• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同配伍比例當歸補血湯化學成分及促血管新生作用比較

    2016-07-31 21:29:22謝瑞芳林評蘭王瑛周昕
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年6期
    關(guān)鍵詞:毛蕊異黃酮斑馬魚

    謝瑞芳,林評蘭,王瑛,周昕

    上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院藥劑科,上海 200032

    不同配伍比例當歸補血湯化學成分及促血管新生作用比較

    謝瑞芳,林評蘭,王瑛,周昕

    上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院藥劑科,上海 200032

    目的研究不同配伍比例對當歸補血湯化學成分和促血管新生作用的影響。方法采用高效液相色譜法測定不同配伍比例當歸補血湯中的主要化學成分阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量;采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型比較不同配伍比例當歸補血湯的促血管新生作用。結(jié)果隨著黃芪含量的增加,不同配伍比例煎液指標成分綜合得分有上升趨勢,且在黃芪與當歸之比為8∶2與5∶1時綜合得分最高。對于斑馬魚血管損傷模型,血管恢復率排名前3位的配比分別是黃芪與當歸之比為5∶1、6∶1和2∶1。結(jié)論從化學成分及促血管新生療效綜合分析,黃芪與當歸經(jīng)典配伍比例(5∶1)好于其他比例。

    當歸補血湯;化學成分;斑馬魚;促血管新生

    當歸補血湯為補血的代表方劑,由黃芪和當歸2味藥組成,用于治療血虛發(fā)熱證,亦治婦人經(jīng)期、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛,或瘡瘍潰后、久不愈合等[1]。藥理研究表明,當歸補血湯具有保護心肌缺血再灌注引起的心功能減弱、促進造血、改善血液黏度等作用[2-4],臨床資料顯示其對冠心病、心絞痛等心血管疾病具有很好的療效[5-6]。歷代醫(yī)家對當歸補血湯證的病機、主治及用藥法度皆有爭議。或云為氣虛而設(shè),君黃芪補氣為主;或云為血虛而設(shè),君當歸補血為主;也有說為氣血兼治,用于氣血兩虛證的治療[7]。因此,當歸補血湯中 2味中藥的用藥劑量在中醫(yī)古籍中有許多種用法,而藥物劑量的變化直接影響有效成分含量和治療作用。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)測定4種指標成分含量,采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管損傷模型,比較不同配伍比例當歸補血湯的化學成分與促血管新生的治療作用,為臨床用藥提供依據(jù)。

    1 儀器、試藥與動物

    Agilent 1290高效液相色譜儀,美國惠普公司;愛生牌斑馬魚獨立養(yǎng)殖單元(5層雙排),北京愛生科技發(fā)展有限公司;SMZ745體視顯微鏡,Nikon;SMZ18熒光體視顯微鏡,Nikon;LQ-C3003電子天平,瑞安市安特重設(shè)備;XW-80渦旋混合器,上海醫(yī)科大學儀器廠;SB2200超聲儀,上海醫(yī)用分析儀器廠;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TGL-16G臺式高速離心機,上海醫(yī)用分析儀器廠;pH計(FE20),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

    Krebs液(NaCl 119,KCl 4.7,MgCl2·6H2O 1,NaHCO325,KH2PO41.2, D-glucose 11.1,CaCl22.5);60 mmol/L KCl Krebs液(NaCl 63,KCl 60,MgCl2· 6H2O 1,NaHCO325,KH2PO41.2,D-glucose 11.1,CaCl22.5);溶血磷脂酰膽堿(LPC,美國Sigma公司,SLBH3673V);二甲基亞砜(DMSO,Sigma,SHBC3313V);內(nèi)皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRI,Sigma),溶解于DMSO配制為100 mmol/L儲備液,-20 ℃儲存。

    轉(zhuǎn)基因斑馬魚 Tg(fli1a-EGFP),上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實驗室提供,依據(jù) zebrafish handbook方法飼養(yǎng)。

