不同配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯化學(xué)成分及促血管新生作用比較

謝瑞芳 林評(píng)蘭 王瑛 周昕

摘要：目的 研究不同配伍比例對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯化學(xué)成分和促血管新生作用的影響。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定不同配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的主要化學(xué)成分阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量；采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型比較不同配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯的促血管新生作用。結(jié)果 隨著黃芪含量的增加，不同配伍比例煎液指標(biāo)成分綜合得分有上升趨勢(shì)，且在黃芪與當(dāng)歸之比為8∶2與5∶1時(shí)綜合得分最高。對(duì)于斑馬魚血管損傷模型，血管恢復(fù)率排名前3位的配比分別是黃芪與當(dāng)歸之比為5∶1、6∶1和2∶1。結(jié)論 從化學(xué)成分及促血管新生療效綜合分析，黃芪與當(dāng)歸經(jīng)典配伍比例（5∶1）好于其他比例。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸補(bǔ)血湯；化學(xué)成分；斑馬魚；促血管新生

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.022

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）06-0083-05

Abstract： Objective To study chemical ingredients and angiogenesis effects for different compatibility proportions of Danggui Buxue Decoction. Methods For chemical components， HPLC was performed to study the ingredients （Ferulic Acid， Calycosin-7-glusosido， Calycosin， Formononetin） in Danggui Buxue Decoction. For angiogenesis effects， transgenosis zebrafish model was incubated with different proportions of Danggui Buxue Decoction. Results With the raise of Astragali Radix content， the synthetic scores of four ingredients in different compatibility proportions increased. When the Astragali Radix content to Angelicae Sinensis Radix content was 8 to 2 and 5 to 1， the scores were the highest. For zebrafish vascular injury model， vessel recoveries in top three were 5：1， 6：1 and 2：1 （Astragali Radix： Angelicae Sinensis Radix）. Conclusion From comprehensive analysis of chemical composition and angiogenesis， the best compatibility ratio of Astragali Radix to Angelicae Sinensis Radix is 5：1.

Key words： Danggui Buxue Decoction； chemical components； zebrafish； angiogenesis

當(dāng)歸補(bǔ)血湯為補(bǔ)血的代表方劑，由黃芪和當(dāng)歸2味藥組成，用于治療血虛發(fā)熱證，亦治婦人經(jīng)期、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛，或瘡瘍潰后、久不愈合等[1]。藥理研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有保護(hù)心肌缺血再灌注引起的心功能減弱、促進(jìn)造血、改善血液黏度等作用[2-4]，臨床資料顯示其對(duì)冠心病、心絞痛等心血管疾病具有很好的療效[5-6]。歷代醫(yī)家對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯證的病機(jī)、主治及用藥法度皆有爭(zhēng)議?；蛟茷闅馓摱O(shè)，君黃芪補(bǔ)氣為主；或云為血虛而設(shè)，君當(dāng)歸補(bǔ)血為主；也有說為氣血兼治，用于氣血兩虛證的治療[7]。因此，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中2味中藥的用藥劑量在中醫(yī)古籍中有許多種用法，而藥物劑量的變化直接影響有效成分含量和治療作用。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定4種指標(biāo)成分含量，采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管損傷模型，比較不同配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯的化學(xué)成分與促血管新生的治療作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

Agilent 1290高效液相色譜儀，美國(guó)惠普公司；愛生牌斑馬魚獨(dú)立養(yǎng)殖單元（5層雙排），北京愛生科技發(fā)展有限公司；SMZ745體視顯微鏡，Nikon；SMZ18熒光體視顯微鏡，Nikon；LQ-C3003電子天平，瑞安市安特重設(shè)備；XW-80渦旋混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；SB2200超聲儀，上海醫(yī)用分析儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；pH計(jì)（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

