1-3]。但干細(xì)胞移植治療心肌梗死仍面臨著諸多問題，如移植存活率低，在體內(nèi)增殖、分化為有功能的細(xì)胞少，使其修復(fù)心肌的能力受到限制，遠(yuǎn)達不到預(yù)期療效。細(xì)胞基因修飾的方法可在一定程度上提高干細(xì)胞功能，從而改善預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)有抗炎、調(diào)節(jié)免疫及炎性反應(yīng)、抗凋亡作用。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)CGRP可調(diào)節(jié)急性心肌梗死后的炎癥環(huán)境，從而改善梗死后心功能[4-5]。故本實驗將攜帶CGRP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至大鼠c-kit+CSCs使其過表達CGRP，并觀察其對細(xì)胞活力的影響，以期為c-kit+CSCs移植治療心肌梗死提供新的思路，并為進一步的體內(nèi)研究打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

HAM’S/F-12培養(yǎng)液、胎牛血清(HyClone)；胰蛋白酶(Gibco)；雙抗(Solarbio)；大鼠重組(人)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，rhbFGF)(Peprotech)；包被羊抗兔 II 抗的磁珠(Dynal Biotech)；兔抗大鼠c-kit抗體(Biorbyt)；APC標(biāo)記羊抗兔 II 抗(Advansta)；PE標(biāo)記小鼠抗大鼠CD45和PE標(biāo)記小鼠抗大鼠CD34(Biolegend)；過表達CGRP的慢病毒載體(Lv-EGFP-CGRP)和僅含增強型GFP的慢病毒載體(Lv-EGFP)(上海英為信公司)；細(xì)胞計數(shù)CCK-8試劑盒(上海碧云天生物公司)；CGRP ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠c-kit+CSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 參考課題組前期實驗[6]，取健康清潔SD大鼠(體重50～100 g)的左、右心耳， 在含有HAM’S/F-12培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中減碎組織(大小約1 mm3)， II型膠原酶(將其用HAM’S/F-12培養(yǎng)液稀釋成1 g/L)消化(37 ℃水浴箱，40 min)，離心(1 200 r/min，5 min)，去上清，再加入F12完全培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，至37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液 1 次；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至80%～90%時采用磁珠分選以獲取c-kit+CSCs，分選出的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，最后采用流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs及其細(xì)胞上清CGRP的檢測 取磁珠分選后的細(xì)胞，按每孔(3～5)×104個的細(xì)胞密度接種于24孔板中，37 ℃孵箱過夜，后吸走培養(yǎng)基(如果細(xì)胞生長良好、密度適宜，可不用換液)，再每孔加入1% 胎牛血清培養(yǎng)基500 μL，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值不同(5、10、20和40)分組滴加Lv-EGFP-CGRP及Lv-EGFP病毒液，混勻后培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2孵育過夜或24 h后更換成正常的培養(yǎng)基，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，并人工計數(shù)轉(zhuǎn)染率(每組3個復(fù)孔，每孔至少計數(shù)3個視野)；然后將計數(shù)為最佳MOI的細(xì)胞消化、離心，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗后重懸，用流式細(xì)胞術(shù)進一步檢測其轉(zhuǎn)染率。

用Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP分別轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs(Lv-EGFP-CGRP-CSCs組和Lv-EGFP-CSCs組)，以單純CSCs(CSCs組)作對照。通過ELISA檢測CGRP修飾CSCs的培養(yǎng)上清中CGRP濃度：取磁珠分選后的細(xì)胞按5×105個的細(xì)胞密度接種于6孔板中，用MOI=20的Lv-CGRP轉(zhuǎn)染CSCs 48 h并穩(wěn)定表達后，棄培養(yǎng)基、PBS沖洗3次，重新加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清行ELISA檢測。按照說明書操作，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值。