    2 化學成分含量測定

    2.1 溶液的制備

    2.1.1 藥液的煎煮 分別稱取相應比例當歸補血湯藥材約100g(黃芪與當歸比例為1∶5、5∶6、1∶1、2∶1、5∶2、10∶3、8∶2、5∶1、6∶1),加8倍量水,浸泡30 min,沸后加熱20 min,煎煮3次,合并藥液,濃縮至1g原藥材/mL,得到當歸補血湯及其藥材水煎液。

    2.1.2 供試品溶液的制備 取上述水煎液 1mL置10mL容量瓶中,加甲醇接近刻度,搖勻,超聲20 min,冷卻至室溫,補充甲醇至刻度,搖勻,靜置過夜,取上清液10 000 r/min離心10 min,用0.22 μm微孔濾膜過濾,作為供試品溶液。

    2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸4.40 mg置于10mL量瓶中,毛蕊異黃酮苷5.20 mg、毛蕊異黃酮2.20 mg、芒柄花素5.20 mg,分別置于25mL量瓶中,用甲醇定容,稀釋至不同濃度,用0.22 μm微孔濾膜過濾,作為對照品溶液。

    2.2 色譜條件

    色譜柱:Zorbax RRHD SB-C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm);檢測波長:254 nm(毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素)、316 nm(阿魏酸);進樣量:2 μL;檢測時間:15 min;流動相:乙腈-0.2%磷酸水,等度洗脫(阿魏酸、毛蕊異黃酮苷,10.0%乙腈;毛蕊異黃酮、刺芒柄花素,25.0%乙腈);流速:0.25mL/min;柱溫:35 ℃。結(jié)果表明,在此條件下,各指標成分的色譜峰與雜質(zhì)能夠達到基線分離,峰型對稱,分離較好且保留時間適中。色譜圖見圖1。

    式中:α為中繼放大轉(zhuǎn)發(fā)系數(shù),滿足中繼發(fā)送功率的限制;PnR是中繼每根天線上發(fā)送人工噪聲的平均功率;WT為中繼發(fā)送信號預編碼矩陣;zR是服從復高斯分布的N-K維人工噪聲矢量,zR~(0,IN-K);V2是中繼人工噪聲波束賦形矩陣.WT為

    2.3 標準曲線的繪制

    精密吸取阿魏酸、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷和芒柄花素不同濃度的對照品溶液注入色譜儀,進樣量為 2 μL,按“2.2”項下色譜條件測定峰面積,以峰面積為縱坐標,對照品含量為橫坐標,繪制標準曲線。結(jié)果表明,各指標成分在相應范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)均>0.999 5,線性關(guān)系良好,見表1。

    2.4 指標成分含量結(jié)果

    為控制所用黃芪及當歸藥材的質(zhì)量,測量當歸中的阿魏酸及黃芪中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素含量。結(jié)果表明,阿魏酸含量在復方中高于當歸藥材,且隨黃芪在復方中所占比例上升,含量更高,可能黃芪有助于阿魏酸的溶出;毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素3個成分含量在復方中除1∶5比例者偏低,其他比例中差異不大,其中毛蕊異黃酮苷含量在復方中基本高于黃芪藥材。結(jié)果見表2。

    圖1 當歸補血湯中4種指標成分HPLC圖

    表1 4種指標成分線性關(guān)系考察結(jié)果

    表2 不同配伍當歸補血湯煎液指標成分含量(按配方比例折算,mg/g)

    2.5 不同配伍比例藥材含量的綜合評分

    為了綜合評價各藥材配伍比例當歸補血湯有效成成分的溶出度,采用AHPP法根據(jù)當歸補血湯中有效成成分HPLC檢檢測信息,將其316 nm波長處阿魏酸色譜譜峰及254 nmm波長處毛蕊蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素的色譜峰作為相相同權(quán)重的評分指標,計算每每種配伍的綜合得分,得分越高的配伍可認為化合物成成分溶出度越高。