Krebs液（NaCl 119，KCl 4.7，MgCl2·6H2O 1，NaHCO3 25，KH2PO4 1.2， D-glucose 11.1，CaCl2 2.5）；60 mmol/L KCl Krebs液（NaCl 63，KCl 60，MgCl2·6H2O 1，NaHCO3 25，KH2PO4 1.2，D-glucose 11.1，CaCl2 2.5）；溶血磷脂酰膽堿（LPC，美國(guó)Sigma公司，SLBH3673V）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma，SHBC3313V）；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（VRI，Sigma），溶解于DMSO配制為100 mmol/L儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存。

黃芪（甘肅，上海萬仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司，批號(hào)140922-1）；當(dāng)歸（甘肅，上海萬仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司，批號(hào)140924-1）；阿魏酸（成都曼斯特生物有限公司，純度98.6%，批號(hào)MUST-13112204）；毛蕊異黃酮苷（批號(hào)05-1021）、毛蕊異黃酮（批號(hào)05-2027）、刺芒柄花素（批號(hào)05-2014），上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心。

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli1a-EGFP），上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室提供，依據(jù)zebrafish handbook方法飼養(yǎng)。

2 化學(xué)成分含量測(cè)定

2.1 溶液的制備

2.1.1 藥液的煎煮 分別稱取相應(yīng)比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥材約100 g（黃芪與當(dāng)歸比例為1∶5、5∶6、1∶1、2∶1、5∶2、10∶3、8∶2、5∶1、6∶1），加8倍量水，浸泡30 min，沸后加熱20 min，煎煮3次，合并藥液，濃縮至1 g原藥材/mL，得到當(dāng)歸補(bǔ)血湯及其藥材水煎液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取上述水煎液1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇接近刻度，搖勻，超聲20 min，冷卻至室溫，補(bǔ)充甲醇至刻度，搖勻，靜置過夜，取上清液10 000 r/min離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸4.40 mg置于10 mL量瓶中，毛蕊異黃酮苷5.20 mg、毛蕊異黃酮2.20 mg、芒柄花素5.20 mg，分別置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，稀釋至不同濃度，用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax RRHD SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素）、316 nm（阿魏酸）；進(jìn)樣量：2 μL；檢測(cè)時(shí)間：15 min；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水，等度洗脫（阿魏酸、毛蕊異黃酮苷，10.0%乙腈；毛蕊異黃酮、刺芒柄花素，25.0%乙腈）；流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃。結(jié)果表明，在此條件下，各指標(biāo)成分的色譜峰與雜質(zhì)能夠達(dá)到基線分離，峰型對(duì)稱，分離較好且保留時(shí)間適中。色譜圖見圖1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取阿魏酸、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷和芒柄花素不同濃度的對(duì)照品溶液注入色譜儀，進(jìn)樣量為2 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各指標(biāo)成分在相應(yīng)范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均>0.999 5，線性關(guān)系良好，見表1。

2.4 指標(biāo)成分含量結(jié)果

為控制所用黃芪及當(dāng)歸藥材的質(zhì)量，測(cè)量當(dāng)歸中的阿魏酸及黃芪中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素含量。結(jié)果表明，阿魏酸含量在復(fù)方中高于當(dāng)歸藥材，且隨黃芪在復(fù)方中所占比例上升，含量更高，可能黃芪有助于阿魏酸的溶出；毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素3個(gè)成分含量在復(fù)方中除1∶5比例者偏低，其他比例中差異不大，其中毛蕊異黃酮苷含量在復(fù)方中基本高于黃芪藥材。結(jié)果見表2。

2.5 不同配伍比例藥材含量的綜合評(píng)分

為了綜合評(píng)價(jià)各藥材配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效成分的溶出度，采用AHP法根據(jù)當(dāng)歸補(bǔ)血湯中有效成分HPLC檢測(cè)信息，將其316 nm波長(zhǎng)處阿魏酸色譜峰及254 nm波長(zhǎng)處毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素的色譜峰作為相同權(quán)重的評(píng)分指標(biāo)，計(jì)算每種配伍的綜合得分，得分越高的配伍可認(rèn)為化合物成分溶出度越高。

