鐵皮石斛查爾酮合酶基因克隆與表達分析

孟衡玲 張薇 盧丙越 蘇一蘭 薛春麗

摘要：【目的】克隆鐵皮石斛中查爾酮合酶（CHS）基因，分析其基本生物學信息及組織表達特異性，為進一步研究CHS基因在鐵皮石斛中的表達調(diào)控機理及其在鐵皮石斛中的功能打下理論基礎(chǔ)。【方法】采用鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組序列與NCBI同源序列進行比對，根據(jù)保守區(qū)段設(shè)計引物克隆鐵皮石斛CHS基因的cDNA全長，采用實時熒光定量PCR定量表達分析不同生長年限、不同組織部位中CHS基因的表達水平?！窘Y(jié)果】鐵皮石斛CHS基因cDNA編碼區(qū)1188 bp，編碼395個氨基酸，GenBank登錄號KT783451，分子量為43.2 kD，理論等電點6.05。鐵皮石斛GHS氨基酸序列與同屬植物金釵石斛（Dendrobium nobile）的CHS氨基酸序列同源性最高，達99%，與非同科植物歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）、巨桉（Eucalyptus grandis）和紫玉蘭（Magnolia liliiflora）等植物的同源性在83%左右。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬非分泌蛋白，定位于細胞質(zhì)基質(zhì)中，為非跨膜結(jié)構(gòu)的親水性不穩(wěn)定蛋白。CHS基因在1年生鐵皮石斛葉片中的表達量最高，隨著植株年齡的增長，葉片中CHS基因的表達量降低，莖中的表達量升高?！窘Y(jié)論】鐵皮石斛CHS基因早期主要參與激素運輸和器官形態(tài)建成，后期主要參與類黃酮物質(zhì)合成。

關(guān)鍵詞： 鐵皮石斛；查爾酮合成酶；基因克?。粚崟r熒光定量PCR

中圖分類號： S567.239；Q785 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2015-05

Abstract：【Objective】The present study cloned chalcone synthase（CHS） gene and analyzed its basic biological information and tissue-specific expression in Dendrobium officinale， in order to lay a theoretical basis for further research on the function and expression regulation mechanism of CHS gene in D. officinale. 【Method】Comparing conserved sequence with NCBI homologous sequence， real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to analyze CHS gene expression in different tissues at different growth years based on cDNA full length of design-primer-cloned CHS gene in conserved domain. 【Result】The coding region of CHS gene in D. officinale was 1188 bp encoding 395 amino acids， molecular weight was 43.2 kD， theoretical isoelectric point 6.05， GenBank accession number KT783451. In terms of amino acid sequence，CHS in D. officinale showed the highest homology（99%） with that in Dendrobium nobile， its same generic plant. The homology between CHS sequence in D. officinale and its non-family plants Populus trichocarpa， Eucalyptus grandis and Magnolia liliiflora was around 83%. The encoded protein of CHS gene belonged to non-secreted protein which was located in cytoplasmic matrix. It was hydrophilic unstable protein with non-transmembrane structure. The expression level of CHS gene was the highest in one-year leaves of D. officinale. As growth year increased， the expression level of CHS gene decreased in leaves， but increased in stems. 【Conclusion】CHS gene in D. officinale is mainly involved in auxin transport and organ morphogenesis at early stage and participats in flavonoid biosynthesis at late stage.

Key words： Dendrobium officinale； chalcone synthase； gene cloning； real-time fluorescence quantitative PCR