    根據(jù)測定的HPLC含量信息,將9種配伍比例所含的每種指標標成分含量從從小到大依次排列,給予分數(shù),再將復方方中的各成分分得分按各占 25%的權(quán)重相加,得到綜合評分。指標成成分評分(%)=(成分含量-該成分含量最小值)÷÷(該成分含量最大值-該成分含量最小小值)×100%%。結(jié)果表明,黃芪與當歸配伍比例為8∶2及經(jīng)典配配伍比例(5∶1),綜合評分較高 ,見表3。。

    表3 不同配伍當歸補血湯煎液指標成分評分(%)

    3 促血管新生生作用研究

    3.1 斑馬魚毒毒性實驗

    選擇發(fā)育正常,受精24 h(24 hppf)的轉(zhuǎn)基因因斑馬魚Tg(fli-1a:EGFP)胚胚胎,用鑷子去掉卵殼,將其放入含有emmbryo mediuum的12孔板中(每孔孔10條條)。按實驗分分組加入相應應濃度的藥物,放入28.5℃的的培養(yǎng)箱中。培培養(yǎng)至48 hppf時,用embryo medium清洗洗12孔板中的的各個組,重新加入embryo medium和不不同濃度的藥物,操作同第第1日。在培養(yǎng)至48 hpf和722 hpf時,觀察不同濃度的的各藥物組斑斑馬魚的死亡情況和致畸形情況,記錄各藥藥物組斑馬魚魚能耐受的最大劑劑量,為下一步實驗劑量的的確定提供依據(jù)。

    3.2 藥物分組

    分為空白對照組、VRI血管損傷模模型組、不同配伍伍比例當歸補血湯給藥組(1∶5,5∶1,1∶1,2∶1,5∶2,5∶6,6∶1,10∶3,8∶2)。

    3.3 斑馬魚節(jié)節(jié)間血管恢復實驗

    在 VRI誘誘導血管損失模型中,將從背主動脈(DA)或者脊脊椎主靜脈(PCV)發(fā)芽延伸并連接到背部脊索血管(DLAVs)的體節(jié)間靜脈(ISVs)定義為完整血管(intact),而一些已經(jīng)從DA或者PCV延伸出但并未與DLAVs相連的ISVs定義為缺陷型血管(defective)。

    選擇發(fā)育正常,24 hpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fli-1a:EGFP)胚胎,用鑷子去掉卵殼,將其放入含有embryo medium的12孔板中(每孔10個)。模型組和給藥組先加入VRI 100 nmol/L在28.5 ℃培養(yǎng)箱中處理3 h,然后加embryo medium清洗3遍,模型組加入embryo medium,藥物組則加入相應的藥物,放入28.5 ℃飼養(yǎng)箱里,培養(yǎng)至48 hpf時,在熒光顯微鏡下拍照,觀察不同藥物對斑馬魚節(jié)間血管的影響。分別對每條斑馬魚的完整血管和缺陷型血管進行統(tǒng)計,研究藥物對斑馬魚節(jié)間血管的恢復作用。

    統(tǒng)計每組加藥濃度的節(jié)間血管指數(shù)(完整血管數(shù)+0.5×缺陷型血管數(shù)),根據(jù)血管指數(shù)計算VRI誘導斑馬魚血管損傷模型給藥后的血管恢復率[(該組血管指數(shù)-VRI組血管指數(shù))÷(空白對照組血管指數(shù)-VRI組血管指數(shù))×100%],每組實驗至少重復3次。

    3.4 統(tǒng)計學方法

    3.5 結(jié)果

    3.5.1 正常斑馬魚毒性實驗結(jié)果 以當歸和黃芪1∶5比例組成的當歸補血湯,進行斑馬魚藥物毒性篩選,觀察斑馬魚給藥24、48 h后致死情況,從而得到藥物最大安全濃度,為進一步研究提供劑量依據(jù)。結(jié)果表明,當歸補血湯最大安全濃度為250 μg/mL。