根據(jù)測(cè)定的HPLC含量信息，將9種配伍比例所含的每種指標(biāo)成分含量從小到大依次排列，給予分?jǐn)?shù)，再將復(fù)方中的各成分得分按各占25%的權(quán)重相加，得到綜合評(píng)分。指標(biāo)成分評(píng)分（%）=（成分含量-該成分含量最小值）÷（該成分含量最大值-該成分含量最小值）×100%。結(jié)果表明，黃芪與當(dāng)歸配伍比例為8∶2及經(jīng)典配伍比例（5∶1），綜合評(píng)分較高，見表3。

3 促血管新生作用研究

3.1 斑馬魚毒性實(shí)驗(yàn)

選擇發(fā)育正常，受精24 h（24 hpf）的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli-1a：EGFP）胚胎，用鑷子去掉卵殼，將其放入含有embryo medium的12孔板中（每孔10條）。按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)濃度的藥物，放入28.5 ℃的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至48 hpf時(shí)，用embryo medium清洗12孔板中的各個(gè)組，重新加入embryo medium和不同濃度的藥物，操作同第1日。在培養(yǎng)至48 hpf和72 hpf時(shí)，觀察不同濃度的各藥物組斑馬魚的死亡情況和致畸形情況，記錄各藥物組斑馬魚能耐受的最大劑量，為下一步實(shí)驗(yàn)劑量的確定提供依據(jù)。

3.2 藥物分組

分為空白對(duì)照組、VRI血管損傷模型組、不同配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯給藥組（1∶5，5∶1，1∶1，2∶1，5∶2，5∶6，6∶1，10∶3，8∶2）。

3.3 斑馬魚節(jié)間血管恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

在VRI誘導(dǎo)血管損失模型中，將從背主動(dòng)脈（DA）或者脊椎主靜脈（PCV）發(fā)芽延伸并連接到背部脊索血管（DLAVs）的體節(jié)間靜脈（ISVs）定義為完整血管（intact），而一些已經(jīng)從DA或者PCV延伸出但并未與DLAVs相連的ISVs定義為缺陷型血管（defective）。

選擇發(fā)育正常，24 hpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli-1a：EGFP）胚胎，用鑷子去掉卵殼，將其放入含有embryo medium的12孔板中（每孔10個(gè)）。模型組和給藥組先加入VRI 100 nmol/L在28.5 ℃培養(yǎng)箱中處理3 h，然后加embryo medium清洗3遍，模型組加入embryo medium，藥物組則加入相應(yīng)的藥物，放入28.5 ℃飼養(yǎng)箱里，培養(yǎng)至48 hpf時(shí)，在熒光顯微鏡下拍照，觀察不同藥物對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的影響。分別對(duì)每條斑馬魚的完整血管和缺陷型血管進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，研究藥物對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的恢復(fù)作用。

統(tǒng)計(jì)每組加藥濃度的節(jié)間血管指數(shù)（完整血管數(shù)+0.5×缺陷型血管數(shù)），根據(jù)血管指數(shù)計(jì)算VRI誘導(dǎo)斑馬魚血管損傷模型給藥后的血管恢復(fù)率[（該組血管指數(shù)-VRI組血管指數(shù)）÷（空白對(duì)照組血管指數(shù)-VRI組血管指數(shù)）×100%]，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以 —x±s表示。采用GraphPad Prism 6軟件繪圖。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.5 結(jié)果

3.5.1 正常斑馬魚毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以當(dāng)歸和黃芪1∶5比例組成的當(dāng)歸補(bǔ)血湯，進(jìn)行斑馬魚藥物毒性篩選，觀察斑馬魚給藥24、48 h后致死情況，從而得到藥物最大安全濃度，為進(jìn)一步研究提供劑量依據(jù)。結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯最大安全濃度為250 μg/mL。

