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    貴州漢族人群23個(gè)STR基因座的OL等位基因研究

    2020-02-05 07:53:06胡錫階劉祖林萬(wàn)衛(wèi)紅陳鵬宇余麗梅
    關(guān)鍵詞:貴州

    張 昊,胡錫階,劉祖林,羅 麗,萬(wàn)衛(wèi)紅,陳鵬宇,余麗梅

    (1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 司法鑒定中心,貴州 遵義 563099)

    短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat,STR)是一類長(zhǎng)度多態(tài)性遺傳標(biāo)記,在人類基因組中分布廣泛,核心重復(fù)單位數(shù)目的變化形成了STR基因座的遺傳多態(tài)性[1]。STR基因座在不同人群中存在顯著的群體遺傳結(jié)構(gòu)差異,主要表現(xiàn)在等位基因的數(shù)目、分布頻率、突變和序列結(jié)構(gòu)特征等方面[2-3]。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中,對(duì)特定群體的STR基因座進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查,是應(yīng)用于該群體個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定以及群體遺傳學(xué)研究的基本前提。

    OL(Off-Ladder)等位基因是采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)儀器對(duì)STR進(jìn)行等位基因分型時(shí),因所檢測(cè)的等位基因未被包含在商品化試劑盒等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(Allelic ladder)中,不能被儀器自動(dòng)識(shí)別和程序化數(shù)字命名的等位基因[4]。其來(lái)源于群體中發(fā)生微變異的等位基因或稀有等位基因,多數(shù)情況下是具有群體特征性而之前未報(bào)道的新等位基因。目前,國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼在不同群體或單個(gè)STR基因座上檢測(cè)出OL等位基因[5-7],貴州漢族群體的OL等位基因數(shù)據(jù)尚缺乏。本研究應(yīng)用在中國(guó)群體中遺傳多態(tài)性高的Huaxia PlatinumTM試劑盒,對(duì)貴州漢族人群23個(gè)常染色體STR基因座的OL等位基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,以期補(bǔ)充和完善貴州漢族群體的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)。并與采用相同檢測(cè)體系的群體進(jìn)行OL等位基因及頻率比較,進(jìn)一步探討OL等位基因在不同群體中的差異性。

    1 材料與方法

    1.1 材料 樣本來(lái)源于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院法醫(yī)鑒定中心法醫(yī)物證室(即貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)技術(shù)室的法醫(yī)物證室)親子鑒定的日常檢案,隨機(jī)選取2016~2018年1 291例貴州漢族無(wú)關(guān)個(gè)體血樣,其中男性882例,女性409例。

    1.2 主要試劑與儀器 Huaxia PlatinumTM試劑盒、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物、內(nèi)標(biāo)(LIZ600)、POP 4凝膠和緩沖液(ABC、CBC)均為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品,Veriti 96 well PCR擴(kuò)增儀和3500-DX遺傳分析儀也購(gòu)于美國(guó)ABI公司。

    1.3 方法

    1.3.1 制備FTA血卡 取80 μL血液均勻涂至FTA卡中央?yún)^(qū)域,室溫自然干燥,手動(dòng)打孔器取下直徑約1 mm血斑放入PCR管。

    1.3.2 PCR擴(kuò)增與毛細(xì)管電泳 嚴(yán)格按照Huaxia PlatinumTM試劑盒說(shuō)明,配置擴(kuò)增體系和設(shè)置循環(huán)參數(shù)。PCR擴(kuò)增體系共10 μL,其中Master Mix 4.0 μL、Primer Set 4.0 μL、Pure water 2.0 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:95 ℃ 1 min;94 ℃ 3 s,59 ℃ 16 s,65 ℃ 29 s,26個(gè)循環(huán);60 ℃ 5 min;4 ℃ 保存。取1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,與9.6 μL甲酰胺和0.4 μL內(nèi)標(biāo)混合,使用3500-DX遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。每批樣本均同時(shí)檢測(cè)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)、陽(yáng)性對(duì)照(control 007)和陰性對(duì)照(water)。

