大黃素對(duì)人肝癌HepG 2細(xì)胞遷移侵襲能力及E-鈣黏蛋白、Slug蛋白表達(dá)的影響

高俊霞，呂強(qiáng)

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.穆棱市八面通林業(yè)局職工醫(yī)院，黑龍江 穆棱 157500

大黃素對(duì)人肝癌HepG 2細(xì)胞遷移侵襲能力及E-鈣黏蛋白、Slug蛋白表達(dá)的影響

高俊霞1，呂強(qiáng)2

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.穆棱市八面通林業(yè)局職工醫(yī)院，黑龍江 穆棱 157500

目的觀察大黃素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Slug蛋白表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，大黃素低、高劑量組分別加入10、20 μmol/L大黃素，陰性對(duì)照組加入等體積RPM I-1640培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加入10 μmol/L 5-氟尿嘧啶。分別采用細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察HepG2細(xì)胞黏附率、遷移、侵襲能力；Western blot檢測(cè)E-cadherin和Slug蛋白表達(dá)。結(jié)果與陰性對(duì)照組比較，大黃素低、高劑量組顯著抑制HepG2細(xì)胞黏附率、遷移、侵襲能力，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，Slug蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性。結(jié)論大黃素能明顯抑制HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與增強(qiáng)E-cadherin及抑制Slug蛋白表達(dá)有關(guān)。

大黃素；肝細(xì)胞癌；遷移；侵襲；E-鈣黏蛋白；Slug蛋白

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人肝癌 HepG2細(xì)胞，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科惠贈(zèng)。

1.2 藥物及制備

大黃素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)140675-201410。1 mg大黃素溶于200 μL 0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶液，溶解后依次加入7.4mL滅菌三蒸水、50 μL 5 mol/L NaOH溶液，過(guò)濾后溶液作為母液，濃度為500 μmol/L，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時(shí)以滅菌三蒸水稀釋至所需濃度。

1.3 主要試劑及儀器

5-氟尿嘧啶（5-Fu），上海海普藥廠，批號(hào)150073；DMSO，徐州試劑二廠，批號(hào)150217；牛血清白蛋白（BSA），PAA公司，批號(hào)715396；Matrigel基質(zhì)膠和RPM I-1640培養(yǎng)液，美國(guó)HyClone公司；E-cadherin、Slug多克隆抗體，美國(guó)ProMab公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG二抗，美國(guó)Santa Cruz公司；Trizol試劑盒，美國(guó) Invitrogen公司。CO2培養(yǎng)箱（MCO-20AIC），日本 SANYO；紫外可見(jiàn)分光度計(jì)（Libra S22），英國(guó)Biochrom；移液槍（Thermo F2），美國(guó)Thermo；倒置顯微鏡（CKX41），日本Olympus；熒光顯微鏡（IX51），日本Olympus。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%BSA和5%青-鏈霉素雙抗的RPM I-1640培養(yǎng)液中。置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d更換培養(yǎng)液，當(dāng)HepG2細(xì)胞達(dá) 80%匯合度時(shí)，用 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)48 h。收集懸浮細(xì)胞經(jīng)EDTA處理制備成單細(xì)胞懸液，然后用RPM I-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［8］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低劑量組加10 μmol/L大黃素50 μL，高劑量組加20 μmol/L大黃素50 μL，陽(yáng)性對(duì)照組加10 μmol/L 5-Fu 50 μL，陰性對(duì)照組加50 μL RPM I-1640培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)24 h。調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)細(xì)胞/mL，接種于涂有 10 μg/mL Ⅳ型膠原 500 μL的 24孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)30 min。PBS洗滌去除未結(jié)合的懸液細(xì)胞，乙醇固定貼壁細(xì)胞。0.1%結(jié)晶紫染色，0.2%Triton X-100固定，于波長(zhǎng)550 nm處紫外分光度法測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞黏附率。細(xì)胞黏附率（%）=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值÷陰性對(duì)照組細(xì)胞A值×100%

2.2 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞按照細(xì)胞密度1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞單層生長(zhǎng)鋪滿板底時(shí)，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部劃“一”字型劃痕。各組給藥同“2.1”項(xiàng)。37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)24 h。鏡下檢測(cè)細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的相對(duì)距離并拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移面積÷陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，取其平均值。

2.3 Transwel l小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室用前鋪上50 μL 0.5%Matrigel膜基質(zhì)37 ℃孵育過(guò)夜。HepG2細(xì)胞各組給藥同“2.1”項(xiàng)。調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，分別取200 μL接種于Transwell小室內(nèi)室，并在Transwell小室下室加入含有10%BSA的RPM I-1640培養(yǎng)液。孵育24 h后，取出Transwell小室，去除未穿膜細(xì)胞。甲醇固定15 min。OlympusIX51熒光顯微鏡計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)選取 10個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western blot檢測(cè)E-鈣黏蛋白和Slug蛋白表達(dá)

HepG2細(xì)胞各組給藥同“2.1”項(xiàng)。37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)24 h。按細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取50 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%～12%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，濕法電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含1%脫脂奶粉TBS和0.1%TBST封閉超過(guò)2 h，TBST洗膜3次，每次3 min，加E-cadherin或Slug多克隆抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次3 min。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000），常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次3 min。β-actin作為內(nèi)參照。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)富士生物圖像處理軟件進(jìn)行目的條帶的表達(dá)檢測(cè)及分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad5.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以

±s表示，正態(tài)分布資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大黃素對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力的影響

與陰性對(duì)照組比較，大黃素低、高劑量組對(duì)HeepG2細(xì)胞黏附率具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性，見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞--基質(zhì)黏附率比較

