丹參酮ⅡA抗宮頸癌鱗癌細(xì)胞增殖效應(yīng)及其雌激素受體亞型介導(dǎo)機制的研究

臧金鳳 趙丕文 趙俊云 陶仕英 孫麗萍 牛建昭

摘要：目的 觀察丹參酮ⅡA對宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞增殖的影響，探討其作用機制。方法 不同濃度丹參酮ⅡA作用人宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)測定Siha細(xì)胞增殖速率和增殖周期分布，Western blot測定Siha細(xì)胞磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D表達(dá)。結(jié)果 1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹參酮ⅡA顯著抑制宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞增殖，該抑制作用可被雌激素受體（ER）α拮抗劑MPP增強、可被ERβ拮抗劑PHTPP減弱；1×10-5、5×10-6、1×10-6 mol/L丹參酮ⅡA干預(yù)后Siha細(xì)胞增殖指數(shù)顯著下降；1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹參酮ⅡA干預(yù)后Siha細(xì)胞p-ERK、Cyclin D蛋白表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論 丹參酮ⅡA抑制宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞增殖是通過靶細(xì)胞ER途徑實現(xiàn)的，并通過降低p-ERK、Cyclin D表達(dá)量發(fā)揮抗增殖作用。

關(guān)鍵詞：丹參酮ⅡA；宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞；雌激素受體；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；細(xì)胞周期蛋白D

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.014

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0051-05

Abstract： Objective To study the effects of tanshinone ⅡA on proliferation of cervical squamous cancer Siha cells； To discuss its possible molecular mechanism. Methods Cervical squamous cancer Siha cells were treated with different doses of tanshinone ⅡA. The effects of tanshinone ⅡA on proliferation of Siha cells were measured by MTT assay and flow cytometry analysis. The effects of tanshinone ⅡA on expression levels of phospho-extracellular regulate kinase （p-ERK） and Cyclin D in Siha cells were measured by Western blot. Results 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7 mol/L tanshinone ⅡA significantly inhibited Siha cell proliferation and such effect could be enhanced by ERα antagonist MPP and attenuated by ERβ antagonist PHTPP. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6 tanshinone ⅡA could significantly decrease the proliferation index of Siha cells. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7 mol/L tanshinone ⅡA could significantly reduce the protein expression levels of p-ERK and Cyclin D of Siha cells. Conclusion Tanshinone ⅡA can inhibit cervical squamous cancer Siha cell proliferation and such effect is realized via estrogen receptor pathway. Tanshinone ⅡA plays anti-proliferation roles by reducing the expression levels of p-ERK and Cyclin D.

Key words： Tanshinone ⅡA； cervical squamous cancer Siha cell； estrogen receptor； cell proliferation； cell cycle； phospho-extracellular regulate kinase； Cyclin D

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護(hù)心血管、增強機體免疫功能、抗菌、抗炎、抗氧化等作用[1-2]；特別是在多個靶器官均具有抗腫瘤功效[3-4]。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的重要脂溶性活性成分，是丹參發(fā)揮抗腫瘤作用的主要藥效成分[5]。本實驗前期研究表明，丹參酮ⅡA具有抗乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的作用[6]，且經(jīng)經(jīng)典核雌激素受體（ER）α和β介導(dǎo)。近年來，宮頸癌的發(fā)生率在婦科腫瘤中明顯上升[7]，丹參酮ⅡA是否具有抗宮頸癌的作用？該作用是否經(jīng)ER介導(dǎo)？2種ER亞型在介導(dǎo)過程中的作用是否有差異？為了驗證上述假設(shè)，本研究選取人宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞，探討丹參酮ⅡA對其增殖過程的影響及其ER亞型介導(dǎo)途徑。

1 實驗材料

1.1 藥物和細(xì)胞株

丹參酮ⅡA，中國食品藥品檢定研究院，純度98%。人宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM（高糖）、無酚紅DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭-葡聚糖處理胎牛血清，Hyclone公司；雌二醇（E2）、MTT、DMSO、RNase、碘化丙啶、甲醇，Sigma公司；β-肌動蛋白抗體，中杉金橋公司；磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D抗體，Santa Cruz公司；ERα、ERβ特異性拮抗劑MPP、PHTPP，Tocris公司；甘氨酸、Tween20，Amresco公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、蛋白相對分子質(zhì)量Marker、ECL超敏發(fā)光液，普利萊基因有限公司；二抗Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱（Binder），酶聯(lián)免疫檢測儀（Epson LX-800），倒置顯微鏡（Olympus），凝膠成像分析儀（Pharmacia），流式細(xì)胞儀（BD）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2及相對飽和濕度。實驗開始前4 d PBS洗滌細(xì)胞2次后，改為在無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）中培養(yǎng)，以耗盡細(xì)胞內(nèi)儲存的雌激素。