    1.3.3 基因分型與OL等位基因命名 應(yīng)用Gene Mapper ID-X 1.4 software(美國(guó)ABI公司)分析電泳結(jié)果,以試劑盒l(wèi)adder為參照標(biāo)準(zhǔn),獲得等位基因分型。對(duì)于在分型圖譜中未被數(shù)字化命名的OL等位基因,根據(jù)《司法鑒定技術(shù)規(guī)范》(SF/Z JD0105011-2018),參照內(nèi)標(biāo)計(jì)算每個(gè)帶有實(shí)際分子量標(biāo)的信號(hào)峰的位置來(lái)進(jìn)行命名。

    1.3.4 參考群體選擇與群體比較 參考群體納入標(biāo)準(zhǔn):(1)采用與本研究相同的檢測(cè)體系;(2)報(bào)道數(shù)據(jù)通過(guò)質(zhì)控;(3)具有語(yǔ)系、地域、民族代表性。

    檢索PubMed、CNKI和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù),選取四川漢族(n=309)[8]、海南漢族(n=193)[9]、四川藏族(n=198)[9]、華東漢族(n=500)[10]、內(nèi)蒙古蒙古族(n=100)[10]、寧夏回族(n=183)[11]和新疆哈薩克族(n=550)[12]作為參考群體,獲得各群體的等位基因頻率后,篩選出OL等位基因及分布頻率作為比較數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果

    2.1 等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物 Huaxia PlatinumTM試劑盒包含23個(gè)常染色體STR基因座(D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、TPOX、D8S1179、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、TH01、FGA、 D22S1045、D5S818、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S1338、Penta D)及2個(gè)性別鑒定基因座Amelogenin和Y-indel (rs2032678),各基因座可見數(shù)目不等的標(biāo)準(zhǔn)物等位基因分型圖譜(見圖1)。

    2.2 貴州漢族群體OL等位基因分型及其頻率 1 291例無(wú)關(guān)個(gè)體共檢出36個(gè)OL等位基因,分布于vWA、D16S539、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、FGA、D22S1045、D7S820、D6S1043、D1S1656、D12S391和D2S1338 共14個(gè)STR基因座,各基因座可見1~8個(gè)OL等位基因,基因頻率為0.0004~0.0232(見表1)。36個(gè)OL等位基因分為兩種類型:5個(gè)超出ladder范圍而位于兩個(gè)鄰近基因座ladder之間(見圖2A),分別為vWA(10)、D6S1043(6,8)、D12S391(28)和D2S1338(29);其余31個(gè)出現(xiàn)在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(nèi)(見圖2B)。

    1 291例樣本中,235例共檢出OL等位基因256次。其中214例為單個(gè)基因座上出現(xiàn)1個(gè)OL等位基因;3例為單個(gè)基因座上的2個(gè)等位基因均為相同的OL等位基因,即由OL等位基因組成的純合子(見圖2C);18例為兩個(gè)不同的基因座上各出現(xiàn)1個(gè)OL等位基因(見圖2D)。

    圖1 Huaxia PlatinumTM試劑盒l(wèi)adder分型圖譜

    表1 貴州漢族群體OL等位基因及其頻率

    續(xù)表

    A: D6S1043 OL 6; B: D2S441 OL 9.1; C: D2S441 OL 9.1; D: D7S820 OL 12.1; D2S441 OL 12.3。圖2 OL等位基因分型分型圖譜

    2.3 貴州漢族與參考群體OL等位基因及頻率比較 與四川漢族、海南漢族、華東漢族、四川藏族、寧夏回族、內(nèi)蒙古蒙古族和新疆哈薩克族7個(gè)群體相比,貴州漢族人群發(fā)現(xiàn)OL等位基因數(shù)目最多,分布基因座最廣。D2S441(10.1)、D16S539(6)、D18S51(8)、vWA(10)、D7S820(12.1)、D19S433(9.2,18)、FGA(27.2)、D22S1045(12.1)和 D6S1043(6,19.2,19.3)共12個(gè)等位基因僅在貴州漢族中檢出,其中10個(gè)為稀有等位基因;D1S1656(18)和FGA(23.2)在所有群體中均有檢出,且等位基因頻率在各群體均高于1‰。