0 引言

【研究意義】黃酮二糖碳苷類化合物是自然界中抗氧化作用最強的天然化合物之一，具有抑制活性氧和清除自由基的作用，在鐵皮石斛（Dendrobium officinale）的莖、葉和花中均有分布且含量豐富（周桂芬和呂圭源，2012）。查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是植物次生代謝途徑中黃酮類物質(zhì)合成的第一個關(guān)鍵酶，參與類黃酮合成（康亞蘭等，2014；田愛梅等，2014）。因此，克隆鐵皮石斛CHS基因并進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，對研究CHS基因在鐵皮石斛中的表達和黃酮類物質(zhì)的合成機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】CHS基因是一個較大的基因家族，在植物不同類群中CHS基因較保守，科之間存在70%～90%的氨基酸同源性（Lanz et al.，1991）。目前，已從玉米（Franken et al.，1991）、蘭花（Liew et al.，1998）、擬南芥（Saslowsky et al.，2000）和高粱（Lo et al.，2002）等600多種植物中克隆獲得CHS基因。研究表明，CHS基因不僅參與類黃酮的合成，還參與防輻射、抗病等生理活動，在植物體中的表達具有器官特異性，可能與器官形態(tài)建成、功能分化有一定聯(lián)系（蔣明和曹家樹，2007；劉濤等，2013；Yan et al.，2015；巫建華等，2016）。【本研究切入點】目前，關(guān)于鐵皮石斛CHS基因表達和功能的研究鮮見報道，限制了對鐵皮石斛黃酮合成及CHS基因功能的深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆鐵皮石斛CHS基因，分析其基本生物學信息及組織表達特異性，為研究CHS基因在鐵皮石斛中的表達調(diào)控機理及其在鐵皮石斛中的功能打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

鐵皮石斛由云南紅河州巨峰石斛種植有限公司提供，以其葉片為材料提取總RNA并進行CHS基因克隆。以1～3年生鐵皮石斛的根、莖、葉為材料分析不同生長年限、不同組織部位中CHS基因的表達水平。大腸桿菌DH5α由云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室自備，pMD 18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，總RNA提取試劑盒、DNA消化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript III First- Strand Synthesis SuperMix及qRT-PCR反應試劑PowerUpTM SYBR Green Master Mix購自Life Technologies公司。

1. 2 鐵皮石斛CHS基因克隆

用試劑盒提取鐵皮石斛總RNA，進行DNA消化，然后進行反轉(zhuǎn)錄，獲得鐵皮石斛cDNA模板。根據(jù)GenBank中CHS基因的保守區(qū)域，設(shè)計擴增特異性引物F1（5'-ATGGCGCCGCCGGCAATGGAAGAGA-3'）和R1（5'-TCACACCGCACCAGCAATCGGAACG-3'），以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴增獲得目的片段克隆到pMD18-T載體上，送至華大基因研究中心進行測序。

1. 3 鐵皮石斛CHS基因的生物信息學分析

采用Computer pI/Mw Tool在線軟件進行蛋白分子量、理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)預測；ExPASy ProtParam tool預測蛋白質(zhì)氨基酸組成，TMHMM的Transmembrane Prediction server預測跨膜結(jié)構(gòu)域，NCBI結(jié)構(gòu)分析軟件進行CHS基因結(jié)構(gòu)域分析。

1. 4 鐵皮石斛CHS基因的qRT-PCR分析

根據(jù)已獲得的鐵皮石斛CHS基因序列，設(shè)計qRT-PCR擴增引物CHS Forward（5'-GGTTCTCGTCGTTTG TTCAG-3'）和CHS Reverse（5'-TCGTTCAGTAGTCAAGTCAGG-3'），目的片段148 bp。根據(jù)金釵石斛內(nèi)參基因GAPDH（GQ250049.1）序列設(shè)計內(nèi)參引物GAPDH Forward（5'-GTGCCAAGAAGGTTATCATCTCTG-3'）和GAPDH Reverse（5'-CTCATGCTCATTAACACCAACAAC-3'），目的片段74 bp。使用ABI7500熒光定量PCR儀進行qRT-PCR分析，每個樣本重復3次，擴增程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，進行45個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后從60 ℃升高到98 ℃獲取熔解曲線。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鐵皮石斛CHS基因全長克隆

2. 1. 1 鐵皮石斛總RNA提取及CHS基因全長擴增 經(jīng)SMA4000超微量分光光度計（Merinton）檢測，提取的鐵皮石斛總RNA純度高，OD260/280在1.8～2.0。以鐵皮石斛cDNA為模板，F(xiàn)1/R1為引物，經(jīng)PCR擴增獲得一條約1200 bp的特異性條帶（圖1），將擴增片段純化回收，克隆到pMD18-T載體上，篩選陽性質(zhì)粒進行基因測序。結(jié)果表明，鐵皮石斛CHS基因cDNA編碼區(qū)共1188 bp，編碼395個氨基酸，GenBank登錄號為KT783451。CHS基因CDS序列中A+T含量為56.58%，G/C含量為43.42%，A和T的含量明顯高于G和C的含量。

