三峽庫(kù)區(qū)栽培重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元含量測(cè)定

張靜，丁博，祁俊生，陳秀紅，周濃

1.重慶三峽學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 404000；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000

三峽庫(kù)區(qū)栽培重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元含量測(cè)定

張靜1，丁博2，祁俊生1，陳秀紅1，周濃2

1.重慶三峽學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 404000；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000

目的建立高效液相色譜法測(cè)定重樓中薯蕷皂苷元含量，考察不同產(chǎn)地和不同品種重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元的含量。方法采用島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（92∶8）為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果不同產(chǎn)地、不同品種的重樓屬藥材中均含有薯蕷皂苷元，渝北區(qū)的長(zhǎng)藥隔重樓含量最高（6.813 7 mg/g），城口縣的狹葉重樓含量次之（5.758 4 mg/g），最低的為石柱縣的滇重樓（1.952 2 mg/g），表明不同栽培品種重樓藥材化學(xué)品質(zhì)差異較大，可能與產(chǎn)地、品種及栽培技術(shù)等因素有關(guān)。結(jié)論非藥典品種長(zhǎng)藥隔重樓、狹葉重樓含量超過(guò)中國(guó)藥典收載品種，具有較大的藥用價(jià)值。

重樓；薯蕷皂苷元；高效液相色譜法；質(zhì)量評(píng)價(jià)

重樓主要活性成分為薯蕷皂苷和偏諾皂苷等類(lèi)型，薯蕷皂苷通過(guò)水解可以得到薯蕷皂苷元［1-2］。薯蕷皂苷元是合成甾體激素類(lèi)藥物的重要原料，具有抗腫瘤、抗炎、心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性，為重樓藥材生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)［3］。三峽地區(qū)為重樓屬藥用植物的地理分布中心之一，藥材品種較為豐富［4-5］，但存在種質(zhì)來(lái)源復(fù)雜、分類(lèi)不明等嚴(yán)重問(wèn)題，導(dǎo)致其開(kāi)發(fā)利用率較低。目前，已有對(duì)滇重樓［6］、七葉一枝花［7］、北重樓［8］等重樓藥材中薯蕷皂苷元含量測(cè)定的報(bào)道。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定重樓藥材中薯蕷皂苷元含量，并對(duì)比三峽庫(kù)區(qū)不同產(chǎn)地、不同品種重樓藥材質(zhì)量，以期為三峽庫(kù)區(qū)重樓藥材資源的合理開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），RV 10 basic V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA集團(tuán)），CP225D型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

重樓新鮮根莖采自重慶市開(kāi)縣滿(mǎn)月鄉(xiāng)雙坪村1組等地，每份樣品均取10株成熟植株根莖以保證樣品代表性，并由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員鑒定（見(jiàn)表 1）。薯蕷皂苷元對(duì)照品（批號(hào) 111539-200001，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用）。色譜純乙腈為德國(guó)默克公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

表1 重樓樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（92∶8），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，采集時(shí)間10 min，理論板數(shù)以薯蕷皂苷元峰面積計(jì)不得低于4000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 重樓中薯蕷皂苷元HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含0.539 0 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

