人結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法

摘要：為了探討人結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，文章通過等位基因特異性擴增技術檢測80例結直腸癌石蠟標本的BRAFV600E突變性，且與Sanger測序法進行對比，得出結論：通過等位基因PCR技術檢測人結直腸癌BRAF基因V600E突變，與測序法對比靈敏度、簡便性、快速性更高，對人腫瘤BRAFV600E突變具有較高的篩查價值。

關鍵詞：人結直腸癌；等位基因；特異性擴增；BRAF基因；V600E突變 文獻標識碼：A

中圖分類號：R735 文章編號：1009-2374（2016）24-0072-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.24.036

目前，臨床中有超過30種BRAF突變類型，大約90%突變處在第15外顯子，而V600E突變則是最為常見的一種突變。本文將人BRAF基因V600E突變位點作為等位基因特異性擴增引物，經(jīng)等位基因特異性擴增技術檢測且與金標準Sanger測序法，分析其可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選用的人大腸癌SW480、HT29細胞均通過測序顯示為BRAF野生型、攜帶BRAFV600E雜合突變。80例結直腸癌標本均由醫(yī)院病理科提供。其DNA腫瘤組織切片通過鏡檢顯示腫瘤細胞水平超過90%。

1.2 方法

提取DNA，并將模板DNA放置到-20℃環(huán)境內(nèi)保存。等位基因特異性擴增法：將人大腸癌細胞株SW480、HT29與80例腫瘤標本予以等位基因特異性擴增，PCR體系總體積是20μL ，含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有0.5μL（10μmol），模板DNA30ng，置入滅菌去離子水達到20μL。通過95℃預變性30s；95℃變性10s；67℃退火20s；72℃延伸30s，總45個循環(huán)進行反應。將腫瘤標本取出1μL進行第一次擴增，并將其產(chǎn)物用作二次擴增物，采用同樣擴增方法。將PCR產(chǎn)物采集5μL實施瓊脂糖（2%）凝膠電泳，持續(xù)30min，然后予以顯像。

標本與細胞株均通過PCR測序且對比等位基因特異性擴增的結果。PCR反應條件為：含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有1μL（（10μmol），模板DNA30ng，置入滅菌去離子水達到20μL。通過95℃預變性30s；95℃變性10s；54℃退火20s；72℃延伸30s，總40個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖（2%）凝膠電泳顯示目的條帶擴增完成后進行測序。

采集SW480、HT29細胞株DNA，通過核酸定量儀進行定量，達到30ng，依據(jù)一定比例通過攜帶BRAF野生型（SW480）的核酸與包含BRAFV600E突變（HT29）的核酸相混合，獲得包含50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突變DNA混合模板，然后再分別采集30ng實施等位基因特異性擴增，且對比普通PCR后測序的靈敏度。

2 結果

BRAF基因V600E突變結果經(jīng)PCR條件反應，能夠選擇擴增出攜帶有BRAF基因V600E雜合突變的細胞株。80例大腸癌石蠟標本中，6例形成目的擴增產(chǎn)物。通過測序，74例BRAF基因15外顯子1799位核苷酸是野生型，6例為BRAF基因V600E突變，此結果與等位基因特異性擴增具有一致性。經(jīng)等位基因特異性擴增的不同比例突變核酸，此法可于6.2%突變基因模板內(nèi)擴增目的條帶，BRAF基因V600E突變的敏感度可低到6.2%。普通PCR后測序結果自峰圖顯現(xiàn)50%、25%、12.5%的突變位點，比12.5%低的與背景信號相混雜難以測出。

3 討論

惡性腫瘤使得人類生命健康受到嚴重威脅，且有日益突出的趨勢，尋找較為有效的，可以在早期對其進行診斷治療的方法在醫(yī)學領域已逐漸成為較為重要的研究課題，是基礎與臨床醫(yī)學研究的熱點項目。腫瘤細胞在基因組水平上與正常體細胞具有比較高的差異，是腫瘤演變及生長過程中出現(xiàn)穩(wěn)定復制的一類具有較高重要性的驅動突變，可用作新的生物標志物，對于腫瘤的臨床診斷與預后評判具有重要意義。

BRAF基因編碼蛋白是絲裂原活化蛋白激通路中旳一種絲蘇氨酸特異性激酶，是通路中的一個重要轉導因子。目前BRAF基因檢測方法主要有探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）、測序法、高分辨率溶解曲線分析技術（HRM）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）和高效液相色譜法（DHPLC）等方法。BRAF基因V600E為此基因的熱點突變，表現(xiàn)是T變?yōu)锳，突變后使得編碼的谷氨酸被纈氦酸所代替。對結直腸癌患者進行靶向治療過程中顯示，攜帶有突變使得患者使用EGFR單抗藥物（西妥昔單抗、帕尼單抗）進行治療時，無法達到較為理想的效果，而且對干預后不良是比較重要的一個標志。在毛細胞白血病患者腫瘤細胞的測序中，腫瘤細胞全攜帶有突變，由此可知其極有可能是導致毛細胞白血病致病的一個重要機制，而且是此疾病的一個新型的特異性診斷標志物，對于此疾病的靶向治療提供了一個新的方向。

