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    貴州漢族人群23個STR基因座的OL等位基因研究

    2020-02-05 07:53:06胡錫階劉祖林萬衛(wèi)紅陳鵬宇余麗梅
    遵義醫(yī)科大學學報 2020年6期
    關鍵詞:貴州

    張 昊,胡錫階,劉祖林,羅 麗,萬衛(wèi)紅,陳鵬宇,余麗梅

    (1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 貴州省細胞工程重點實驗室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學 法醫(yī)學院,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 司法鑒定中心,貴州 遵義 563099)

    短串聯重復序列(Short tandem repeat,STR)是一類長度多態(tài)性遺傳標記,在人類基因組中分布廣泛,核心重復單位數目的變化形成了STR基因座的遺傳多態(tài)性[1]。STR基因座在不同人群中存在顯著的群體遺傳結構差異,主要表現在等位基因的數目、分布頻率、突變和序列結構特征等方面[2-3]。在法醫(yī)學實踐中,對特定群體的STR基因座進行遺傳多態(tài)性調查,是應用于該群體個體識別、親權鑒定以及群體遺傳學研究的基本前提。

    OL(Off-Ladder)等位基因是采用國際標準化檢測儀器對STR進行等位基因分型時,因所檢測的等位基因未被包含在商品化試劑盒等位基因分型標準物(Allelic ladder)中,不能被儀器自動識別和程序化數字命名的等位基因[4]。其來源于群體中發(fā)生微變異的等位基因或稀有等位基因,多數情況下是具有群體特征性而之前未報道的新等位基因。目前,國內外多個實驗室相繼在不同群體或單個STR基因座上檢測出OL等位基因[5-7],貴州漢族群體的OL等位基因數據尚缺乏。本研究應用在中國群體中遺傳多態(tài)性高的Huaxia PlatinumTM試劑盒,對貴州漢族人群23個常染色體STR基因座的OL等位基因進行統(tǒng)計和分析,以期補充和完善貴州漢族群體的遺傳多態(tài)性數據。并與采用相同檢測體系的群體進行OL等位基因及頻率比較,進一步探討OL等位基因在不同群體中的差異性。

    1 材料與方法

    1.1 材料 樣本來源于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院法醫(yī)鑒定中心法醫(yī)物證室(即貴州省細胞工程重點實驗室分子生物學技術室的法醫(yī)物證室)親子鑒定的日常檢案,隨機選取2016~2018年1 291例貴州漢族無關個體血樣,其中男性882例,女性409例。

    1.2 主要試劑與儀器 Huaxia PlatinumTM試劑盒、等位基因分型標準物、內標(LIZ600)、POP 4凝膠和緩沖液(ABC、CBC)均為美國ABI公司產品,Veriti 96 well PCR擴增儀和3500-DX遺傳分析儀也購于美國ABI公司。

    1.3 方法

    1.3.1 制備FTA血卡 取80 μL血液均勻涂至FTA卡中央區(qū)域,室溫自然干燥,手動打孔器取下直徑約1 mm血斑放入PCR管。

    1.3.2 PCR擴增與毛細管電泳 嚴格按照Huaxia PlatinumTM試劑盒說明,配置擴增體系和設置循環(huán)參數。PCR擴增體系共10 μL,其中Master Mix 4.0 μL、Primer Set 4.0 μL、Pure water 2.0 μL。反應循環(huán)參數為:95 ℃ 1 min;94 ℃ 3 s,59 ℃ 16 s,65 ℃ 29 s,26個循環(huán);60 ℃ 5 min;4 ℃ 保存。取1 μL PCR擴增產物,與9.6 μL甲酰胺和0.4 μL內標混合,使用3500-DX遺傳分析儀進行毛細管電泳。每批樣本均同時檢測等位基因分型標準物(ladder)、陽性對照(control 007)和陰性對照(water)。

    1.3.3 基因分型與OL等位基因命名 應用Gene Mapper ID-X 1.4 software(美國ABI公司)分析電泳結果,以試劑盒l(wèi)adder為參照標準,獲得等位基因分型。對于在分型圖譜中未被數字化命名的OL等位基因,根據《司法鑒定技術規(guī)范》(SF/Z JD0105011-2018),參照內標計算每個帶有實際分子量標的信號峰的位置來進行命名。

    1.3.4 參考群體選擇與群體比較 參考群體納入標準:(1)采用與本研究相同的檢測體系;(2)報道數據通過質控;(3)具有語系、地域、民族代表性。

    檢索PubMed、CNKI和萬方數據庫,選取四川漢族(n=309)[8]、海南漢族(n=193)[9]、四川藏族(n=198)[9]、華東漢族(n=500)[10]、內蒙古蒙古族(n=100)[10]、寧夏回族(n=183)[11]和新疆哈薩克族(n=550)[12]作為參考群體,獲得各群體的等位基因頻率后,篩選出OL等位基因及分布頻率作為比較數據。

