HPV E6/E7mRNA檢測(cè)聯(lián)合TCT在宮頸癌及癌前病變篩查中的臨床意義

尹 莉，楊曉榮，喻永林，王 凱，杜勇軍，鄭 洪

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；2.德江縣人民醫(yī)院，貴州 德江 565200)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高的種類[1]，其致死率不容忽視。研究表明90%以上的宮頸癌發(fā)生伴隨著HPV的高危型持續(xù)感染[2-6]。臨床常用的宮頸癌篩查方法分為細(xì)胞學(xué)篩查和病毒學(xué)篩查兩類，它們各有優(yōu)劣。細(xì)胞學(xué)篩查目前的主流方法為TCT，敏感性、特異性較傳統(tǒng)方法(巴氏涂片)得到很大程度的提升[7-8]。但因其主觀性較強(qiáng)，受診斷醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)和觀念等因素影響而致診斷結(jié)果重復(fù)性不高。病毒學(xué)檢查方法包括HPV DNA和HPV RNA檢測(cè)。近年來HPV RNA檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于臨床宮頸癌篩查，其敏感性低于HPV DNA，特異性高于HPV DNA，是反映HPV活動(dòng)程度的可靠依據(jù)[9]。現(xiàn)有的各類宮頸病變篩查方法存在敏感性和特異性的矛盾，重復(fù)性較差，找到更好的篩查方法仍是需要探討的問題。本研究我們將結(jié)合病毒學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法，探討TCT和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變篩查中的作用，為尋找更好的臨床篩查方法提供了科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2018年6月至2019年6月于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行宮頸癌及癌前病變篩查的304例病例資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：性生活史；因接觸性出血、白帶增多或異常、外陰瘙癢或者無癥狀進(jìn)行常規(guī)篩查，行TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)及陰道鏡下宮頸活檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者近3個(gè)月有妊娠史、嚴(yán)重肝腎疾病史、血液病史、子宮切除史。受檢者年齡19～71歲，平均(42.45±11.20)歲。本項(xiàng)臨床研究為回顧性研究，僅采集患者臨床資料，不干預(yù)患者治療方案，不會(huì)對(duì)患者生理帶來風(fēng)險(xiǎn)，研究者會(huì)盡全力保護(hù)患者提供的信息，不泄露個(gè)人隱私，已申請(qǐng)免除知情同意。

1.2 方法 所有研究對(duì)象均常規(guī)刷取宮頸鱗柱交界脫落細(xì)胞放入對(duì)應(yīng)的保存液中，洗脫細(xì)胞后蓋緊，貼好標(biāo)簽后進(jìn)行TCT及HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)。TCT檢查要求制成單層細(xì)胞涂片，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的染色和固定，按照檢查標(biāo)準(zhǔn)要求的專用儀器進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)通過美國(guó)豪洛捷公司Panther系統(tǒng)進(jìn)行。其中一項(xiàng)異?；蚺R床高度懷疑宮頸病變者，經(jīng)患者同意后行陰道鏡下可疑病變處宮頸活檢或常規(guī)宮頸3、6、9、12點(diǎn)取材，進(jìn)一步進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。按照組織病理學(xué)檢查結(jié)果分為炎癥組、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)組、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)組和宮頸癌組，討論TCT和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌前病變及宮頸癌的篩檢作用。