BRAF基因突變對于評價惡性黑素瘤，預測結直腸癌分子靶向藥物的臨床治療效果具有重要意義。對BRAF基因突變進行檢測時，篩選靶向藥物可以獲得益處的病例，對于制定理想方案具有重要意義，可有效節(jié)約成本，使得腫瘤病患達到個體化治療。但在臨床中，對樣本進行檢測時，腫瘤細胞具有較低的豐度，且有了大量野生型體細胞混在其中，對突變基因的準確檢測具有明顯的不利影響。對BRAF基因進行突變檢測具有多種方法，本文利用等位基因特異性擴增檢測人結直腸癌BRAF基因V600E突變。

等位基因特異性擴增在檢測已知突變時較為簡便，通過Taq酶缺少3→5外切酶活性，引物3末端堿基與模板出現(xiàn)錯配時，擴增很難完成，由此可實現(xiàn)選擇性擴增定點突變或野生型基因的目的。在本文研究中，設計上游引物3端與BRAF基因V600E點突變進行互補、與野生型堿基錯配的上游引物，經(jīng)優(yōu)化反應，實現(xiàn)選擇性擴增BRAFV600E突變。通過攜帶V600E突變的HT29細胞與BRAF野生型的SW480大腸癌細胞株的檢測，顯示此方法證實能夠測定出混雜在野生型內(nèi)的6.2%BRAF突變，與測序結果12.5%進行對比，此法靈敏度更高。由于PCR的反應體系體積通常比較低，當使用傳統(tǒng)電極予以電化學檢測時，需毫升級別的反應體積，如此使得試劑內(nèi)損耗，增加成本，且導致檢測敏感性減弱。測序能夠對堿基位置形成直接定位且可辨別堿基具體類型，具有極高的直觀性與確定性，是突變檢測的一個“金標準”。Sanger測序法是DNA測序中比較經(jīng)典的一種方式，基本原理為雙脫氧鏈終止法，使用檢測標記不同熒光素的DNA片段，然后經(jīng)詳細的數(shù)據(jù)計算獲得檢測的序列。但對于混合擴增產(chǎn)物來說，因為處于相同位置，不同堿基所呈現(xiàn)的信號強度并無一致性，測序分析軟件在對掃描的結果進行處理時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，便于獲得盡可能準確的結果，如此在突變模板比例比較低時，測序系統(tǒng)通常會顯示突變信號峰是一種背景信號，使得此結果持續(xù)壓低。近些年來，此基因突變對于大腸癌、惡性黑素瘤的分子靶向藥物具有較高的治療效果預測作用，且此指標逐漸得到人們的重視。因為靶向藥物在使用過程中，通常價格比較昂貴，而且具有較為顯著的毒副作用，所以采用具有較高準確性、敏感性的指標對治療效果的基因突變情況予以檢測并明確判定存在顯著指導意義。但是一部分晚期腫瘤患者在初診時錯過了手術治療時機，對腫瘤源性的突變基因進行檢測時只可使用穿刺組織活檢、胸腹水等方式。而且在臨床中通過測序進行檢測能夠防止假陰性的存在，通常不會收取腫瘤細胞水平小于50%的標本，由此使得一些晚期腫瘤患者采用靶向治療時并無可以遵循的依據(jù)。通過本文的研究，檢測80例大腸癌石蠟標本，測到6例，與PCR后測序結果具有一致性。建立突變富集ARMS熒光定量PCR法能夠檢測到101拷貝/反應，顯示較高的靈敏性及分辨率，可于腫瘤樣本存在較少突變細胞時檢測到突變的等位基因，應用前景良好。

總之，等位基因特異性擴增能夠快速測到腫瘤BRAF基因V600E突變，與測序法進行對比，此法不需特殊設備，簡便性、快捷性、靈敏性、經(jīng)濟性高，值得推廣應用。

參考文獻

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[2] 曲守方，于婷，郭李平，等.BRAF基因V600E突變檢測的熒光PCR方法的建立[J].藥物分析雜志，2015，35（8）.

作者簡介：徐顯暑（1982-），男，浙江人，溫州因美生物科技有限公司副總經(jīng)理，碩士，研究方向：基因工程。

（責任編輯：王 波）