    2 結果

    2.1 等位基因分型標準物 Huaxia PlatinumTM試劑盒包含23個常染色體STR基因座(D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、TPOX、D8S1179、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、TH01、FGA、 D22S1045、D5S818、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S1338、Penta D)及2個性別鑒定基因座Amelogenin和Y-indel (rs2032678),各基因座可見數目不等的標準物等位基因分型圖譜(見圖1)。

    2.2 貴州漢族群體OL等位基因分型及其頻率 1 291例無關個體共檢出36個OL等位基因,分布于vWA、D16S539、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、FGA、D22S1045、D7S820、D6S1043、D1S1656、D12S391和D2S1338 共14個STR基因座,各基因座可見1~8個OL等位基因,基因頻率為0.0004~0.0232(見表1)。36個OL等位基因分為兩種類型:5個超出ladder范圍而位于兩個鄰近基因座ladder之間(見圖2A),分別為vWA(10)、D6S1043(6,8)、D12S391(28)和D2S1338(29);其余31個出現在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(見圖2B)。

    1 291例樣本中,235例共檢出OL等位基因256次。其中214例為單個基因座上出現1個OL等位基因;3例為單個基因座上的2個等位基因均為相同的OL等位基因,即由OL等位基因組成的純合子(見圖2C);18例為兩個不同的基因座上各出現1個OL等位基因(見圖2D)。

    圖1 Huaxia PlatinumTM試劑盒l(wèi)adder分型圖譜

    表1 貴州漢族群體OL等位基因及其頻率

    續(xù)表

    A: D6S1043 OL 6; B: D2S441 OL 9.1; C: D2S441 OL 9.1; D: D7S820 OL 12.1; D2S441 OL 12.3。圖2 OL等位基因分型分型圖譜

    2.3 貴州漢族與參考群體OL等位基因及頻率比較 與四川漢族、海南漢族、華東漢族、四川藏族、寧夏回族、內蒙古蒙古族和新疆哈薩克族7個群體相比,貴州漢族人群發(fā)現OL等位基因數目最多,分布基因座最廣。D2S441(10.1)、D16S539(6)、D18S51(8)、vWA(10)、D7S820(12.1)、D19S433(9.2,18)、FGA(27.2)、D22S1045(12.1)和 D6S1043(6,19.2,19.3)共12個等位基因僅在貴州漢族中檢出,其中10個為稀有等位基因;D1S1656(18)和FGA(23.2)在所有群體中均有檢出,且等位基因頻率在各群體均高于1‰。

    圖3 貴州漢族與參考群體OL等位基因頻率比較

    3 討論

    OL等位基因產生的主要原因是等位基因突變引起的核酸缺失、插入或核苷酸改變,這種改變也被稱為微變異[4],同時之前未報道過的新等位基因也會被檢測為OL。OL等位基因主要分為兩種類型:一類是超出ladder范圍而位于兩個鄰近基因座ladder之間,通常是由STR基因座滑動突變形成的稀有等位基因,表現為核心序列的完整重復;另一類是出現在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內,通常由于微變異引起,表現為核心序列的不完整重復。本研究中,前一類5個OL等位基因vWA(10)、D6S1043(6,8)、D12S391(28)和D2S1338(29)均為核心序列完整重復的稀有等位基因(頻率低于1‰);后一類31個OL等位基因中僅6個為核心序列的完整重復,其余25個為核心序列的不完整重復。綜合OL等位基因類型和分布頻率,在貴州漢族人群中檢出的OL等位基因多出現在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(31/36),多表現為核心序列的不完整重復(25/36),以稀有等位基因居多(19/36)。

    Huaxia PlatinumTM試劑盒作為在中國人群遺傳多態(tài)性數據基礎上研發(fā)的復合擴增體系,在多個群體遺傳學調查中展現出高度的多態(tài)性和鑒別能力[13-14]。23個常染色體STR基因座包括了美國聯合DNA檢索系統(tǒng)、歐洲標準基因座和中國國家數據庫推薦使用的所有核心基因座,在保證高系統(tǒng)效能的同時,能有效實現與已知數據庫的數據共享和比對。應用該體系檢測貴州漢族群體,OL等位基因在14個STR基因座上被檢出,而9個STR基因座上未檢出。D6S1043和FGA基因座所含OL等位基因較多,分別為8個和7個,其余基因座均不超過3個。結合各基因座的法醫(yī)學參數,發(fā)現檢出OL等位基因的14個基因座均為貴州漢族群體的高鑒別能力基因座(DP>0.9,Ho>0.7),而在低鑒別能力或中等鑒別能力的基因座上未檢出,如TH01和TPOX基因座。這表明OL等位基因使得所在基因座的鑒別能力增強,包含的多態(tài)性信息更為豐富。