2. 1. 2 鐵皮石斛CHS基因同源性分析 采用MEGA 5.0軟件UPGMA法構(gòu)建基于CHS氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），NCBI BLASTp分析結(jié)果顯示，鐵皮石斛CHS氨基酸序列與同屬植物金釵石斛（Dendrobium nobile）CHS氨基酸序列一致性最高，其同源性達99%，與歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）、巨桉（Eucalyptus grandis）和紫玉蘭（Magnolia liliiflora）等植物的CHS氨基酸序列同源性在83%左右，說明鐵皮石斛CHS基因的保守性較高。

2. 1. 3 鐵皮石斛CHS基因的生物信息學分析 對CHS基因編碼蛋白進行分子量和等電點預測分析，發(fā)現(xiàn)該基因蛋白分子量為43.2 kDa，理論等電點為6.05，不穩(wěn)定系數(shù)為45.59。CHS蛋白氨基酸中，亮氨酸所占比例最高，為10.9%。TMHMM的Transmembrane Prediction server預測結(jié)果表明，CHS蛋白為非跨膜結(jié)構(gòu)親水性不穩(wěn)定蛋白，無信號肽，定位于細胞質(zhì)基質(zhì)中。NCBI結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白序列具有多個活性位點，5個結(jié)構(gòu)功能域，包括有N-末端結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域和聚酮合酶結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2. 2 鐵皮石斛CHS基因的定量表達分析結(jié)果

將1年生根的表達量設(shè)為對照（2-△△Ct定義為1），從圖4可看出，鐵皮石斛中CHS基因的表達水平在不同生長年限、不同組織部位間差異明顯。方差分析結(jié)果表明，CHS基因在1年生葉中的表達量最高，與1年生和3年生莖中的表達量無顯著差異（P>0.05），2年生和3年生葉中的表達量最低，僅為1年生葉中表達的10%左右。CHS基因在不同生長年限根中的表達量差異較小，其中2年生根的表達量顯著高于1年生和3年生根（P<0.05）。不同生長年限、不同組織部位中鐵皮石斛CHS基因表達量排序為：1年生葉>1年生莖>3年生莖>2年生根>1年生根>3年生根>2年生莖>3年生葉>2年生葉。

3 討論

CHS超基因家族屬于生物聚酮合酶（Polyketide synthases，PKS）中結(jié)構(gòu)最簡單的類型，即III型聚酮合酶類（Zhan，2009；Abe and Morita，2010）。III型聚酮合酶類可催化多種聚酮化合物的生物合成，這些聚酮化合物具有抗菌、消炎、提高人體免疫力和抗癌等藥理功效（Jez et al.，2001），在植物器官著色（田鵬等，2015）、病蟲害防護和紫外輻射抵御（Abe and Morita，2010）等方面起著非常重要的作用。CHS是超基因家族中的核心酶，也是目前研究最透徹的酶，大量研究主要集中于CHS對花色素合成的調(diào)節(jié)（李冬梅等，2012；張云婷等，2013；康亞蘭等，2014；田愛梅等，2014；王旭等，2014），但在植物生長發(fā)育與代謝途徑方面的研究較少。因此，對III型聚酮合成酶，特別是對其整個超基因家族的深入研究可為尋找新型藥物、提升植物本身營養(yǎng)構(gòu)成和促進作物的遺傳改良等提供新的途徑（包穎等，2015）。