2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖速率

Siha細(xì)胞傳代3次，經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d后，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，加無血清DMEM，以細(xì)胞密度3×l03個/孔接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，換為含1×l0-8 mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹參酮ⅡA的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，拮抗組同時加入1×l0-8 mol/L MPP或PHTPP，每種受試物均設(shè)7個復(fù)孔。48 h后加MTT（5 mg/mL、15 μL/孔），繼續(xù)孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL。以DMSO調(diào)零，于酶標(biāo)儀570 nm處測定各孔吸光度（A）值，取其平均值，計算細(xì)胞增殖速率（實驗組A值÷對照組A值）。

2.3 細(xì)胞周期測定

取經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d的Siha細(xì)胞，以5×105個/瓶密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以無血清DMEM接種24 h待細(xì)胞貼壁后，換為含1×l0-8 mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹參酮ⅡA DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后終止，獲得細(xì)胞用70%冷乙醇4 ℃固定過夜，RNase處理，碘化丙啶染色，2 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，計算細(xì)胞增殖指數(shù)[（S+G2/M）÷（G0/G1+S+G2/M）×100%]。

2.4 Western blot檢測細(xì)胞磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、細(xì)胞周期蛋白D蛋白表達(dá)

細(xì)胞預(yù)處理過程同“2.3”項。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，12 000×g離心5 min，將上清液進(jìn)行蛋白含量測定后用于分析。蛋白變性后上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V），半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（80 V，75 min）。5%脫脂奶粉37 ℃振搖1 h將膜封閉；分別加p-ERK、Cyclin D、β-肌動蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗37 ℃振搖1 h后，將PVDF膜置ECL混合液中室溫下振蕩孵育5 min，X膠片曝光，顯影、定影、掃描后，以β-actin表達(dá)量為對照觀察結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 丹參酮ⅡA對Siha細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測顯示，48 h 時1×l0-8 mol/L E2可使Siha細(xì)胞增殖速率明顯增加（P<0.01），加入MPP或PHTPP后其促增殖作用均受到抑制。而1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹參酮ⅡA對Siha細(xì)胞增殖均具有抑制作用；加入MPP可增強其增殖抑制作用，而加入PHTPP拮抗其增殖抑制作用，見表1。

4.2 丹參酮ⅡA對Siha細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

48 h時，1×10-8 mol/L E2使Siha細(xì)胞增殖指數(shù)升高（P<0.01），1×10-5、5×10-6、1×10-6 mol/L丹參酮ⅡA使Siha細(xì)胞增殖指數(shù)降低（P<0.05，P<0.01），與E2作用趨勢相反，主要表現(xiàn)在S期細(xì)胞比例降低，而G0/G1期細(xì)胞比例增加，見表2、圖1。

4.3 丹參酮ⅡA對Siha細(xì)胞磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、細(xì)胞周期蛋白D蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測顯示，藥物作用48 h后，1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹參酮ⅡA可使Siha細(xì)胞p-ERK和Cyclin D表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，見圖2。