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染后對c-kit+CSCs細(xì)胞活力的影響 將磁珠分選后的細(xì)胞按5×103個細(xì)胞密度接種于96孔板中，過夜后進行Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP病毒轉(zhuǎn)染24 h后，每天分別取3組(每組6孔)行CCK-8實驗，連續(xù)6 d。將檢測孔中培養(yǎng)液吸掉，每孔加入100 μL F12完全培養(yǎng)基及10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h后于紫外分光光度計取波長450 nm進行比色，測定各孔A值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有參數(shù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間采用單因素方差分析和 Bonferroni校正的t檢驗檢測組間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠c-kit+CSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

心耳組織塊經(jīng)過酶消化離心后獲得的單細(xì)胞懸液接種到 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2 d后換液可見少量細(xì)胞貼壁生長，散在呈橢圓形或短棒狀；培養(yǎng)至1周左右貼壁較好，細(xì)胞呈三角形、梭形、多角形。貼壁后快速向四周擴增生長，大約 13 d 可達到 80%～90%的融合。磁珠分選后3 d左右可見少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞表面仍可見單個或多個磁珠，大約10 d可達到 80%～90%的融合，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞表達c-kit的陽性率為91.0%，CD45陽性率4.5%，CD34陽性率4.0%，符合CSCs的表型特征，見圖2。

Figure 1.Culture of rat CSCsinvitro. A: primary cells cultured for 13 d (×100); B: the cells were selected by magnetic beads for 3 d (×200); C: the cells were selected by magnetic beads for 3 d (×400).

圖1 CSCs體外培養(yǎng)

Figure 2.c-kit+CSCs were analyzed by flow cytometry.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定c-kit+CSCs

2 慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠CSCs的轉(zhuǎn)染率測定

倒置熒光顯微鏡下觀察被轉(zhuǎn)染Lv-EGFP-CGRP及Lv-EGFP成功的大鼠c-kit+CSCs可見綠色熒光的表達，48 h后即可穩(wěn)定表達，時間再往后轉(zhuǎn)染率、熒光強度均無明顯增加(圖3)；通過流式分析轉(zhuǎn)染率，我們可以得出Lv-EGFP-CGRP在MOI為20時可以達到最佳轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染率為86.0%(圖4)。

Figure 3.c-kit+CSCs were transfected for 48 h(×100). A: the cells were selected by magnetic beads for 13 d; B: c-kit+CSCs were transfected for 48 h; C: c-kit+CSCs were transfected for 72 h.

圖3 Lv-EGFP-CGRP轉(zhuǎn)染48 h后的c-kit+CSCs

Figure 4.The cell transfection efficiency was measured by flow cytometry.

圖4 Lv-EGFP-CGRP轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs 48 h后流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果

3 c-kit+CSCs培養(yǎng)上清中CGRP的分泌水平

ELISA檢測CSCs組、Lv-EGFP-CSCs及Lv-EGFP-CGRP-CSCs組上清中CGRP的分泌水平，結(jié)果顯示單純CSCs組和Lv-EGFP-CSCs組培養(yǎng)48 h后的上清中幾乎無CGRP檢出，而Lv-EGFP-CGRP-CSCs組培養(yǎng)48 h后的上清中有CGRP檢出，濃度為25.71 ng/L，明顯多于前2 組(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The expression of CGRP in the CSCs culture supernatant was detected by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCSCs group and Lv-EGFP-CSCs group.

圖5 ELISA檢測c-kit+CSCs培養(yǎng)上清CGRP的表達

4 病毒轉(zhuǎn)染對c-kit+CSCs細(xì)胞活力的影響

通過CCK-8法檢測Lv-EGFP-CSCs組、Lv-EGFP-CGRP-CSCs組和CSCs組的A值，組間相比，病毒轉(zhuǎn)染后第1～6天，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 6.The effect of virus transfection on the viability of c-kit+CSCs. Mean±SD.n=3.

