凡納濱對蝦苗空腸空胃病原的分離鑒定及藥敏試驗

張彬　何蘋萍　黃婷　陳福艷　謝達祥　陳曉漢

摘要：【目的】對伴有空腸空胃癥狀的發(fā)病凡納濱對蝦苗進行病原分離鑒定及藥敏試驗，為有效防治對蝦早期死亡綜合癥（EMS）及開展相關(guān)領(lǐng)域研究提供基礎(chǔ)資料?！痉椒ā恳猿Ｒ?guī)方法進行患病蝦苗病原菌分離，通過透射電鏡觀察、Vitek 2 GN全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及16S rRNA序列擴增等進行病原菌鑒定，并以K-B紙片擴散法進行藥敏試驗?！窘Y(jié)果】從患病蝦苗中分離獲得2株優(yōu)勢菌株（HTW140601和HTW140602），根據(jù)分離菌株的菌體形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，分別判定為鮑希瓦氏菌（Shewanella haliotis）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）。菌株HTW140601和HTW140602對頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星均表現(xiàn)出高度敏感?！窘Y(jié)論】創(chuàng)傷弧菌是引起凡納濱對蝦苗空腸空胃的致病菌，實際生產(chǎn)中可選用頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星進行防治。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對蝦；蝦苗；創(chuàng)傷弧菌；鮑希瓦氏菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S945.46 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0506-05

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是迄今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的優(yōu)良蝦種，但隨著對蝦集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，各種疾病頻繁發(fā)生已成為影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要因素。高健康蝦苗是對蝦養(yǎng)殖成功的重要保障之一，因此，研究引發(fā)蝦苗病害的病原及其防治措施，對促進我國對蝦集約化養(yǎng)殖的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，對蝦早期死亡綜合癥（Early mortality syndrome，EMS）在全球各地肆行。該病在我國已成為對蝦養(yǎng)殖早期高死亡率、高排塘的主要原因，致使對蝦產(chǎn)業(yè)承受重大損失（周勝錳，2013）。凡納濱對蝦EMS又稱為急性肝胰腺壞死癥（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS），多發(fā)生在養(yǎng)殖期30 d內(nèi)，病蝦體色白濁并微紅，肝胰腺腫大、呈淡白或淡黃色，最后萎縮。發(fā)病對蝦在水面游動或趴伏在塘邊，胃空腸空，病情發(fā)展迅速，在我國通常被稱為偷死?。ㄎ膰鴺诺?，2015）。目前，美國、泰國、印度等國家將凡納濱對蝦EMS病原認(rèn)定為副溶血弧菌或變種的副溶血弧菌（Joshi et al.，2014；Kumar et al.，2014；Jee et al.，2015），而國內(nèi)對于該病病原的研究尚無定論，仍處于初步研究階段。劉群等（2014）從疑似患EMS的對蝦中檢測出黃頭病毒（Yellow-head virus，YHV）的一種新株型。黃志堅等（2016）研究表明，對蝦EMS不是由單一病毒所引起，而且與水體理化因子（氨氮、亞硝酸鹽等）密切相關(guān)，尤其在氨氮和亞硝酸鹽濃度較高的養(yǎng)殖池塘容易暴發(fā)EMS?！颈狙芯壳腥朦c】空腸空胃是對蝦EMS的主要癥狀，因此對引起蝦苗空腸空胃的病原菌進行鑒別研究是確保高健康蝦苗生產(chǎn)的前提，但目前國內(nèi)鮮見相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對伴有空腸空胃癥狀的發(fā)病凡納濱對蝦苗進行病原分離鑒定及藥敏試驗，旨在為有效防治對蝦EMS及開展相關(guān)領(lǐng)域研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病凡納濱對蝦苗來自廣西某蝦苗場；TCBS、TSA、TSB培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌藥物敏感紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×Tap PCR Master Mix、細(xì)菌DNA提取試劑盒、離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；擴增引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其中16S rRNA引物序列為16S rRNA1（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16S rRNA2（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

1. 2 病癥觀察

與正常蝦苗個體相比，觀察患病蝦苗的發(fā)病癥狀，包括肝胰腺、腸道及內(nèi)容物、腹節(jié)肌肉等。

1. 3 病原菌分離

用無菌紗布收集蝦苗，滅菌生理鹽水清洗數(shù)次，轉(zhuǎn)入無菌EP管中勻漿，6000 r/min離心后取上清液，以生理鹽水進行10～1000倍梯度稀釋，將不同稀釋倍數(shù)的上清液涂布于TCBS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)16～24 h后取出觀察菌落生長情況。將培養(yǎng)獲得的菌落進行純化，挑取單個菌落接種至TSB培養(yǎng)基，部分菌液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 分離菌株培養(yǎng)特性及其形態(tài)電鏡觀察