5 討論

據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，在女性惡性腫瘤中居第2位，占所有女性惡性腫瘤患者的13%，且近年來宮頸癌的發(fā)病人群呈現(xiàn)出年輕化趨勢[7]。據(jù)報道，宮頸鱗狀上皮癌變是篩查后宮頸活檢中最常見的病變[8]，占宮頸癌的95%[9]。本研究針對宮頸癌鱗癌Siha細(xì)胞，探討丹參酮ⅡA對該細(xì)胞增殖活性的影響及其可能的分子途徑與機制，以期為婦科腫瘤的臨床治療提供依據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA具有明顯的抑制Siha細(xì)胞增殖作用，并使細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低。值得注意的是，在Siha細(xì)胞增殖實驗體系中加入ERα特異性拮抗劑后，丹參酮ⅡA抑制Siha細(xì)胞增殖作用明顯增強；而加入ERβ特異性拮抗劑后，丹參酮ⅡA抗Siha細(xì)胞增殖作用顯著減弱。這一方面說明在Siha細(xì)胞中，作用于ER是丹參酮ⅡA發(fā)揮增殖抑制作用的重要靶點和途徑；另一方面也進(jìn)一步表明，ERα和ERβ在介導(dǎo)丹參酮ⅡA影響細(xì)胞增殖效應(yīng)中所起的作用不同，丹參酮ⅡA抑制Siha細(xì)胞增殖的效應(yīng)主要機制是經(jīng)ERβ介導(dǎo)，拮抗ERβ后其抑癌作用明顯減弱；而經(jīng)ERα介導(dǎo)的效應(yīng)則相反，故加入ERα拮抗劑后其抑癌作用可進(jìn)一步增強。另有研究顯示，ERα與ERβ在介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性方面的作用有所不同，ERβ在抑制基因轉(zhuǎn)錄活性方面的作用比ERα更強[10-11]。本研究細(xì)胞增殖實驗中ERβ被拮抗后丹參酮ⅡA的抑癌作用有所減弱的結(jié)果與此一致。

影響癌細(xì)胞增殖調(diào)控通路是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的主要途徑。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是與細(xì)胞增生和凋亡調(diào)節(jié)過程密切相關(guān)的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。作為MAPK家族成員，ERK活化后在細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、死亡及惡性轉(zhuǎn)化等過程中均可發(fā)揮作用。當(dāng)來自細(xì)胞內(nèi)外的各種絲裂原刺激激活ERK使其磷酸化為p-ERK后，即可活化由該因子介導(dǎo)的增殖相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲行為[12-13]。萬氏等[14]研究表明，ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活與乳腺癌的浸潤性生長有關(guān)，表皮生長因子即可通過異常激活ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激乳腺癌細(xì)胞浸潤性生長。Tzu-Ping等[15]也發(fā)現(xiàn)，p-ERK隨著正常宮頸組織向?qū)m頸癌的進(jìn)展，表達(dá)逐漸增強，表明ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常宮頸組織向?qū)m頸內(nèi)瘤變的演變過程中起重要作用。齊氏等[16]采用免疫組化SP法觀察114例宮頸鱗癌組織和50例正常宮頸組織石蠟標(biāo)本中p-ERK蛋白表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)，該蛋白在子宮頸鱗癌中陽性表達(dá)率（84.2%）顯著高于正常宮頸組織（16.0%）。本實驗結(jié)果表明，丹參酮ⅡA可降低p-ERK表達(dá)，從而抑制p-ERK介導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號傳導(dǎo)通路，下調(diào)細(xì)胞增殖速率。該結(jié)論與章氏等[17]提出的p-ERK在宮頸癌中過量表達(dá)的特征是宮頸癌演進(jìn)過程重要特征的觀點相一致。

同時，細(xì)胞周期中G1期到S期是其中的關(guān)鍵調(diào)控點。Cyclin D作為G1期細(xì)胞周期素[18]，可促進(jìn)細(xì)胞G1-S期時相的轉(zhuǎn)換[19]，現(xiàn)已被公認(rèn)為是原癌基因。Cyclin D基因激活并持續(xù)高表達(dá)，可使G1期縮短，使細(xì)胞提前進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖，最終形成腫瘤[20]。宋氏等[21]通過免疫組化SP法觀察比較Cyclin D在正常宮頸組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）中表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)，Cyclin D高表達(dá)與CSCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程均有密切關(guān)系。陳氏[22]也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中Cyclin D的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，且其表達(dá)與宮頸癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Cyclin D蛋白表達(dá)量與對照組比較明顯降低，提示丹參酮ⅡA可通過降低周期相關(guān)蛋白表達(dá)、下調(diào)Siha細(xì)胞增殖指數(shù)發(fā)揮抗癌作用。

總之，丹參酮ⅡA能明顯抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增殖，其作用機制與經(jīng)典ER途徑有關(guān)，并通過抑制p-ERK、Cyclin D表達(dá)水平的升高發(fā)揮細(xì)胞增殖阻滯作用。該結(jié)果為全面揭示丹參酮ⅡA通過ER途徑發(fā)揮抗婦科腫瘤活性的藥理機制補充了直接的實驗依據(jù)，也為婦科腫瘤、特別是宮頸癌鱗癌的臨床治療提供了參考。

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（收稿日期：2015-11-01）

（修回日期：2015-11-19；編輯：華強）