    3.5.2 不同配比的當歸補血湯對血管損傷斑馬魚模型的保護作用 將不同配伍比例的當歸補血湯煎液均稀釋至濃度為200 μg/mL,并以該濃度給藥48 h,比較各比例當歸補血湯對 VRI誘導的損傷斑馬魚節(jié)間血管的作用。各組斑馬魚血管生成圖見圖2、血管數(shù)量見圖3。結(jié)果表明:①各配伍比例當歸補血湯加藥組中,在處理48 h后均有明顯的對VRI誘導血管損傷斑馬魚的保護效果,與模型組比較有明顯差異,說明各配伍比例的當歸補血湯對 VRI損傷的斑馬魚節(jié)間血管均有促血管新生作用。②各配伍比例當歸補血湯加藥組中,每組對VRI誘導血管損傷斑馬魚修復效果不同。對3次實驗各組血管恢復率均值進行排序,結(jié)果血管恢復率排名前3位的配伍比例分別是黃芪與當歸比例為5∶1、6∶1和2∶1。

    圖2 各組斑馬魚節(jié)間血管生成圖

    圖3 各配伍當歸補血湯對VRI損傷斑馬魚節(jié)間血管數(shù)量的影響(n=10)

    表4 不同配伍比例當歸補血湯血管恢復率比較(n=10)

    4 討論

    中醫(yī)學經(jīng)典理論雖未直接提出血管新生的概念,但有許多相關(guān)認識。血管概念包括在“脈”“血脈”“血絡”含義中,其中“脈”包含解刨學較大“血管”,而“血絡”則特指微血管,為“脈”細小分支與延續(xù)。脈絡生成與功能和五臟均有聯(lián)系,其“資始于腎”,“資生于胃”,“統(tǒng)于心”,“會于肺”,“約于肝”[8]。從補腎益精、補益心氣、調(diào)肝理氣、活血化瘀、養(yǎng)血生脈的角度,探索中藥的促血管生成作用,是一個較為有意義的研究方向。

    斑馬魚是目前生命科學研究中中藥的模式脊椎動物之一,作為一種新的模式生物[9],既有與哺乳動物類似的生理、生化特征,又具有高效、快速、大規(guī)模的特點。近年來,轉(zhuǎn)基因斑馬魚已成為血管新生研究的重要模型之一,可觀測斑馬魚的血管系統(tǒng)內(nèi)皮細胞上有綠色熒光蛋白的表達,直接觀察藥物對血管的效應。斑馬魚的血管發(fā)生為:大的軸向血管(背動脈和尾部靜脈)和尾部靜脈簇的發(fā)生方式是血管形成,其他血管的發(fā)生方式是血管新生[10-11]。斑馬魚血管發(fā)生過程很快,受精后不久,胚胎心臟開始有規(guī)律的跳動,背動脈和尾部靜脈內(nèi)出現(xiàn)血細胞流動,體節(jié)間血管開始向背部生長。用VRI抑制血管新生造成血管損傷模型,不僅靶點清晰,而且針對性強[12]。因此,本研究采用 VRI抑制斑馬魚血管生成模型研究不同配伍比例對血管新生的影響。結(jié)果表明,復方療效好于單味,且血管恢復率排名前3位的配比分別是黃芪與當歸為5∶1、6∶1和2∶1。

    此外,本研究比較了不同配伍比例的當歸補血湯的化學成分,結(jié)果表明,隨著黃芪含量的增加,不同配比煎液指標成分綜合得分有著上升趨勢,并在黃芪當歸之比8∶2、5∶1時綜合得分最高。

    由此可見,當歸補血湯經(jīng)典配伍比例(黃芪∶當歸=5∶1)無論是有效成分的含量還是促血管新生的療效,都比其他配伍比例好。本研究為當歸補血湯的配伍理論提供了一定的依據(jù)。

    [1] 段富津.方劑學[M].上海:上海科學技術(shù)出版社,1995:124-125.

