香草蘭VpLFY基因的克隆與表達(dá)分析

顧文亮 王輝 莊輝發(fā) 王華 朱自慧 宋應(yīng)輝

摘 要 花分生組織特征基因LEAFY在植物花芽分化與成花誘導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用。通過RACE方法從香草蘭中克隆VpLFY基因的全長cDNA序列。結(jié)果顯示，該基因包含一個1 493 bp的開放閱讀框，編碼491個氨基酸殘基。經(jīng)蛋白質(zhì)序列同源比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VpLFY屬于FLO-LFY家族。組織特異性研究結(jié)果表明，VpLFY基因在香草蘭組織中屬于組成型表達(dá)。熒光定量分析結(jié)果表明，VpLFY基因分別在香草蘭純花芽和混合花芽的不同發(fā)育階段中有著較強(qiáng)的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 香草蘭 ；VpLFY ；基因克隆 ；表達(dá)分析

分類號 S682.31 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.006

Molecular Cloning and Expression of VpLFY Gene from Vanilla

（Vanilla planifolia Andrews）

GU Wenliang1，2） WANG Hui1，3） ZHUANG Huifa1，3）

WANG Hua1，3） ZHU Zihui1，3） SONG Yinghui1，2，3）

（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533；

2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，

Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533；

3 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation

for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533）

Abstract Floral meristem identity gene LEAFY is a master regulator of flower bud differentiation and floral induction. In this study， we report the molecular characteristics of LFY gene cloned from Vanilla（Vanilla planifolia Andrews） using a RACE-PCR based strategy. VpLFY contained an open reading frame of 1 493 bp which encoded a polypeptide of 491 amino acids. Protein alignment showed that VpLFY contained typical domains which belonged to FLO-LFY protein family. Tissue-specific studies showed that the expression of VpLFY was constitutive expressed in various tissues of Vanilla. Fluorescent quantitative PCR analysises indicated that the expression of VpLFY were increased in reproductive bud and mixed bud at different stages of Vanilla flower bud differentiation. These results suggest that VpLFY may play an important role in the regulation of Vanilla flower bud differentiation and floral induction.

Keywords Vanilla planifolia Andrews ； VpLFY ； gene clone ； expression analysis

花分生組織特征基因LEAFY（以下簡稱LFY基因）在成花相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置[1]，是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)的中心，并且參與到多條花芽分化與成花誘導(dǎo)途徑中，其表達(dá)始終貫穿于花序分化和成花發(fā)育的各個階段，被認(rèn)為是成花轉(zhuǎn)變的標(biāo)志性基因[2]。LFY基因不僅促進(jìn)花分生組織的形成及其屬性的調(diào)控，而且參與維持花分生組織的功能、成花基因的啟動和防止花分生組織的逆轉(zhuǎn)，同時參與花分生組織屬性的決定及其進(jìn)一步發(fā)育[3]。

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是蘭科（Orchidaceae）香草蘭屬（Vanilla）熱帶攀援藤本植物，被譽(yù)為食品香料之王，廣泛用于食品、飲料、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)中[4]。香草蘭的花芽分化與成花誘導(dǎo)過程中存在著營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變不徹底的現(xiàn)象，這極大影響著生產(chǎn)種植上香草蘭的產(chǎn)量[5]。LFY基因在植物花芽分化與成花誘導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用。目前尚無香草蘭VpLFY基因的相關(guān)研究報(bào)道，克隆香草蘭VpLFY基因的全長序列并分析其功能，將有助于解析香草蘭花芽分化與成花誘導(dǎo)的分子機(jī)理。本研究基于香草蘭轉(zhuǎn)錄組測序信息，通過3′RACE和5′RACE方法從香草蘭中克隆了一個VpLFY基因，采用熒光定量分析該基因的表達(dá)模式，探討VpLFY基因在香草蘭中的表達(dá)特征，有助于進(jìn)一步解析香草蘭花芽分化與成花誘導(dǎo)的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株為生長3 a以上的墨西哥香草蘭，種植在海南省萬寧市南橋高龍的香料飲料研究所基地中，所有供試的香草蘭植株均為蔭蔽條件下露地栽培?？俁NA的提取選取花芽分化初期的香草蘭花芽組織。選擇長勢良好且大小一致的香草蘭植株，選取花芽分化不同階段的純花芽、混合花芽和葉芽等芽體組織。對香草蘭花芽分化進(jìn)行連續(xù)觀測至花分生組織分化，通過芽體組織的生長量及觀測數(shù)據(jù)將香草蘭花芽分化過程劃分為6個時期，分別為花芽特征分化期（I）、花芽分化初期（II）、花芽分化中期（III）、花序分化初期（IV）、花序分化中期（V）、花分化初期（VI）[6]。在香草蘭花芽分化的6個時期中，分別采集花芽、混合花芽和葉芽的芽體組織各6個待測樣品，取樣的芽體組織用液氮快速冷凍后放入-80℃超低溫冰箱中貯存。取樣的芽體組織用液氮快速冷凍后放入-80℃超低溫冰箱中貯存。