4.2 大黃素對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

與陰性對(duì)照組比較，大黃素低、高劑量組對(duì)HeepG2細(xì)胞遷移具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性，見(jiàn)圖22。

圖22 各組細(xì)胞遷移能力比較（×1000）

4.3 大黃素對(duì)HepG2細(xì)胞體外侵襲能力的影響

與陰性對(duì)照組比較，大黃素低、高劑量組對(duì)Hepp G2細(xì)胞侵襲能力具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜00.01），并呈濃度依賴性，見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞TTranswell小室體外侵襲能力比較（×100）

4.4 大黃素對(duì)HHeepG2細(xì)胞E--鈣黏蛋白、SS lug蛋白表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較，大黃素低、高劑量組HepG22細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），Slugg蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性，見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞E-cadherin和Slug蛋白表達(dá)比較

5 討論

HCC高死亡率的主要因素之一是遷移和侵襲特別迅速，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT）是增強(qiáng)癌細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處遷移以及抑制癌細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵因素。

EMT最主要的標(biāo)志性變化是 E-cadherin表達(dá)的減少或丟失。E-cadherin是一類(lèi)主要介導(dǎo)細(xì)胞之間相互黏附的鈣依賴性跨膜蛋白，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，廣泛參與細(xì)胞間的連接，對(duì)于維持正常上皮細(xì)胞的完整性十分重要。研究表明，E-cadherin結(jié)構(gòu)和功能異?？芍掳┘?xì)胞間黏附松散，癌細(xì)胞極易從原發(fā)部位脫落，并沿淋巴管血管外膜及組織間隙浸潤(rùn)蔓延，破壞鄰近正常組織并繼續(xù)生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移癌［9］。E-cadherin的表達(dá)下調(diào)或抑制和功能喪失均可啟動(dòng) EMT，癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)這種細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化獲得更高的侵襲性。在對(duì)E-cadherin表達(dá)調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，Slug起到?jīng)Q定性作用。Slug是Snail超家族成員之一，能識(shí)別E-cadherin基因啟動(dòng)子上 E2-box元件以抑制靶基因 E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，共同促進(jìn)癌細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。有研究表明，Slug的過(guò)表達(dá)同時(shí)伴有E-cadherin的低表達(dá)或缺失與誘發(fā)胰腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)［10-13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可顯著抑制HepG2細(xì)胞基質(zhì)黏附能力，提示大黃素可能具有潛在抑制 HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的能力。劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素可顯著降低HepG2細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)，提示大黃素可抑制HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證大黃素抑制HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制，本研究對(duì)E-cadherin和Slug的表達(dá)進(jìn)行了分析。Western blot分析結(jié)果顯示，大黃素可顯著增強(qiáng) E-cadherin蛋白表達(dá)并且抑制 Slug蛋白表達(dá)，提示大黃素抑制HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力可能是通過(guò)增強(qiáng)E-cadherin的蛋白表達(dá)以及抑制 Slug的蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

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（修回日期：2015-09-03；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Emodin on Migration and Invasion Ability and Expressions of E-cadherin and Slug of Human Hepatoma Cell Lines HepG2

GAO Jun-xia1， LV Qiang2
（1. Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China； 2. Muling Bamiantong Forestry Worker Hospital，Muling 157500， China）

ObjectiveTo investigate the effects of emodin on the migration and invasion ability and expressions of E-cadherin and Slug of human hepatoma cell lines HepG2； To discuss the possible mechanisms of anti-hepatocellular carcinoma.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro. The experimental group was treated with emodin at concentrations of 10 μmol/L and 20 μmol/L as. The negative control group was treated with the same volume of RPM I-1640 medium， while the positive control group was treated with 10 μmol/L floxuridine. The cell matrix adhesion assay， wound healing and transwell chamber in vitro invasion assay were used to observe the effects of emodin on HepG2 cell adhesion rate and migration and invasion ability. Western blot analysis was used to observe the changes of expressions of E-cadherin and Slug.ResultsCompared with the negative control group， emodin inhibited significantly HepG2 cell adhesion rate and migration and invasion ability were in a dose-dependent manner（P＜0.05，P＜0.01）； Western blot analysis showed that the protein expression of E-cadherin increased significantly， and the level of Slug decreased significantly in a dose-dependent manner （P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionEmodin can significantly inhibit migration and invasion of HepG2 cells， which mechanism may up-regulate expressions of E-cadherin and down-regulate Slug.

emodin； hepatocellular carcinoma； migration； invasion； E-cadherin； Slug protein

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.017

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0064-04

呂強(qiáng)，E-mail：lvqiang1966@163.com

2015-08-17）

大黃素是從大黃中提取的有效單體，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功效功效［1-2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，大黃素抗腫瘤作用明顯，對(duì)宮頸癌、大腸癌、肝癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞具有殺傷和抑制作用［3-5］，大黃素還可通過(guò)促進(jìn)人肝癌 HepG2細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用［6］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)目前十分常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、早期癥狀不典型、惡性程度高、臨床治療困難、預(yù)后不良、病死率高等特點(diǎn)，遷移和侵襲是患者死亡和治療效果不理想的主要原因［7］。目前放療、化療等治療HCC的手段已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期，然而其分子機(jī)制尚未明了。雖然大黃素具有促進(jìn) HepG2細(xì)胞凋亡作用，但是有關(guān)其對(duì) HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。另外，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和Slug蛋白被證實(shí)是與多種惡性腫瘤遷移和侵襲相關(guān)的蛋白。因此，本研究采用體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，觀察大黃素對(duì)HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力及E-cadherin、Slug蛋白表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。