    圖3 貴州漢族與參考群體OL等位基因頻率比較

    3 討論

    OL等位基因產(chǎn)生的主要原因是等位基因突變引起的核酸缺失、插入或核苷酸改變,這種改變也被稱為微變異[4],同時(shí)之前未報(bào)道過(guò)的新等位基因也會(huì)被檢測(cè)為OL。OL等位基因主要分為兩種類型:一類是超出ladder范圍而位于兩個(gè)鄰近基因座ladder之間,通常是由STR基因座滑動(dòng)突變形成的稀有等位基因,表現(xiàn)為核心序列的完整重復(fù);另一類是出現(xiàn)在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(nèi),通常由于微變異引起,表現(xiàn)為核心序列的不完整重復(fù)。本研究中,前一類5個(gè)OL等位基因vWA(10)、D6S1043(6,8)、D12S391(28)和D2S1338(29)均為核心序列完整重復(fù)的稀有等位基因(頻率低于1‰);后一類31個(gè)OL等位基因中僅6個(gè)為核心序列的完整重復(fù),其余25個(gè)為核心序列的不完整重復(fù)。綜合OL等位基因類型和分布頻率,在貴州漢族人群中檢出的OL等位基因多出現(xiàn)在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(nèi)(31/36),多表現(xiàn)為核心序列的不完整重復(fù)(25/36),以稀有等位基因居多(19/36)。

    Huaxia PlatinumTM試劑盒作為在中國(guó)人群遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上研發(fā)的復(fù)合擴(kuò)增體系,在多個(gè)群體遺傳學(xué)調(diào)查中展現(xiàn)出高度的多態(tài)性和鑒別能力[13-14]。23個(gè)常染色體STR基因座包括了美國(guó)聯(lián)合DNA檢索系統(tǒng)、歐洲標(biāo)準(zhǔn)基因座和中國(guó)國(guó)家數(shù)據(jù)庫(kù)推薦使用的所有核心基因座,在保證高系統(tǒng)效能的同時(shí),能有效實(shí)現(xiàn)與已知數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)共享和比對(duì)。應(yīng)用該體系檢測(cè)貴州漢族群體,OL等位基因在14個(gè)STR基因座上被檢出,而9個(gè)STR基因座上未檢出。D6S1043和FGA基因座所含OL等位基因較多,分別為8個(gè)和7個(gè),其余基因座均不超過(guò)3個(gè)。結(jié)合各基因座的法醫(yī)學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)檢出OL等位基因的14個(gè)基因座均為貴州漢族群體的高鑒別能力基因座(DP>0.9,Ho>0.7),而在低鑒別能力或中等鑒別能力的基因座上未檢出,如TH01和TPOX基因座。這表明OL等位基因使得所在基因座的鑒別能力增強(qiáng),包含的多態(tài)性信息更為豐富。