圖6 病毒轉(zhuǎn)染對c-kit+CSCs活力的影響

討 論

心臟干細(xì)胞根據(jù)其表面標(biāo)志及來源不同分為以下8種類型：c-kit+/Lin-心臟干細(xì)胞、Sca-1+心臟干細(xì)胞、Isl1+心臟干細(xì)胞、側(cè)群細(xì)胞、心球樣細(xì)胞團源性細(xì)胞、CSph、SSEA-1+心臟干細(xì)胞及EPDCs。研究發(fā)現(xiàn)c-kit+CSCs對心肌的修復(fù)作用最強[7]。Beltrami 等[8]證實了c-kit+CSCs可向心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。Linke等[9]發(fā)現(xiàn)，在犬的心臟組織中c-kit+細(xì)胞所占心臟干細(xì)胞比例最大，分化能力也是最強。c-kit+CSCs是最早發(fā)現(xiàn)的CSCs，與其它CSCs相比，其分化為心肌細(xì)胞的能力最強，對心臟修復(fù)能力也最強。如何分離提取高純度的c-kit+CSCs成為心肌梗死后細(xì)胞療法的關(guān)鍵。目前對于c-kit+CSCs分離、培養(yǎng)方法各家報道均不一致，但由于c-kit+CSCs多存在于心臟的心耳中[10-11]，故本實驗取材大鼠心耳。采用心耳消化法[12]經(jīng)膠原酶消化后直接通過單細(xì)胞培養(yǎng)，與既往的培養(yǎng)方法相比，避免了細(xì)胞從組織塊中緩慢逐漸爬出的過程，縮短了細(xì)胞培養(yǎng)周期，且獲取的細(xì)胞量更多。獲取的細(xì)胞再通過免疫磁珠分選法獲取c-kit+CSCs。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測所培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志物(c-kit、CD45和CD34)，結(jié)果顯示：c-kit高表達，為91.0%；CD34和CD45極低表達，分別為4.0%和4.5%，說明通過本實驗的細(xì)胞培養(yǎng)方法可得到純度較高的c-kit+CSCs。

盡管c-kit+CSCs被證實有修復(fù)心肌的作用，但心肌梗死后移植CSCs存活數(shù)量的減少及死亡的增加都使得CSCs遷移、增殖及分化作用受到極大的限制，大大地減弱了其對心肌梗死的治療效果。而細(xì)胞基因修飾可在一定程度上改善這一現(xiàn)狀。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)CGRP基因敲除鼠缺血再灌注損傷后心功能顯著降低，這提示它與心肌的內(nèi)源性保護作用有關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CGRP可通過促進VEGF、IGF、HGF等血管生長因子的分泌發(fā)揮強大的心血管保護作用(促內(nèi)皮化及血管發(fā)生)，而這些血管生長因子可促進c-kit+CSCs的增殖、存活及分化而發(fā)揮心肌修復(fù)作用，減小心肌梗死面積，改善心功能[14-15]。這提示我們CGRP與c-kit+CSCs存在某種關(guān)聯(lián)，因此選擇CGRP為目的基因修飾c-kit+CSCs。

如何選擇合適的載體來進行c-kit+CSCs的基因修飾呢？目前的基因載體有腺病毒、慢病毒和質(zhì)粒，其中慢病毒載體較其它病毒載體具有既可感染分裂期細(xì)胞，也可感染靜止期細(xì)胞，還可整合于宿主基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分離，實現(xiàn)基因穩(wěn)定長效表達，感染效率更高，容納外源性目的基因片段大，免疫原性小，生物安全性好等優(yōu)點，可作為基因治療的理想載體[16-17]。攜帶CGRP的慢病毒是否可在體外成功轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs呢？通過對慢病毒自身攜帶的EGFP進行觀察、檢測進一步明確其轉(zhuǎn)染是否成功。當(dāng)然首先是確定轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs所需病毒的最佳MOI。目前認(rèn)為MOI是指病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時病毒與細(xì)胞的比值，MOI值隨靶細(xì)胞不同、實驗條件不同而有一定變化。本實驗按MOI=5、10、20、40對靶細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，在24 h、48 h、96 h及120 h用熒光顯微鏡觀察其綠色熒光的表達量、細(xì)胞形態(tài)，明暗視野計數(shù)來計算轉(zhuǎn)染率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOI值為20時細(xì)胞形態(tài)及生長未受到抑制，48 h后熒光表達穩(wěn)定。此時用流式細(xì)胞術(shù)測轉(zhuǎn)染效率也得到較滿意的結(jié)果(達86.0%)。因此，選擇MOI=20為最佳感染復(fù)數(shù)。轉(zhuǎn)染后的c-kit+CSCs是否有分泌CGRP蛋白的功能呢？本實驗對成功轉(zhuǎn)染病毒的c-kit+CSCs上清進行ELISA檢測，結(jié)果顯示以MOI=20轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs后48 h，重新?lián)Q液的培養(yǎng)基中48 h CGRP分泌量達高峰，為25.71 ng/L，而單純c-kit+CSCs和空病毒轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs的培養(yǎng)上清中幾乎沒有CGRP的分泌。本實驗應(yīng)用CCK-8法檢測CGRP對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示Lv-EGFP-CGRP-CSCs組與CSCs組及Lv-EGFP-CSCs組比較，其細(xì)胞活力無明顯差異。說明經(jīng)CGRP基因修飾的CSCs的生長能力與CSCs組和Lv-EGFP-CSCs組無差異。