1.3 結(jié)果判定 (1)HPV E6/E7 mRNA為美國(guó)豪洛捷公司生產(chǎn)的對(duì)宮頸癌14型(包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)高危型HPV的檢測(cè)，其針對(duì)高致癌風(fēng)險(xiǎn)的3種HPV亞型16，18，45的分型，通過全自動(dòng)一體化分子診斷平臺(tái)Panther進(jìn)行結(jié)果判讀， HPV E6/E7 mRNA結(jié)果如下：16型陽(yáng)性、18/45型陽(yáng)性、其它11型陽(yáng)性及陰性。(2)TCT診斷遵循Bethesda系統(tǒng)(2014)[10]：包括未見上皮內(nèi)病變或惡性病變(Negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)、意義不明確的非典型性鱗狀細(xì)胞(Atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US)、非典型性鱗狀細(xì)胞，不能除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變(Atypical squamous cell，cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion ，ASC-H)、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、宮頸癌(CC)。本研究定義TCT陽(yáng)性為TCT≥ASC-US。(3)組織病理學(xué)由高年資病理醫(yī)生閱片，診斷遵循WHO女性生殖器腫瘤分類[11](2014)：包括宮頸炎，不伴鱗狀上皮內(nèi)病變；LSIL，即原CIN1；HSIL，即原CIN2、CIN3以及原位癌；宮頸癌，即宮頸浸潤(rùn)性癌(見圖1)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比描述，組間差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)兩兩進(jìn)行比較，采用Pearsonχ2檢驗(yàn)進(jìn)行校正。約登指數(shù)(Youden index，YI)比較其診斷一致性及準(zhǔn)確性。

A：宮頸炎，不伴鱗狀上皮內(nèi)病變；B：LSIL；C：HSIL； D：宮頸浸潤(rùn)性癌;HE,觀察倍數(shù)均為×200。圖1 宮頸組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 篩查結(jié)果 304例病例均完成TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)以及陰道鏡下組織病理學(xué)活檢，并以組織病理學(xué)診斷為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，炎癥組144例，LSIL組46例，HSIL組100例，宮頸癌組14例，炎癥組認(rèn)定為非宮頸病變，其余組均認(rèn)定為發(fā)生了宮頸病變。

2.1.1 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)及TCT在不同組織病理學(xué)結(jié)果的陽(yáng)性率(%)比較(見表1) 304例患者TCT在各病理分組中的陽(yáng)性率為炎癥組29.9%、LSIL組45.7%、HSIL組61.0%及宮頸癌組78.6%，進(jìn)行兩兩比較，LSIL組、HSIL組及宮頸癌組的陽(yáng)性率均大于炎癥組，P均<0.05；宮頸癌組大于LSIL組，P<0.05。

HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在各病理分組中的陽(yáng)性率為炎癥組52.8%、LSIL組91.3%、HSIL組94.0%及宮頸癌組92.9%，進(jìn)行兩兩比較，LSIL組、HSIL組及宮頸癌組均大于炎癥組，P均<0.05。

炎癥組、LSIL組、HSIL組及宮頸癌組4組中HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率均大于同組TCT陽(yáng)性率，炎癥組、LSIL組、HSIL組，P均<0.05。

表1 TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在組織病理學(xué)各組病例中的陽(yáng)性率(%)情況

2.1.2 HPV E6/E7 mRNA各亞型在各組中的陽(yáng)性率(%)情況(見表2) HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)16型陽(yáng)性率隨宮頸病變程度加重而上升，18/45型陽(yáng)性率與宮頸病變程度無明顯相關(guān)性，其他11型陽(yáng)性率隨宮頸病變程度加重而下降。

HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)16型陽(yáng)性病例在各病理分組中的陽(yáng)性率為炎癥組(15.8%)

HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)18/45型陽(yáng)性病例在各病理分組中的陽(yáng)性率為炎癥組11.8%、LSIL組11.9%、HSIL組6.4%及宮頸癌組7.7%，進(jìn)行兩兩比較，P均>0.05。

HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)其他11型陽(yáng)性病例在各病理分組中的陽(yáng)性率為炎癥組(72.4%)>LSIL組(69.0%)>HSIL組(57.4%)>宮頸癌組(15.4%)，進(jìn)行兩兩比較，HSIL組、宮頸癌組分別與炎癥組比較，P<0.05；宮頸癌組分別與LSIL組、HSIL組比較，P均<0.05。

HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)16型、18/45型及其他11型在各病理分組中陽(yáng)性率，進(jìn)行兩兩比較，炎癥組、LSIL組：16型>18/45型，P>0.05，16型、18/45型均<其他11型，P均<0.05；HSIL組：其他11型>16型>18/45型，P均<0.05；宮頸癌組：16型>18/45型，16型>其他11型，P均<0.05。

表2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)分型在組織病理學(xué)各組病例中的陽(yáng)性率(%)情況