本研究克隆了鐵皮石斛CHS基因cDNA全長，并對CHS基因在不同生長年限、不同組織部位進行實時定量表達分析。鐵皮石斛CHS基因編碼區(qū)序列高度保守，氨基酸序列與同屬金釵石斛、細莖石斛的同源性高達99%。定量表達分析結(jié)果表明，CHS基因在1年生組織中的相對表達水平較高，但在2年生和3年生鐵皮石斛葉片中的表達量很低，說明鐵皮石斛CHS基因的表達與植物組織器官及生長發(fā)育時期或生長年限有關(guān)（Xu et al.，2007），CHS基因早期在葉中的表達量最高，主要是參與生長激素運輸和器官形態(tài)建成，與Knogge等（1986）的研究觀點一致。隨著植株的成熟，3年生莖中的表達量最高，此時CHS基因主要參與次生代謝物黃酮類化合物的合成。本研究結(jié)果為進一步探究鐵皮石斛中CHS基因的功能及表達調(diào)控打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

鐵皮石斛CHS基因保守性較高，在幼苗生長階段整體表達量較高，說明CHS基因早期主要參與植物激素運輸和器官形態(tài)建成；隨著植株的成熟，3年生鐵皮石斛根及葉中的CHS基因表達量降低，莖中的表達量升高，說明CHS基因后期主要參與黃酮類物質(zhì)合成。

參考文獻：

包穎，郭昌鋒，陳少華，劉梅. 2015. 植物查爾酮合成酶超基因家族的分子進化[J]. 植物學報，50（1）：55-71.

Bao Y，Guo C F，Chen S H，Liu M. 2015. Molecular evolution of chalcone synthase gene superfamily in plants[J]. Chinese Bulletin of Botany，50（1）：55-71.

蔣明，曹家樹. 2007. 查爾酮合成酶基因[J]. 細胞生物學雜志，29（4）：525-529.

Jiang M，Cao J S. 2007. Chalcone synthase gene[J]. Chinese Journal of Cell Biology，29（4）：525-529.

康亞蘭，裴瑾，劉薇，羅靜，劉維，陳翠平. 2014. 紅花查爾酮合成酶基因的克隆、生物信息學分析及表達[J]. 中草藥，45（16）：2385-2389.

Kang Y L，Pei J，Liu W，Luo J，Liu W，Chen C P. 2014. Cloning，bioinformatic analysis，and expression of chalcone synthase gene in Carthamus tinctorius[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，45（16）：2385-2389.

李冬梅，朱根發(fā)，操君喜，呂復兵，劉海林，孫映波. 2012. 兜蘭查爾酮合成酶基因的克隆與表達分析[J]. 熱帶作物學報，33（4）：655-662.

Li D M，Zhu G F，Cao J X，Lü F B，Liu H L，Sun Y B. 2012. Molecular cloning and expression analysis of a chalcone synthase gene from Paphiopedilum orchid[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，33（4）：655-662.

劉濤，牟蘭，梁艷麗，王建軍，楊生超. 2013. 燈盞花查爾酮合成酶基因表達與燈盞乙素含量關(guān)系的研究[J]. 中國中藥雜志，38（14）：2241-2244.

Liu T，Mu L，Liang Y L，Wang J J，Yang S C. 2013. Relationship between expression of chalcone synthase gene（CHS）and scutellarin content in Erigeron breviscapus[J]. China Journal of Chinese Material Medica，38（14）：2241-2244.

田愛梅，許忠民，張恩慧. 2014. 白芨查爾酮合成酶基因的克隆與分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報，23（7）：91-95.

Tian A M，Xu Z M，Zhang E H. 2014. Isolation and molecular characterization of BsCHS gene from Bletilla striata[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，23（7）：91-95.

田鵬，蘇艷麗，康保珊，魏聞東. 2015. 兩個紅梨品種花色苷合成相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子MYB10表達模式分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，31（1）：166-171.

Tian P，Su Y L，Kang B S，Wei W D. 2015. Analyses of expression patterns of transcription factor MYB10 and anthocyanin synthesis genes in two red shin pear varieties[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，31（1）：166-171.

王旭，韓春樂，周亞楠，王春國，宋文芹，陳成彬. 2014. 黃秋葵查爾酮合成酶基因AeCHS的克隆與表達分析[J]. 植物遺傳資源學報，15（3）：561-567.

Wang X，Han C L，Zhou Y N，Wang C G，Song W Q，Chen C B. 2014. Cloning and expression analysis of chalcone synthase gene（AeCHS）in Abelmoschus esculentus L.[J]. Journal of Plant Genetic Resources，15（3）：561-567.