    [2] 吳大正,宋純清,韓之芬,等.當歸補血湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠心功能的作用[J].中藥藥理與臨床,1999,15(5):1-3.

    [3] 寧煉,陳長勛,金若敏,等.當歸補血湯促進造血功能的成分及其作用的研究[J].中國中藥雜志,2002,27(1):50-53.

    [4] 王偉中,烏云娜,王愛萍.當歸補血湯的血液流變學研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2005,24(1):34.

    [5] 王波.當歸補血湯加味治療冠心病心絞痛臨床觀察[J].天津中醫(yī),2000,17(3):4-5.

    [6] 劉康永,張毅.當歸補血湯加味治療冠心病的臨床研究[J].安徽中醫(yī)學院學報,1997,16(6):17-18.

    [7] 滕佳琳,鄒積隆,王樹榮,等.黃芪與當歸藥對配伍理論的實驗研究[J].山東中醫(yī)學院學報,1992,16(1):14-18.

    [8] 劉小雨,王行寬.促血管新生的中醫(yī)藥治療現(xiàn)狀[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(10):1918-1922.

    [9] 王佑華,黎晌,楊彬睿,等.斑馬魚模型在中醫(yī)藥研究中的應用現(xiàn)狀[J].中西醫(yī)結(jié)合學報,2012,10(11):1189-1197.

    [10] ISOGAI S, HORIGUCHI M, WEINSTEIN B M. The vascular anatomy of the developing zebraf ish:an at las of embryonic and ear ly larval development[J]. Dev Biol,2001,230(2):278-301.

    [11] CHILDS S, CHEN J N, GARRITY D M, et al. Patterning of angiogenesis in the zebraf ish embryo[J]. Development,2002,129(4):973-982.

    [12] 張哲睿,黎晌,王佑華,等.三七及三七花總皂苷對斑馬魚模型促血管新生作用的研究[J].上海中醫(yī)藥大學學報,2013,27(1):45-49.

    Comparative Study on Chem ical Ingredients and Angiogenesis Effects for Different Compatibility Proportions of Danggui Buxue Decoction

    XIE Rui-fang, LIN Ping-lan, WANG Ying,ZHOU Xin
    (Department of Pharmacy, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China)

    ObjectiveTo study chemical ingredients and angiogenesis effects for different compatibility proportions ofDanggui BuxueDecoction.MethodsFor chem ical components, HPLC was performed to study the ingredients (Ferulic Acid, Calycosin-7-glusosido, Calycosin, Formononetin) inDanggui BuxueDecoction. For angiogenesis effects, transgenosis zebrafish model was incubated with different proportions ofDanggui BuxueDecoction.ResultsWith the raise of Astragali Radix content, the synthetic scores of four ingredients in different compatibility proportions increased. When the Astragali Radix content to Angelicae Sinensis Radix content was 8 to 2 and 5 to 1, the scores were the highest. For zebrafish vascular injury model, vessel recoveries in top three were 5∶1,6∶1 and 2∶1 (Astragali Radix∶ Angelicae Sinensis Radix).ConclusionFrom comprehensive analysis of chem ical composition and angiogenesis, the best compatibility ratio of Astragali Radix to Angelicae Sinensis Radix is 5∶1.