    本研究在貴州漢族群體中檢出OL等位基因比例較高,占總樣本18.20%(235/1 291例);且個(gè)別OL等位基因的頻率較高,如D2S441基因座的9.1等位基因頻率達(dá)到0.0232,D1S1656基因座的18等位基因頻率也達(dá)到0.0128。與前述3個(gè)漢族群體和4個(gè)少數(shù)民族群體比較,從OL等位基因數(shù)目來(lái)看,8個(gè)群體的OL等位基因多分布于D2S441、FGA和 D6S1043三個(gè)基因座,不同群體OL等位基因分布的基因座及數(shù)目具有一定差異。8個(gè)群體總體呈現(xiàn)出樣本量越大檢出OL等位基因數(shù)目越多,而各群體的OL等位基因總頻率保持在較為恒定的范圍(0.11±0.0345),即顯示為各群體的遺傳基因趨于穩(wěn)定。對(duì)于相近樣本量的群體,漢族群體檢出OL等位基因數(shù)目多于少數(shù)民族群體,這可能是因?yàn)闈h族在人口遷移或社會(huì)變動(dòng)中更多地與不同民族、地域的人群發(fā)生基因交流和融合,形成漢族的遺傳多態(tài)性信息更為復(fù)雜所致,而少數(shù)民族由于地理環(huán)境相對(duì)封閉,外族通婚相對(duì)較少,遺傳多態(tài)性更為保守。按語(yǔ)系分類,漢族和回族屬于漢藏語(yǔ)系的漢語(yǔ)語(yǔ)族,藏族屬于漢藏語(yǔ)系的藏緬語(yǔ)族,蒙古族和哈薩克族分別屬于阿爾泰語(yǔ)系的蒙古語(yǔ)族和突厥語(yǔ)族。在6個(gè)漢藏語(yǔ)系和2個(gè)阿爾泰語(yǔ)系群體中,觀察到部分OL等位基因僅檢出于漢藏語(yǔ)系的群體,在阿爾泰語(yǔ)系的群體未檢出,說(shuō)明OL等位基因在漢藏語(yǔ)系和阿爾泰語(yǔ)系群體中存在一定差異。因目前Huaxia PlatinumTM檢測(cè)體系的群體遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)較為缺乏,有待增加南島語(yǔ)系、南亞語(yǔ)系和印歐語(yǔ)系的群體以進(jìn)一步探討OL等位基因在不同語(yǔ)系群體中的差異性。從OL等位基因頻率來(lái)看,在多個(gè)群體中觀察到等位基因頻率較高的OL等位基因,如D1S1656基因座的18等位基因,在8個(gè)群體中均被檢出,且等位基因頻率不低于0.005。這提示試劑盒生產(chǎn)公司應(yīng)特別注意收集各群體的OL等位基因數(shù)據(jù),有必要將多數(shù)群體中頻率高的OL等位基因納入ladder,不斷優(yōu)化和完善試劑盒。同時(shí),也觀察到一些OL等位基因僅存在特定群體或少數(shù)群體(如D2S441基因座的10.1等位基因僅存在于貴州漢族人群),等位基因頻率較低,是與其他群體在遺傳結(jié)構(gòu)上具有差異性的反映。這類具有明顯群體特征的OL等位基因有利于個(gè)體排查、甄別,甚至確認(rèn),在災(zāi)難遺骸識(shí)別或混合物鑒定等案件調(diào)查中具有強(qiáng)大的應(yīng)用價(jià)值。

    實(shí)際檢案檢測(cè)到OL等位基因時(shí),其頻率按照該基因座上等位基因頻率的最小值取值。對(duì)于超過(guò)稀有等位基因評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)的OL等位基因,計(jì)算時(shí)若仍取最小等位基因頻率,必然會(huì)增大該基因座的父權(quán)指數(shù),從而影響累計(jì)父權(quán)指數(shù)的計(jì)算結(jié)果。OL等位基因?qū)NA檢測(cè)結(jié)果判定有著重要影響,一方面,OL等位基因有助于提升基因座的鑒別能力,親子間相同的OL等位基因能夠增加親緣關(guān)系的確定;另一方面,OL等位基因的誤讀可能會(huì)影響案件分析的可靠性,增大鑒定風(fēng)險(xiǎn),使法醫(yī)DNA檢測(cè)不能真正起到認(rèn)定罪犯、保護(hù)無(wú)辜的作用。因此在鑒定工作中應(yīng)警惕被標(biāo)識(shí)為OL的等位基因。常染色體STR分型是目前法醫(yī)物證案件鑒定的金標(biāo)準(zhǔn),基于STR長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果,相同或相似長(zhǎng)度的等位基因包含了更加豐富的多態(tài)性信息[15]。這意味著通過(guò)比照和推導(dǎo)相鄰等位基因長(zhǎng)度命名的OL等位基因也極有可能包含了不同的序列結(jié)構(gòu)組成。國(guó)際法醫(yī)學(xué)組織建立了專門的STR Base數(shù)據(jù)庫(kù),接收并持續(xù)更新來(lái)自全球各實(shí)驗(yàn)室的OL等位基因數(shù)據(jù),隨著DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的完善和新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,更加豐富的OL等位基因信息必將得到精準(zhǔn)的解讀。

    綜上可見,對(duì)貴州漢族人群23個(gè)STR基因座的OL等位基因進(jìn)行比較分析,豐富了法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定、人類學(xué)和群體遺傳學(xué)研究中該群體的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)。由于不同群體的OL等位基因存在基因座分布、等位基因數(shù)目及頻率的一定差異,OL等位基因的分析將在提高案件準(zhǔn)確性中發(fā)揮重要作用。

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