1.2 方法

1.2.1 香草蘭花芽組織總RNA的提取

香草蘭花芽組織總RNA的提取采用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）進(jìn)行，具體提取步驟參照該試劑盒說明書，對提取后的總RNA進(jìn)行分光光度計(jì)和電泳分析。

1.2.2 香草蘭VpLFY基因的克隆與分析

按照香草蘭的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計(jì)3′RACE與5′RACE引物，3′RACE擴(kuò)增的引物序列為LFY-F1（5′-CAAGTGCCCCACCAAGGTGACGAACC-3′）和LFY-F2（5′-CAAGCCCAAGATGCGGCATTACGTG-3′），5′RACE擴(kuò)增的引物序列為LFY-R1（5′-GGTCCTTGGCGACGGCTTGGACTT-3′）和LFY-R2（5′-GAGGAGGAACTCGTGGCATTGCTCGTAG-3′）。按照GeneRacer Kit（Invitrogen）說明書進(jìn)行RACE擴(kuò)增反應(yīng)。分別將3′RACE和5′RACE擴(kuò)增得到的特異條帶切膠回收，連接pLB Simple載體（天根），轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。DNA序列經(jīng)測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTn和蛋白數(shù)據(jù)庫BLASTx中進(jìn)行同源核苷酸和蛋白質(zhì)序列檢索。

1.2.3 香草蘭VpLFY基因的表達(dá)分析

選擇不同花芽分化階段的葉芽、花芽與混合花芽等芽體組織，按照RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）的說明書分別提取總RNA，用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）合成cDNA第一鏈。以VpActin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用熒光定量PCR方法對VpLFY基因的組織特異性表達(dá)和不同分化階段的表達(dá)特征進(jìn)行分析。檢測VpLFY基因的引物序列為VpLFY-F（5′-TGAGGGAGGAGGAGGTSGACGAYATGAT-3′）和VpLFY-R（5′-AGATBGAGAGGCGSGGATGSGCGTTGAA-3′）。內(nèi)參基因VpActin的引物序列為VpActin-F（5′-GGGTTACTCCTTTACGACCACA-3′）和VpActin-R（5′-GGGTTACTCCTTTACGACCACA-3′）。采用SYBR Green熒光染料，熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性7 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每個實(shí)驗(yàn)處理均做3次生物學(xué)重復(fù)，采用Excel 2010軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的香草蘭花芽組織總RNA（圖1），28 S和18 S RNA的條帶完整且邊緣清晰，說明總RNA樣品具有較好的完整性。經(jīng)分光光度計(jì)檢測，提取總RNA的OD260/OD280均在1.7～2.0，說明總RNA樣品純度較高。

2.2 VpLFY基因的克隆與序列分析

在香草蘭花芽分化組織的轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，通過3′RACE擴(kuò)增出一條特異性條帶，大小約700 bp（圖2），通過5′RACE擴(kuò)增出一條特異性條帶，大小約1 100 bp（圖3）。將上述特異DNA片段經(jīng)測序后拼接，通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)該序列與其他植物L(fēng)FY基因序列具有較高的同源性，表明該序列是香草蘭LFY基因編碼框全長cDNA，命名為VpLFY。VpLFY序列全長為1 708 bp，其中5′非編碼區(qū)為38 bp，3′非編碼區(qū)為197 bp，經(jīng)分析可知VpLFY基因ORF長度為1 473 bp，編碼491個氨基酸殘基。根據(jù)生物信息學(xué)分析，預(yù)期分子量為54.13 ku，等電點(diǎn)為7.13。