綜上所述，經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的目的基因CGRP可成功導(dǎo)入c-kit+CSCs，且轉(zhuǎn)染后的c-kit+CSCs可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，并能分泌CGRP，除此外慢病毒轉(zhuǎn)染c-kit+CSCs后其生長能力不受影響。這些為接下來的體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。提示c-kit+CSCs是一種理想的基因載體細(xì)胞，可作為CGRP基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞用于基因治療。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Transfection of calcitonin gene-related peptide mediated by lentivirus vectorinvitroand its effects on cardiac stem cell viability

RONG Ji-dong, LI Ling, LONG Xian-ping, DENG Wen-wen, SHI Bei

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:shibei2147@163.com)

AIM: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP)transfection into c-kitposcardiac stem cells (c-kit+CSCs) on the cell viability. METHODS: Under the sterile condition, the auricles of SD rats were taken out,and then c-kit+CSCs were collected through enzyme digestion and immunomagnetic bead separation (MACS). The cells were identified by flow cytometry. c-kit+CSCs were transfected with enhanced green fluorescent protein CGRP lentiviral vector (Lv-EGFP-CGRP) or enhanced green fluorescent protein lentiviral vector (Lv-EGFP). The cells were randomly divided into Lv-EGFP-CGRP-CSCs group, Lv-EGFP-CSCs group and CSCs group. The transfection was observed under the fluorescence microscope. The transfection efficiency was detected by flow cytometry. The CGRP protein secretion in the cell culture supernatants was detected by ELISA. The viability of c-kit+CSCs transfected with Lv-EGFP-CGRP or Lv-EGFP was measured by CCK-8 assay. RESULTS: c-kit+CSCs were isolated and cultured successfully. The expression positive rate of c-kit was 91.0% and the expression positive rates of CD45 and CD34 were 4.5% and 4.0%, respectively. After transfected with lentivirus for 48 h, the stable fluorescence in c-kit+CSCs was observed under fluorescence microscope. The transfection efficiency were 80% when MOI was 20. The level of CGRP was significantly increased in Lv-ECFP-CGRP-CSCs group compared with Lv-EGFP-CSCs group and CSCs group (P<0.05). Meanwhile, transfection with lentiviral vector in each group did not affect the viability of c-kit+CSCs. CONCLUSION: Transfection of Lv-EGFP-CGRP into c-kit+CSCs was successful. The secretion of CGRP was found in the transfected c-kit+CSCs and the viability was not changed after transfection. CGRP-modified c-kit+CSCs may play a role in treating myocardial infarction．

Calcitonin gene-related peptide; Lentiviral vector; Cardiac stem cell; Cell viability

1000- 4718(2016)08- 1445- 06

2016- 01- 20

2016- 05- 30

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81360021)；貴州省國際合作項目[黔科合外G字(2013)7037號]

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.018

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