參照周氏等［6］方法略作修改。精密稱(chēng)取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.20g，置250mL具塞三角瓶中，加入石油醚（60～90 ℃）50mL，超聲提?。?00 W，40 kHz）2 h，棄石油醚，殘?jiān)尤爰状?5mL，超聲提?。?00 W，40 kHz）40 min，放冷，過(guò)濾，重復(fù)操作1次，合并濾液，減壓回收甲醇至干，加2 mol/L鹽酸10mL，置沸水浴中水解2.5 h，放冷，置分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）萃取3次，每次30mL，合并石油醚萃取液，水洗至中性，減壓回收石油醚至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品貯備溶液，采用逐級(jí)稀釋法分別制得薯蕷皂苷元的0.027 0、0.053 9、0.134 8、0.269 5、0.404 3、0.539 0 mg/mL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，注入液相色譜儀，得進(jìn)樣量（μg）與峰面積的線(xiàn)性方程。結(jié)果表明，薯蕷皂苷元在0.54～10.78 μg線(xiàn)性范圍內(nèi)其進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=631 205X+52 970，r=0.999 8（n=6）。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S3），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6次，測(cè)得薯蕷皂苷元峰面積的 RSD= 0.35 %，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S3），室溫密閉放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在0～24 h每隔4 h測(cè)定1次，結(jié)果薯蕷皂苷元峰面積RSD=1.89%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一重樓樣品6份（S3），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果薯蕷皂苷元的平均含量為 2.539 5mg/g，RSD= 1.61%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量的重樓藥材粉末約0.10g（S3），共6份，分別精密加入薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，薯蕷皂苷元平均回收率為96.81%，RSD=1.48%，符合分析要求（見(jiàn)表2）。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣前過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算各重樓中薯蕷皂苷元的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地不同品種重樓藥材中薯蕷皂苷元含量（mg/g，n=3）

3 討論

對(duì)不同流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)和供試品溶液的制備方法［6-8］進(jìn)行了綜合考察，結(jié)果表明，以乙腈-水（92∶8）的流動(dòng)相體系等度洗脫所得色譜峰分離效果最佳；檢測(cè)波長(zhǎng)在203 nm處薯蕷皂苷元有最大吸收；甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min，超聲提取2次，酸水解、有機(jī)溶劑萃取即可將重樓中的薯蕷皂苷元基本提取完全。

本研究結(jié)果表明，三峽庫(kù)區(qū)不同產(chǎn)地的重樓藥材普遍含有薯蕷皂苷元，但同一品種的不同產(chǎn)地重樓藥材中薯蕷皂苷元含量存在較大差異，其中以重慶市城口縣與重慶市石柱縣產(chǎn)狹葉重樓中薯蕷皂苷元含量相差近2倍，重慶石柱縣與重慶市萬(wàn)州區(qū)產(chǎn)滇重樓中薯蕷皂苷元含量也相差近2倍，但3個(gè)不同產(chǎn)地的七葉一枝花含量相差甚微，與付氏等［11］報(bào)道類(lèi)似。造成三峽庫(kù)區(qū)不同產(chǎn)地重樓薯蕷皂苷元含量差異的原因，可能與栽培技術(shù)、產(chǎn)地環(huán)境等有關(guān)［9-11］，表明需加大對(duì)重樓的人工栽培技術(shù)和產(chǎn)地適宜性研究，以確保重樓藥材資源可持續(xù)利用和重樓醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

除2個(gè)中國(guó)藥典法定品種（七葉一枝花和滇重樓）外，筆者還采集到其他5個(gè)種/變種，試驗(yàn)結(jié)果表明，重樓屬不同種植物的薯蕷皂苷元含量存在較大差異（1.952 2～6.813 7 mg/g），渝北區(qū)的長(zhǎng)藥隔重樓含量最高，城口縣的狹葉重樓含量次之，最低的為石柱縣的滇重樓。不同品種間薯蕷皂苷元含量差異較大，非藥典品種能否代替重樓入藥有待進(jìn)一步深入研究。

前期研究表明，重樓屬植物大部分品種均在入藥，且部分品種與中國(guó)藥典收載品種（滇重樓和七葉一枝花）具有一定的化學(xué)成分等同性［4，11-12］。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，不同品種重樓藥材中薯蕷皂苷元含量差別很大，而民間有代用的習(xí)慣，因此制定其含量標(biāo)準(zhǔn)是很有科學(xué)意義的。

致謝：中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員在植物標(biāo)本鑒定中給予的幫助。

［1］ 黃賢校，高文遠(yuǎn)，滿(mǎn)淑麗，等.重樓屬藥用植物皂苷類(lèi)化學(xué)成分及其生源途徑的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2009，40（3）：483-489.