在NCBI中對VpLFY蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性分析，由圖4可知，VpLFY蛋白與擬南芥、番茄、玉米和蝴蝶蘭的LFY均存在同源性較高的保守氨基酸序列位點(diǎn)。另外，在NCBI中對VpLFY蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果表明，VpLFY蛋白質(zhì)屬于FLO-LFY家族。

2.3 VpLFY基因的表達(dá)分析

采用熒光定量RT-PCR方法，以VpActin作為內(nèi)參基因，分別對香草蘭花芽分化不同組織中VpLFY基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。由圖5可知，VpLFY基因在所有香草蘭花芽分化的組織中均有表達(dá)，其在純花芽中表達(dá)量最高，在莖段和氣生根中表達(dá)量較低。

采用熒光定量RT-PCR方法，以VpActin作為內(nèi)參基因，分別對香草蘭純花芽、葉芽和混合花芽等芽體組織在不同分化階段中VpLFY基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。由圖6可知，VpLFY基因在香草蘭花芽分化的不同階段中均有表達(dá)，其中純花芽的VpLFY基因在花序分化初期（IV）表達(dá)量達(dá)到最高，混合花芽的VpLFY基因在花分化初期（VI）表達(dá)量達(dá)到最高，葉芽的VpLFY基因在整個花芽分化不同階段表達(dá)量變化不大。

3 討論與結(jié)論

LFY基因的首要功能是協(xié)同其他成花相關(guān)基因抑制分生組織細(xì)胞向營養(yǎng)生長發(fā)育[7]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成花轉(zhuǎn)變前LFY基因主要表達(dá)于葉原基，當(dāng)其表達(dá)量達(dá)一定閾值時，LFY基因則起抑制葉原基啟動的作用，從而有助于分生組織細(xì)胞形成花原基[8]。在植物成花誘導(dǎo)中，LFY基因還參與維持花分生組織的正常功能、花啟動、防止花分生組織的逆轉(zhuǎn)[9]。在模式植物擬南芥中，LFY基因的表達(dá)最早出現(xiàn)于花序分生組織下側(cè)花原基萌發(fā)的部位，但在花序分生組織中無表達(dá)。隨著花分生組織的形成，LFY基因的表達(dá)量也逐漸增加，并分布于整個花分生組織中；當(dāng)花器官原基開始分化出現(xiàn)時，LFY基因的表達(dá)大部分消失[10]。

本研究克隆了一個香草蘭花分生組織特征基因VpLFY，該基因全長1 708 bp，包含一個1 473 bp的完整讀碼框，編碼491個氨基酸殘基。VpLFY編碼的氨基酸序列的分子量為54.13 ku，等電點(diǎn)為7.13，該序列與其他植物L(fēng)FY均存在同源性較高的保守位點(diǎn)，均屬于FLO-LFY蛋白家族，這表明本研究克隆的VpLFY屬于植物L(fēng)FY基因。對VpLFY基因在香草蘭中的組織特異性分析結(jié)果表明，香草蘭花芽分化的純花芽、混合花芽、葉芽、莖段、功能葉和氣生根中均能檢測到VpLFY基因的表達(dá)，這表明該基因在香草蘭組織中屬于組成型表達(dá)。對VpLFY基因在香草蘭不同花芽分化階段中的表達(dá)特征分析結(jié)果表明，香草蘭的純花芽在花芽分化前期均有較高的VpLFY基因表達(dá)，香草蘭的混合花芽則在花芽分化后期有較高的VpLFY基因表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果推測，VpLFY基因可能在香草蘭的花芽分化和成花誘導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。

香草蘭是蘭科植物中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶香料作物。已有研究結(jié)果表明，香草蘭營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變不徹底的現(xiàn)象極大影響著生產(chǎn)種植上香草蘭的產(chǎn)量[11]。通過生物技術(shù)的手段為開展生產(chǎn)中的香草蘭促花栽培措施是一直以來的目標(biāo)[12]。本研究克隆的VpLFY基因及對其表達(dá)特征分析結(jié)果表明，香草蘭花分生組織特征基因VpLFY可作為香草蘭促花栽培措施的參考基因，通過檢測VpLFY基因的表達(dá)強(qiáng)度可為生產(chǎn)上的生物技術(shù)促花栽培措施提供參考借鑒，這也是本研究下一步深入研究的方向。

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