    Danggui BuxueDecoction; chemical components; zebrafish; angiogenesis

    10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.022

    R284.1

    A

    1005-5304(2016)06-0083-05

    2015-07-10)

    2015-07-29;編輯:陳靜)

    上海中醫(yī)藥大學預算內(nèi)科研項目(2013JW36);“龍醫(yī)團隊,龍醫(yī)學者”項目(LYTD-14)

    周昕,E-mai l:2479707904@qq.com

    猜你喜歡
    毛蕊異黃酮斑馬魚
    毛蕊異黃酮對宮頸癌HeLa細胞增殖及凋亡的影響
    斑馬魚天生就能辨別數(shù)量
    小斑馬魚歷險記
    運用血清藥理學初步探討毛蕊異黃酮苷的血管新生作用
    LC-MS測定黑豆中異黃酮和花色苷的含量
    補肺活血膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮的測定方法
    瓜蔞不同部位對斑馬魚促血管生成及心臟保護作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    HPLC法同時測定天山巖黃芪中4 種異黃酮
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    HPLC測定芪衛(wèi)顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量
    葛花異黃酮的藥理作用研究進展
    高清av免费在线| 午夜福利免费观看在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 老司机亚洲免费影院| 两个人看的免费小视频| 午夜激情久久久久久久| 黄色片一级片一级黄色片| 只有这里有精品99| 国产在线免费精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 激情视频va一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 婷婷丁香在线五月| 日本一区二区免费在线视频| 久久99精品国语久久久| 天天添夜夜摸| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| a级毛片在线看网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品一二三| 免费少妇av软件| 丝袜在线中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一区在线观看国产| 女人精品久久久久毛片| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av电影在线进入| 国产av一区二区精品久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品久久午夜乱码| 一级毛片 在线播放| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲黑人精品在线| 亚洲中文av在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 亚洲国产日韩一区二区| 人妻一区二区av| 成年动漫av网址| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 不卡av一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲美女黄色视频免费看| a级毛片在线看网站| 免费观看av网站的网址| 国产精品av久久久久免费| 欧美人与善性xxx| 精品一区二区三卡| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品一区蜜桃| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美xxⅹ黑人| 18在线观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品人妻久久久影院| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一区二区av电影网| 亚洲国产av影院在线观看| e午夜精品久久久久久久| 亚洲人成电影免费在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 捣出白浆h1v1| 亚洲,欧美精品.| 熟女av电影| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 国产又色又爽无遮挡免| 在线观看人妻少妇| 亚洲男人天堂网一区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 中文字幕制服av| 国产免费又黄又爽又色| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| av欧美777| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 十八禁高潮呻吟视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 飞空精品影院首页| 黄色 视频免费看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄色怎么调成土黄色| 色播在线永久视频| 大码成人一级视频| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲人成电影观看| 欧美精品一区二区大全| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美在线一区亚洲| 日本a在线网址| 欧美精品一区二区大全| 国产免费福利视频在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品av久久久久免费| 免费高清在线观看日韩| 国产精品一区二区在线观看99| 久久中文字幕一级| 国产成人精品在线电影| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产三级黄色录像| www.av在线官网国产| 在线精品无人区一区二区三| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲久久久国产精品| 国产男女超爽视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 大型av网站在线播放| 亚洲七黄色美女视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产一区二区激情短视频 | 日本黄色日本黄色录像| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| videosex国产| 亚洲国产精品999| 欧美97在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 97在线人人人人妻| 久久久久久人人人人人| 国产一区有黄有色的免费视频| 另类亚洲欧美激情| 国产成人精品在线电影| a级毛片在线看网站| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 麻豆国产av国片精品| 各种免费的搞黄视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 99国产精品99久久久久| 国产视频一区二区在线看| 18禁观看日本| 欧美在线黄色| 18禁国产床啪视频网站| 视频区欧美日本亚洲| 最近中文字幕2019免费版| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲专区国产一区二区| 亚洲图色成人| kizo精华| 午夜福利在线免费观看网站| 免费高清在线观看日韩| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 我要看黄色一级片免费的| 高清欧美精品videossex| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 下体分泌物呈黄色| 欧美人与性动交α欧美软件| 色播在线永久视频| 欧美性长视频在线观看| 亚洲国产欧美网| 人人澡人人妻人| 欧美另类一区| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 1024视频免费在线观看| 久久99精品国语久久久| 91国产中文字幕| 亚洲人成电影观看| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲视频免费观看视频| 波野结衣二区三区在线| 成人手机av| 男人操女人黄网站| 