［2］ 吳珊，吳衛(wèi)，鄭有良.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定重樓藥材中 4種皂苷的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（8）：1896-1897.

［3］ 盛芳園，何忠梅，陳凱，等.薯蕷皂苷元的提取分離、檢測(cè)方法及藥理作用研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（4）：914-917.

［4］ 劉正宇.重慶市三峽庫(kù)區(qū)藥用植物資源名錄［M］.重慶：重慶出版社，2007：585-587.

［5］ 張植瑋，劉正宇，陳玉菡，等.重慶三峽庫(kù)區(qū)重樓屬藥用植物資源調(diào)查［J］.資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng)，2008，24（3）：254-256.

［6］ 周濃，郭吉芬，楊麗云，等.HPLC測(cè)定不同采收期滇重樓中薯蕷皂苷元的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（18）：54-56.

［7］ 李于善，周強(qiáng)，張玉針，等.三峽七葉一枝花薯蕷皂苷元的分離提取工藝研究［J］.化學(xué)世界，2009，50（2）：86-89.

［8］ 毛淑敏，劉娟.RP-HPLC法測(cè)定北重樓中薯蕷皂苷元的含量［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（4）：65-66.

［9］ 楊斌，李紹平，嚴(yán)世武，等.滇重樓資源現(xiàn)狀及可持續(xù)利用研究［J］.中藥材，2012，35（10）：1698-1700.

［10］ 楊永紅，戴麗君，何昆鴻，等.土壤營(yíng)養(yǎng)與人工栽培滇重樓品質(zhì)相關(guān)性評(píng)價(jià)［J］.中藥材，2012，35（10）：1557-1561.

［11］ 付紹智，李楠，劉振，等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地重樓屬植物中7種甾體皂苷成分［J］.中草藥，2012，43（12）：2435-2437.

［12］ 楊德全，楊勤，周濃.多基源重樓的質(zhì)量等同性研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（3）：91-94.

Content Determ ination of Diosgenin in Paridis Rhizoma Medicinal Plants in Different Habitats of Three Gorges Reservoir

ZHANG Jing1， DING Bo2， QI Jun-sheng1， CHEN Xiu-hong1，ZHOU Nong2
（1. College of Environmental and Chemical Engineering， Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000， China； 2. College of Life Science & Engineering， Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000， China）

ObjectiveTo establish an HPLC method to determine the content of diosgenin in Paridis Rhizoma； To examine contents of diosgenin in different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and from different habitats.MethodsShimadzu Inertsil ODS-C18guard column （150 mm×4.6 mm， 5μm） was used in HPLC system； elution conditions were the mobile phase using 92% acetonitrile and 8% water （isocraticelution） at a flow rate of 1.0mL/min with 203 nm detection wavelength. The temperature of the column oven was maintained at 30 ℃.ResultsDifferent varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and Paridis Rhizoma medicinal plants from different habitats contained diosgenin. TheParis polyphyllavar.pseudothibeticain Yubei district had the highest content （6.813 7 mg/g）；Paris polyphyllavar.stenophyllain Chengkou County had the middle content （5.758 4 mg/g）；Paris yunnanensisFranch in Shizhu county showed the lowest content （1.952 2 mg/g）. The results showed that the obvious difference of chem ical quality between various cultivated varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants， which might be related with origin，variety and the cultivation technology， and so on.ConclusionThe diosgenin contents ofParis polyphyllavar.pseudothibeticaandParis polyphyllavar.stenophyllawere higher than that of varieties recorded in Chinese Pharmacopeia.Paris polyphyllavar.pseudothibeticaandParis polyphyllavar.stenophyllahad important medical value.

Paridis Rhizoma； diosgenin； HPLC； quality evaluation

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.021

R284.1

A

1005-5304（2016）06-0080-04

2015-07-02）

（

2015-07-21；編輯：陳靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81260622）；萬(wàn)州區(qū)科委自然科學(xué)基金（201301024）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ131109）

周濃，E-mail：erhaizn@126.com