    本研究在貴州漢族群體中檢出OL等位基因比例較高,占總樣本18.20%(235/1 291例);且個別OL等位基因的頻率較高,如D2S441基因座的9.1等位基因頻率達到0.0232,D1S1656基因座的18等位基因頻率也達到0.0128。與前述3個漢族群體和4個少數民族群體比較,從OL等位基因數目來看,8個群體的OL等位基因多分布于D2S441、FGA和 D6S1043三個基因座,不同群體OL等位基因分布的基因座及數目具有一定差異。8個群體總體呈現出樣本量越大檢出OL等位基因數目越多,而各群體的OL等位基因總頻率保持在較為恒定的范圍(0.11±0.0345),即顯示為各群體的遺傳基因趨于穩(wěn)定。對于相近樣本量的群體,漢族群體檢出OL等位基因數目多于少數民族群體,這可能是因為漢族在人口遷移或社會變動中更多地與不同民族、地域的人群發(fā)生基因交流和融合,形成漢族的遺傳多態(tài)性信息更為復雜所致,而少數民族由于地理環(huán)境相對封閉,外族通婚相對較少,遺傳多態(tài)性更為保守。按語系分類,漢族和回族屬于漢藏語系的漢語語族,藏族屬于漢藏語系的藏緬語族,蒙古族和哈薩克族分別屬于阿爾泰語系的蒙古語族和突厥語族。在6個漢藏語系和2個阿爾泰語系群體中,觀察到部分OL等位基因僅檢出于漢藏語系的群體,在阿爾泰語系的群體未檢出,說明OL等位基因在漢藏語系和阿爾泰語系群體中存在一定差異。因目前Huaxia PlatinumTM檢測體系的群體遺傳多態(tài)性數據較為缺乏,有待增加南島語系、南亞語系和印歐語系的群體以進一步探討OL等位基因在不同語系群體中的差異性。從OL等位基因頻率來看,在多個群體中觀察到等位基因頻率較高的OL等位基因,如D1S1656基因座的18等位基因,在8個群體中均被檢出,且等位基因頻率不低于0.005。這提示試劑盒生產公司應特別注意收集各群體的OL等位基因數據,有必要將多數群體中頻率高的OL等位基因納入ladder,不斷優(yōu)化和完善試劑盒。同時,也觀察到一些OL等位基因僅存在特定群體或少數群體(如D2S441基因座的10.1等位基因僅存在于貴州漢族人群),等位基因頻率較低,是與其他群體在遺傳結構上具有差異性的反映。這類具有明顯群體特征的OL等位基因有利于個體排查、甄別,甚至確認,在災難遺骸識別或混合物鑒定等案件調查中具有強大的應用價值。

    實際檢案檢測到OL等位基因時,其頻率按照該基因座上等位基因頻率的最小值取值。對于超過稀有等位基因評定標準的OL等位基因,計算時若仍取最小等位基因頻率,必然會增大該基因座的父權指數,從而影響累計父權指數的計算結果。OL等位基因對DNA檢測結果判定有著重要影響,一方面,OL等位基因有助于提升基因座的鑒別能力,親子間相同的OL等位基因能夠增加親緣關系的確定;另一方面,OL等位基因的誤讀可能會影響案件分析的可靠性,增大鑒定風險,使法醫(yī)DNA檢測不能真正起到認定罪犯、保護無辜的作用。因此在鑒定工作中應警惕被標識為OL的等位基因。常染色體STR分型是目前法醫(yī)物證案件鑒定的金標準,基于STR長度多態(tài)性檢測結果,相同或相似長度的等位基因包含了更加豐富的多態(tài)性信息[15]。這意味著通過比照和推導相鄰等位基因長度命名的OL等位基因也極有可能包含了不同的序列結構組成。國際法醫(yī)學組織建立了專門的STR Base數據庫,接收并持續(xù)更新來自全球各實驗室的OL等位基因數據,隨著DNA數據庫的完善和新一代測序技術的發(fā)展,更加豐富的OL等位基因信息必將得到精準的解讀。

    綜上可見,對貴州漢族人群23個STR基因座的OL等位基因進行比較分析,豐富了法醫(yī)學個體識別、親權鑒定、人類學和群體遺傳學研究中該群體的遺傳多態(tài)性數據。由于不同群體的OL等位基因存在基因座分布、等位基因數目及頻率的一定差異,OL等位基因的分析將在提高案件準確性中發(fā)揮重要作用。

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