99热网站在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产成人欧美在线观看 | 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 成人国语在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 视频区图区小说| 丝袜美腿诱惑在线| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品乱久久久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久影院123| 亚洲专区国产一区二区| av国产久精品久网站免费入址| av国产精品久久久久影院| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜激情av网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产av一区二区精品久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 在线av久久热| 黄片播放在线免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产深夜福利视频在线观看| avwww免费| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲av日韩在线播放| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 国产真人三级小视频在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日本中文国产一区发布| 久久国产精品大桥未久av| 人成视频在线观看免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 日韩av免费高清视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲五月色婷婷综合| 丁香六月天网| 在线天堂中文资源库| 美女大奶头黄色视频| av片东京热男人的天堂| 丁香六月欧美| 少妇 在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 最近中文字幕2019免费版| 首页视频小说图片口味搜索 | www.999成人在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩免费高清中文字幕av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 9色porny在线观看| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精品美女久久av网站| 中文欧美无线码| 国产精品一区二区在线不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人三级做爰电影| 中文字幕精品免费在线观看视频| 丝瓜视频免费看黄片| 国产欧美亚洲国产| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品第一国产精品| 国产亚洲一区二区精品| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品av麻豆狂野| 999久久久国产精品视频| 免费高清在线观看日韩| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久狼人影院| 99国产精品一区二区蜜桃av | 9色porny在线观看| 少妇 在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 久久国产精品大桥未久av| 日韩伦理黄色片| 黄片播放在线免费| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区三 | 嫩草影视91久久| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久久久网色| avwww免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 性少妇av在线| av不卡在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 熟女av电影| 母亲3免费完整高清在线观看| 91麻豆av在线| 9热在线视频观看99| 久久狼人影院| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 少妇人妻久久综合中文| 日日夜夜操网爽| 亚洲中文字幕日韩| 蜜桃在线观看..| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久精品94久久精品| av电影中文网址| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品一区二区在线观看99| 免费在线观看黄色视频的| 校园人妻丝袜中文字幕| 婷婷成人精品国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 满18在线观看网站| 午夜激情久久久久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 性少妇av在线| 激情五月婷婷亚洲| 国产在视频线精品| 波多野结衣av一区二区av| 满18在线观看网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 18禁观看日本| 亚洲国产日韩一区二区| 操出白浆在线播放| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品亚洲成国产av| 国产男女超爽视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av电影中文网址| 日本91视频免费播放| 国产福利在线免费观看视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 最近手机中文字幕大全| 天天影视国产精品| 国产欧美亚洲国产| 两性夫妻黄色片| 我的亚洲天堂| 婷婷成人精品国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产人伦9x9x在线观看| 悠悠久久av| 九草在线视频观看| 日本av免费视频播放| 国精品久久久久久国模美| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品九九99| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区激情| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 成人国产av品久久久| 亚洲三区欧美一区| 嫩草影视91久久| 女人久久www免费人成看片| 在线观看www视频免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人三级做爰电影| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲av国产av综合av卡| 男人爽女人下面视频在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产日韩欧美在线精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| 超碰97精品在线观看| 国产精品 国内视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 美女福利国产在线| 看免费成人av毛片| 国产av国产精品国产| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品一区二区在线不卡| 国产在线观看jvid| 成人国产av品久久久| av网站在线播放免费| www.自偷自拍.com| 国产一区二区三区av在线| 一二三四在线观看免费中文在| 久久人妻熟女aⅴ| 精品久久久精品久久久| 黄色一级大片看看| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产精品999| 在线观看国产h片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产片内射在线| 日韩视频在线欧美| www.