2.1.3 TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)及兩者聯(lián)合應(yīng)用診斷效能分析(見表3) TCT診斷宮頸病變(≥LSIL)特異性(70.1%)大于HPV E6/E7mRNA檢測(cè)(47.2%)，P<0.05；HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)診斷宮頸病變(≥LSIL)敏感性(93.1%)大于TCT(58.1%)，P<0.05；TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)兩者聯(lián)合(任何一項(xiàng)陽(yáng)性即為陽(yáng)性)診斷宮頸病變(≥LSIL)敏感性及特異性分別為98.1%、45.1%，其敏感性明顯高于單獨(dú)應(yīng)用，雖然特異性有所下降，但是聯(lián)合應(yīng)用約登指數(shù)(0.432)高于單獨(dú)使用(TCT0.283、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)0.403)。

表3 TCT、HPV E6/E7mRNA在宮頸病變(≥LSIL)中診斷效能情況

2.2 TCT診斷為NILM、ASC-US、ASC-H病例中病理分組及HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)表達(dá)(%)情況(見表4)

2.2.1 TCT診斷為NILM病例中病理分組及HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)表達(dá)情況 TCT診斷為NILM病例168例，其中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性107例，組織病理學(xué)診斷為≥LSIL病例59例：包括LSIL22例，HSIL35例，宮頸浸潤(rùn)性癌2例； HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陰性61例，組織病理學(xué)診斷為炎癥53例，LSIL3例，HSIL4例，宮頸浸潤(rùn)性癌1例。TCT診斷為NILM，組織病理學(xué)被證實(shí)為L(zhǎng)SIL及以上者共67例，經(jīng)再次閱片發(fā)現(xiàn)有17例可見少量異型細(xì)胞，2例可診斷為HSIL。

2.2.2 TCT診斷為ASC-US病例中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)表達(dá)情況 TCT診斷為ASC-US病例45例，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性36例，組織病理學(xué)診斷為≥LSIL病例19例：包括LSIL6例，HSIL10例，宮頸浸潤(rùn)性癌3例；HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陰性9例，組織病理學(xué)診斷為炎癥9例。

2.2.3 TCT診斷為ASC-H病例中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)表達(dá)情況 TCT診斷為ASC-H病例19例，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性17例，組織病理學(xué)診斷為≥LSIL病例15例：包括LSIL3例，HSIL10例，宮頸浸潤(rùn)性癌2例；HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陰性2例，組織病理學(xué)均診斷為炎癥。

表4 TCT為NILM、ASC-US、ASC-H病例各病理分組中HPV E6/E7mRNA檢測(cè)表達(dá)(%)情況

2.3 炎癥組中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)表達(dá)情況與組織形態(tài)學(xué)改變的關(guān)系 組織病理學(xué)診斷為炎癥而HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)表達(dá)陽(yáng)性病例76例，其中伴表面鱗狀上皮輕度增生11例，伴腺體鱗化35例，且細(xì)胞核染色較陰性者深、大，染色質(zhì)稍粗；HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陰性68例，其中伴表面鱗狀上皮輕度增生3例，伴腺體鱗化13例。