28 ℃培養(yǎng)24 h后取出TCBS培養(yǎng)基進行肉眼觀察，同時用pH 7.2磷鎢酸進行負(fù)染色，制備超薄切片，于透射電鏡下觀察并拍照。

1. 5 生化特性鑒定

通過Vitek 2 GN全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進行生化特性鑒定。

1. 6 16S rDNA序列測定分析

用細(xì)菌DNA提取試劑盒對菌液中的DNA進行提取，以16S rRNA為靶序列的PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外透射儀下將含目的條帶的瓊脂糖凝膠切下，利用離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，回收產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序得到的序列與NCBI網(wǎng)站GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進行BLAST分析，選取同源性最高的序列及幾種模式弧菌16S rRNA，采用DNASTAR軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 7 藥敏試驗

以K-B紙片擴散法進行病原菌的藥敏試驗。取過夜培養(yǎng)的菌液200 μL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，待菌液吸附5 min后用無菌鑷子將各種抗菌藥物圓形紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)20 h后觀察結(jié)果。根據(jù)藥物紙片周圍有無抑菌圈及抑菌圈直徑判斷該菌對各種藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 患病蝦苗癥狀

患病苗池中的凡納濱對蝦苗出現(xiàn)浮頭、游池現(xiàn)象，患病蝦苗臨床癥狀均表現(xiàn)為肝胰腺顏色變淡，部分出現(xiàn)萎縮，空腸空胃，有些腹節(jié)肌肉略微白濁（圖1）。

2. 2 分離菌培養(yǎng)特性及菌體形態(tài)

從患病蝦苗中分離獲得2株優(yōu)勢菌株，分別命名為HTW140601和HTW140602。菌株HTW140601在TCBS培養(yǎng)基上，其菌落呈綠色（圖2-a）；負(fù)染電鏡下菌株HTW140601呈桿狀（圖3-a），極生單鞭毛。菌株HTW140602在TCBS培養(yǎng)基上呈黃色（圖2-b），革蘭氏染色呈陰性；負(fù)染電鏡下菌株HTW140602呈短桿狀（圖3-b），兩端鈍圓，極生單鞭毛。

2. 3 分離菌生理生化鑒定結(jié)果

由表1可知，菌株HTW140601對谷氨酰芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶和磷酸酶呈陽性反應(yīng)，對D-葡萄糖、蔗糖發(fā)酵等呈陰性反應(yīng)；菌株HTW140602對D-葡萄糖、蔗糖發(fā)酵等呈陽性反應(yīng)，對谷氨酰芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶等呈陰性反應(yīng)。

2. 4 16S rDNA序列比對分析結(jié)果

對菌株HTW140601和HTW140602進行測序，結(jié)果表明，其16S rDNA序列分別為1468和1480 bp。采用GenBank進行BLAST相似性搜索比對，發(fā)現(xiàn)菌株HTW140601與鮑希瓦氏菌（SS263-N4）的相似度最高，而菌株HTW140602與創(chuàng)傷弧菌（JQ307112.1）的相似度最高，其對應(yīng)的同源性分別為99.0%和98.0%。運用DNASTAR構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5），并結(jié)合生化鑒定結(jié)果可認(rèn)定分離獲得的2株優(yōu)勢菌株（HTW140601和HTW140602）分別為鮑希瓦氏菌（Shewanella haliotis）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）。

2. 5 藥敏試驗結(jié)果

由表2可知，在18種藥物中，菌株HTW140601對卡那霉素、阿莫西林、利福平、恩諾沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢克洛、頭孢唑啉等11種藥物表現(xiàn)高度敏感，對頭孢克肟、林可霉素、復(fù)方新諾明、羅紅霉素4種藥物呈耐藥性；菌株HTW140602對羅紅霉素、頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星4種藥物表現(xiàn)高度敏感，而對頭孢克肟、林可霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、羧芐青霉素、氨曲南、利福平、頭孢哌酮、諾氟沙星、頭孢唑啉10種藥物呈耐藥性。