精华液| 日韩电影二区| √禁漫天堂资源中文www| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 大码成人一级视频| 天天影视国产精品| 日韩av免费高清视频| 国产淫语在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 两个人免费观看高清视频| 国产精品 欧美亚洲| 精品一品国产午夜福利视频| 免费av中文字幕在线| 久久久精品免费免费高清| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 熟女av电影| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 91老司机精品| 在线天堂中文资源库| 久久精品久久精品一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 大片免费播放器 马上看| 90打野战视频偷拍视频| 人妻人人澡人人爽人人| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久99一区二区三区| 91老司机精品| 少妇精品久久久久久久| 欧美精品一区二区大全| 伦理电影免费视频| 久久久久久久国产电影| 男女边摸边吃奶| 日日摸夜夜添夜夜爱| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲国产日韩一区二区| 成人国语在线视频| 国产99久久九九免费精品| 亚洲专区中文字幕在线| 国产黄频视频在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 黄色片一级片一级黄色片| 少妇粗大呻吟视频| 又大又黄又爽视频免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费少妇av软件| 一边亲一边摸免费视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 99久久精品国产亚洲精品| 乱人伦中国视频| bbb黄色大片| 精品人妻1区二区| 大码成人一级视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 成人影院久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 两性夫妻黄色片| 亚洲成人免费电影在线观看 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 777米奇影视久久| 午夜福利乱码中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产1区2区3区精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久99一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| av网站在线播放免费| 国产成人系列免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 熟女av电影| 国产免费视频播放在线视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 中文欧美无线码| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人影院久久| 国产精品.久久久| 婷婷色综合www| 永久免费av网站大全| 亚洲三区欧美一区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产人伦9x9x在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 午夜福利视频精品| 国产成人精品在线电影| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 男女下面插进去视频免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 中国美女看黄片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产成人影院久久av| 欧美成人精品欧美一级黄| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 搡老岳熟女国产| 国产精品免费大片| 在线精品无人区一区二区三| 日日爽夜夜爽网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美性长视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 999精品在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| av欧美777| 看免费av毛片| 国产伦人伦偷精品视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| bbb黄色大片| 美女中出高潮动态图| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产精品一区二区在线观看99| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲av高清不卡| 日本色播在线视频| 无遮挡黄片免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| videosex国产| a 毛片基地| 久9热在线精品视频| 少妇精品久久久久久久| av天堂久久9| av有码第一页| 老司机影院成人| 一区二区三区精品91| 精品人妻1区二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 三上悠亚av全集在线观看| xxx大片免费视频| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线观看免费日韩欧美大片| av天堂在线播放| 欧美国产精品一级二级三级| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产av影院在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 午夜福利视频精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 高清av免费在线| 黄色一级大片看看| 国产精品99久久99久久久不卡| 观看av在线不卡| 精品视频人人做人人爽| av国产精品久久久久影院| 亚洲欧美精品自产自拍| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 精品少妇黑人巨大在线播放| av不卡在线播放| 午夜av观看不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 黄片播放在线免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜两性在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久精品久久精品一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 黄色 视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx| 久久av网站| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一区福利在线观看| 色播在线永久视频| 国产黄色免费在线视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品一二三区在线看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产午夜精品一二区理论片| av电影中文网址| 国产精品成人在线| 天天影视国产精品| 91精品国产国语对白视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美日韩黄片免| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品九九99| 秋霞在线观看毛片| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产在线免费精品| 国产精品免费视频内射| 日韩大片免费观看网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 观看av在线不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 一本大道久久a久久精品| 成人黄色视频免费在线看| 久久狼人影院| 午夜日韩欧美国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 波多野结衣av一区二区av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线看a的网站| 亚洲 国产 在线| 欧美精品av麻豆av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人国产一区最新在线观看 | 精品久久久久久久毛片微露脸 | 一个人免费看片子| 久久青草综合色| 丝袜人妻中文字幕| 搡老岳熟女国产| 色播在线永久视频| 亚洲熟女精品中文字幕|