3.5.2 不同配比的當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管損傷斑馬魚模型的保護(hù)作用 將不同配伍比例的當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎液均稀釋至濃度為200 μg/mL，并以該濃度給藥48 h，比較各比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)VRI誘導(dǎo)的損傷斑馬魚節(jié)間血管的作用。各組斑馬魚血管生成圖見圖2、血管數(shù)量見圖3。結(jié)果表明：①各配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯加藥組中，在處理48 h后均有明顯的對(duì)VRI誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚的保護(hù)效果，與模型組比較有明顯差異，說明各配伍比例的當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)VRI損傷的斑馬魚節(jié)間血管均有促血管新生作用。②各配伍比例當(dāng)歸補(bǔ)血湯加藥組中，每組對(duì)VRI誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚修復(fù)效果不同。對(duì)3次實(shí)驗(yàn)各組血管恢復(fù)率均值進(jìn)行排序，結(jié)果血管恢復(fù)率排名前3位的配伍比例分別是黃芪與當(dāng)歸比例為5∶1、6∶1和2∶1。

4 討論

中醫(yī)學(xué)經(jīng)典理論雖未直接提出血管新生的概念，但有許多相關(guān)認(rèn)識(shí)。血管概念包括在“脈”“血脈”“血絡(luò)”含義中，其中“脈”包含解刨學(xué)較大“血管”，而“血絡(luò)”則特指微血管，為“脈”細(xì)小分支與延續(xù)。脈絡(luò)生成與功能和五臟均有聯(lián)系，其“資始于腎”，“資生于胃”，“統(tǒng)于心”，“會(huì)于肺”，“約于肝”[8]。從補(bǔ)腎益精、補(bǔ)益心氣、調(diào)肝理氣、活血化瘀、養(yǎng)血生脈的角度，探索中藥的促血管生成作用，是一個(gè)較為有意義的研究方向。

斑馬魚是目前生命科學(xué)研究中中藥的模式脊椎動(dòng)物之一，作為一種新的模式生物[9]，既有與哺乳動(dòng)物類似的生理、生化特征，又具有高效、快速、大規(guī)模的特點(diǎn)。近年來，轉(zhuǎn)基因斑馬魚已成為血管新生研究的重要模型之一，可觀測(cè)斑馬魚的血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞上有綠色熒光蛋白的表達(dá)，直接觀察藥物對(duì)血管的效應(yīng)。斑馬魚的血管發(fā)生為：大的軸向血管（背動(dòng)脈和尾部靜脈）和尾部靜脈簇的發(fā)生方式是血管形成，其他血管的發(fā)生方式是血管新生[10-11]。斑馬魚血管發(fā)生過程很快，受精后不久，胚胎心臟開始有規(guī)律的跳動(dòng)，背動(dòng)脈和尾部靜脈內(nèi)出現(xiàn)血細(xì)胞流動(dòng)，體節(jié)間血管開始向背部生長(zhǎng)。用VRI抑制血管新生造成血管損傷模型，不僅靶點(diǎn)清晰，而且針對(duì)性強(qiáng)[12]。因此，本研究采用VRI抑制斑馬魚血管生成模型研究不同配伍比例對(duì)血管新生的影響。結(jié)果表明，復(fù)方療效好于單味，且血管恢復(fù)率排名前3位的配比分別是黃芪與當(dāng)歸為5∶1、6∶1和2∶1。

此外，本研究比較了不同配伍比例的當(dāng)歸補(bǔ)血湯的化學(xué)成分，結(jié)果表明，隨著黃芪含量的增加，不同配比煎液指標(biāo)成分綜合得分有著上升趨勢(shì)，并在黃芪當(dāng)歸之比8∶2、5∶1時(shí)綜合得分最高。

由此可見，當(dāng)歸補(bǔ)血湯經(jīng)典配伍比例（黃芪∶當(dāng)歸=5∶1）無論是有效成分的含量還是促血管新生的療效，都比其他配伍比例好。本研究為當(dāng)歸補(bǔ)血湯的配伍理論提供了一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2015-07-10）

（修回日期：2015-07-29；編輯：陳靜）