3 討論

目前，關(guān)于對蝦空腸空胃病原的研究尚無定論。國內(nèi)外學(xué)者進行了多種病原篩查，發(fā)現(xiàn)雖然能從患病對蝦中分離獲得有致病力的副溶血弧菌等細(xì)菌性病原（張寶存等，2012），但病理學(xué)和人工感染試驗結(jié)果表明細(xì)菌感染屬于繼發(fā)感染（Flegel，2012；Lightner et al.，2012）。此外，由于放苗密度過高、養(yǎng)殖水質(zhì)變差、弧菌大量繁殖、蝦苗腸道菌群比例失調(diào)、肝胰腺消化功能紊亂、蝦苗不攝食或攝食過少，也可能造成對蝦蝦苗空腸空胃。本研究結(jié)果表明，從患病蝦苗體內(nèi)分離獲得的優(yōu)勢菌為鮑希瓦氏菌和創(chuàng)傷弧菌，其中，創(chuàng)傷弧菌（菌株HTW140602）是導(dǎo)致蝦苗空腸空胃的病原，但其致病性有待進一步驗證；而鮑希瓦氏菌（菌株HTW140601）可能是作為腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群存在，其依據(jù)是國內(nèi)外至今尚無鮑希瓦氏菌感染凡納濱對蝦的相關(guān)報道，但有利用該菌作為對蝦腸道益生菌抑制病原弧菌增殖的研究報道（Hao et al.，2014）。

本課題組曾對凡納濱對蝦苗種繁育各環(huán)節(jié)水體中弧菌數(shù)量和優(yōu)勢菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)在各繁育環(huán)節(jié)水體中均以溶藻弧菌為優(yōu)勢菌群，而本研究從患病蝦苗體內(nèi)分離獲得的優(yōu)勢弧菌為創(chuàng)傷弧菌，說明水體中的優(yōu)勢弧菌未必是致病菌。創(chuàng)傷弧菌廣泛存在于近海及河口環(huán)境中，從牡蠣、蛤、螃蟹、扇貝、蝦、魚等水產(chǎn)動物及浮游生物沉積物中均可分離獲得此菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害較大的一種細(xì)菌性病原（Biosca et al.，1991；Vinh et al.，2006；Sharshar and Azab，2008；黎炯等，2011）。因此，生產(chǎn)上定期監(jiān)測養(yǎng)蝦池中弧菌的數(shù)量變化對預(yù)防蝦病發(fā)生具有重要意義，尤其是苗種繁育后期和放苗前。蝦苗培育過程是個多因素的復(fù)雜系統(tǒng)，要取得對蝦苗種繁育的成功，不僅要控制弧菌數(shù)量，還必須控制好放苗密度、餌料投喂量、有毒藻類的繁殖，保持良好的水質(zhì)，預(yù)防病原繁殖擴散。

抗生素濫用致使細(xì)菌產(chǎn)生了越來越廣泛的耐藥性，現(xiàn)已危害到水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物安全（張寶存等，2012）。本研究的藥敏試驗結(jié)果表明，鮑希瓦氏菌（菌株HTW140601）對卡那霉素、阿莫西林、利福平、恩諾沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢克洛、頭孢唑啉11種藥物表現(xiàn)出高度敏感，創(chuàng)傷弧菌（菌株HTW140602）僅對羅紅霉素、頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星4種藥物表現(xiàn)出高度敏感。綜合2株分離菌株的藥敏性，可選用頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星3種藥物進行防治。

4 結(jié)論

創(chuàng)傷弧菌是引起凡納濱對蝦苗空腸空胃的致病菌，而鮑希瓦氏菌是作為腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群存在，實際生產(chǎn)中可選用頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星進行防治。

參考文獻：

黃志堅，陳勇貴，翁少萍，路曉鋒，鐘立洪，范文洲，陳旭凌，張慧文，何建國. 2016. 多種細(xì)菌與凡納濱對蝦肝胰腺壞死癥（HPNS）爆發(fā)有關(guān)[J]. 中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），55（1）：1-11.

Huang Z J，Chen Y G，Weng S P，Lu X F，Zhong L H，F(xiàn)an W Z，Chen X L，Zhang H W，He J G. 2016. Multiple bacteria species were involved in hepatopancreas necrosis syndrome （HPNS） of Litopenaeus vannamei[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni，55（1）：1-11.

黎炯，葉星，盧邁新，鄧國成，高風(fēng)英，可小麗，朱華平，黃樟翰.2011. 羅非魚創(chuàng)傷弧菌的分離鑒定和藥敏試驗[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，33（5）：965-970.