巫建華，賈思振，馮英娜，王全智. 2016. 茉莉酸合成關(guān)鍵酶基因FaOPR3調(diào)控草莓果實成熟[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，32（5）：1148-1154.

Wu J H，Jia S Z，F(xiàn)eng Y N，Wang Q Z. 2016. Regulation of strawberry fruit ripening by jasmonic acid synthesis gene FaOPR3[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，32（5）：1148-1154.

張云婷，于定群，程怡，湯浩茹，王清明，張勇. 2013. 月季查爾酮合成酶基因片段的克隆及其表達分析[J]. 生物技術(shù)通報，（7）：66-70.

Zhang Y T，Yu D Q，Cheng Y，Tang H R，Wang Q M，Zhang Y. 2013. Cloning and expression analysis of chalcone synthase gene from rosa hybrid[J]. Biotechnology Bulletin，（7）：66-70.

周桂芬，呂圭源. 2012. 鐵皮石斛不同部位黃酮碳苷類成分及清除DPPH自由基能力比較研究[J]. 中國中藥雜志，37（11）：1536-1540.

Zhou G F，Lü G Y. 2012. Comparative studies on scavenging DPPH free radicals activity of flavone C-glycosides from different parts of Dendrobium officinale[J]. China journal of Chinese material medica，37（11）：1536-1540.

Abe I， Morita H. 2010. Structure and function of the chalcone synthase superfamily of plant type III polyketide synthases[J]. Natural Product Reports，27（6）：809-838.

Franken P，Niesbach-Kl sgen U，Weydemann U，Maréchal-Drouard L，Saedler H，Wienand U. 1991. The duplicated chalcone synthase genes C2 and Whp（white pollen）of Zea mays are independently regulated；evidence for translational control of Whp expression by the anthocyanin intensifying gene in[J]. EMBO Journal，10（9）：2605-2612.

Jez J M，F(xiàn)errer J L，Bowman M E，Austin M B，Schr der J，Dixon R A，Noel J P. 2001. Structure and mechanism of chalcone synthase-like polyketide synthases[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，27（6）：393-398.

Knogge W，Schmelzer E，Weissenb ck G. 1986. The role of chalcone synthase in the regulation of flavonoid biosynthesis in developing oat primary leaves[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，250（2）：364-372.

Lanz T，Tropf S，Marner F J，Schr der J，Schr der G. 1991. The role of cysteines in polyketide synthase. Site directeted mutagenesis of resveratrol and chalcone synthases，two key enzymes in different plant-specific pathways[J]. Journal Biology Chemistry，266（15）：9971-9976.

Liew C F，Goh C J，Loh C S. 1998. Cloning and characterization of full-length cDNA clones encoding chalcone synthase from the orchid Bromheadia finlaysoniana[J]. Plant Physiology and Biochemistry，36（9）：647-655.

Lo C，Coolbaugh R C，Nicholson R L. 2002. Molecular characterization and in silico expression analysis of a chalcone synthase gene family in Sorghum bicolor[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，61（3）：179-188.

Saslowsky D E，Dana C D，Winkel-Shirley B. 2000. An allelic series for the chalcone synthase locus in Arabidopsis[J]. Gene，225（2）：127-138.

Xu F，Cheng S Y，Cheng S H，Wang Y，Du H W. 2007. Time course of expression of chalcone synthase gene in Ginkgo biloba[J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，33（4）：309-317.

Yan L，Wang X，Liu H，Tian Y，Lian J，Yang R，Hao S，Wang X，Yang S，Li Q，Qi S，Kui L，Okpekum M，Ma X，Zhang J，Ding Z，Zhang G，Wang W，Dong Y，Sheng J. 2015. The genome of dendrobium officinale iIlluminates the biology of the important traditional Chinese orchid herb[J]. Molecular Plant，8（6）：922-934.

Zhan J. 2009. Biosynthesis of bacterial aromatic polyketides[J]. Current Topics in Medicinal Chemistry，9（17）：1958-1610.

（責任編輯 王 暉）