3 討論

80%的人一生中會(huì)感染HPV，然而90%的感染者兩年內(nèi)通過自身免疫而自動(dòng)清除HPV[12]，即出現(xiàn)一過性感染，僅有少部分人會(huì)進(jìn)一步進(jìn)入持續(xù)感染從而發(fā)生宮頸病變甚至宮頸癌。研究表明高達(dá)90%低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變可消退，60%高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變可消退[13]。臨床常用的篩查方法有細(xì)胞學(xué)和病毒學(xué)篩查兩大類。如前所述，細(xì)胞學(xué)檢查的主流方法為TCT，病毒學(xué)檢查方法包括HPV DNA及HPV RNA檢測(cè)。機(jī)體感染HPV后，被識(shí)別到的HPV可以被機(jī)體自身免疫(包括體液免疫、細(xì)胞免疫)所清除，而未被清除的HPV則可以通過合成顆粒分子而使得HPV的生命周期處于被保護(hù)狀態(tài)而不被細(xì)胞溶解酶溶解，也可以通過與宿主DNA整合而持續(xù)表達(dá)E6、E7 mRNA，進(jìn)一步合成E6、E7蛋白，卻逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)[14]。E6、E7蛋白高表達(dá)并抑制抑癌基因P53、Rb的表達(dá)，激活人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性而導(dǎo)致細(xì)胞永生化、不受控制的復(fù)制最終導(dǎo)致宮頸病變甚至宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[15]。因此，針對(duì)HPV E6/E7 mRNA的檢測(cè)應(yīng)當(dāng)是區(qū)分宮頸潛在惡性病變的重要方法。2012年美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)、美國(guó)陰道鏡檢查與子宮頸病理學(xué)會(huì)(American society for colposcopy and cervical pathology，ASCCP)和美國(guó)臨床病理學(xué)學(xué)會(huì)(American society for clinical pathology，ASCP)聯(lián)合發(fā)布一項(xiàng)指南[16]，明確規(guī)定30～65歲女性應(yīng)每5年接受1次HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合篩查宮頸癌。

本研究針對(duì)進(jìn)行了TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)以及兩者聯(lián)合(串聯(lián))檢測(cè)的304例病例進(jìn)行了討論和分析。TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)以及兩者聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率均隨著病理分組級(jí)別升高而呈上升趨勢(shì)，該結(jié)論也從Rijkaart[17]、Ratman[18]等的研究結(jié)果中得到佐證。此外，在本研究中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率宮頸癌組低于HSIL組，可能的原因是本研究中宮頸浸潤(rùn)性癌標(biāo)本較少，未能全面反映出宮頸癌組的情況。

單獨(dú)使用TCT、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變篩查中均起到一定的作用：TCT對(duì)宮頸疾病診斷特異性(70.1%)較高，但敏感性(58.1%)欠佳，約登指數(shù)(0.283)，研究中顯示在TCT診斷為NILM病例中經(jīng)過再次閱片發(fā)現(xiàn)有17例可見少量異型細(xì)胞，2例可以診斷為HSIL，表明TCT存在一定程度的漏診，易受到標(biāo)本質(zhì)量及主觀因素的影響；而HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)敏感性(93.1%)較高，特異性(47.2%)較低，約登指數(shù)(0.403)。當(dāng)HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)聯(lián)合TCT應(yīng)用后敏感性高達(dá)98.1%，雖然與此同時(shí)降低了特異性(45.1%)，但是其約登指數(shù)(0.432)有所提升，表明聯(lián)合應(yīng)用可以提高其與宮頸病變的一致性[19]。在TCT診斷為可疑病變(ASC-US、ASC-H)病例中，結(jié)合HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性及陰性結(jié)果可以更好的利于病人的分流管理，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性(尤其是16型陽(yáng)性)則進(jìn)一步行陰道鏡下活檢，陰性則定期復(fù)查。既可以彌補(bǔ)在病變初期TCT的低敏感性，避免假陰性帶來的風(fēng)險(xiǎn)，還可以濃縮進(jìn)一步做陰道活檢的病例，并將不同級(jí)別的宮頸癌及癌前病變有效地從中篩查出來，增加診斷的可信度，降低漏診率[20]。

本研究還對(duì)炎癥組中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)情況與組織形態(tài)學(xué)改變做了進(jìn)一步剖析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)陽(yáng)性病例中伴有鱗狀上皮增生及腺體鱗化的比例(46/76，60.5%)高于陰性(16/65，23.5%)，且其細(xì)胞核改變更明顯，表明陽(yáng)性表達(dá)病例更易發(fā)生宮頸病變。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)及TCT對(duì)宮頸癌及癌前病變都有一定的篩檢率，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)顯著提高了敏感性，同時(shí)其診斷與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性得到了提升。因此聯(lián)合TCT和HPV E6/E7mRNA檢測(cè)更適合作為監(jiān)測(cè)預(yù)警指標(biāo)，更能及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌及癌前病變，進(jìn)行早期治療，預(yù)防病情進(jìn)一步發(fā)展。