Li J，Ye X，Lu M X，Deng G C，Gao F Y，Ke X L，Zhu H P，Huang Z H. 2011. Isolation and identification of Vibrio vulnificus from infected tilapia and its drug-sensitivity analysis[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，33（5）：965-970.

劉群，黃倢，楊昊霖，楊冰，劉筍，王海亮，王勤濤，劉飛，張慶利. 2014. 疑患EMS/AHPNS對蝦中檢出黃頭病毒的一種新株型[J]. 海洋與湖泊，45（4）：703-709.

Liu Q，Huang J，Yang H L，Yang B，Liu S，Wang H L，Wang Q T，Liu F，Zhang Q L. 2014. Detection of a new genotype of yellow-head virus in farmed shrimp suspicious of EMS/AHPNS infection[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，45（4）：703-709.

文國樑，曹煜成，徐煜，胡曉娟，徐武杰，李卓佳. 2015. 養(yǎng)殖對蝦肝胰腺壞死綜合癥研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（11）：118-123.

Wen G L，Cao Y C，Xu Y，Hu X J，Xu W J，Li Z J. 2015. Review on hepatopancreas necrosis syndrome of shrimp[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 42（11）：118-123.

張寶存，劉飛，邊慧慧，劉杰，潘魯青，黃倢. 2012. 一株凡納濱對蝦病原菌的分離、鑒定及其致病力分析[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展，33（2）：56-62.

Zhang B C，Liu F，Bian H H，Liu J，Pan L Q，Huang J. 2012. Isolation，identification，and pathogenicity analysis of a Vibrio parahaemolyticus strain from Litopenaeus vannamei[J]. Progress in Fishery Sciences，33（2）：56-62.

周勝錳. 2013. 北海市竹林地區(qū)EMS的調(diào)查分析和預(yù)防方法[J]. 當(dāng)代水產(chǎn)，（6）：80-81.

Zhou S M. 2013. Investigation and prevention of EMS in Zhulin area of Beihai[J]. Current Fisheries，（6）：80-81.

Biosca E G，Amaro C，Esteve C，Alcaide E，Garay E. 1991. First record of Vibrio vulnificus biotype 2 from diseased European eel，Anguilla anguilla L.[J]. Fish Diseases，14（1）：103-109.

Flegel T W. 2012. Historic emergence， impact and current status of shrimp pathogens in Asia[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 110（2）： 166-173.

Hao K，Liu J Y，Ling F，Liu X L，Lu L，Xia L，Wang G X. 2014. Effects of dietary administration of Shewanella haliotis D4，Bacillus cereus D7 and Aeromonas bivalvium D15，single or combined，on the growth，innate immunity and disease resistance of shrimp，Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture，428-429：141-149.

Jee E H，Mohney L L，Tang K F J，Pantoja C R，Lighner D V. 2015. Plasmid mediated tetracycline resistance of Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND） in shrimps[J]. Aquaculture Reports，2：17-21.

Joshi J，Srisala J，Truong V H，Chen I T，Nuangsaeng B，Suthienkuf O，Lo C F，F(xiàn)legel T W，Sritunyalucksana K，Thitamadee S. 2014. Variation in Vibrio parahaemolyticusisolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）[J]. Aquaculture，428-429：297-302.

Kumar B K，Deekshit V K，Raj J R M，Rai P，Shivanagowda B M，Karunasagar I，Karunasagar I. 2014. Diversity of Vibrio parahaemolyticus associated with disease outbreak among cultured Litopenaeus vannamei （Pacific white shrimp） in India[J]. Aquaculture，433：247-251.

Lightner D V，Redman R M，Pantoja C R，Tang K F J，Noble B L，Schofield P，Mohney L L，Nunan L M，Navarro S A. 2012. Historic emergence， impact and current status of shrimp pathogens in the Americas[J]. Journal of Invertebrate Patho-

logy， 110（2）：174-183.

Sharshar Kh M，Azab E A. 2008. Studies on diseased freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii infected with Vibrio vulnificus[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，11（17）：2092-2010.

Vinh D C，Mubareka S，F(xiàn)atoye B，Plourde P，Orr P. 2006. Vibrio vulnificus septicemia after handling tilapia species fish：A Canadian case report and review[J]. The Canadian Journal of Infectious Diseases & Medical Microbiology，17（2）：129-132.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）