黃柏水提物聯(lián)合抗菌藥對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑菌效果

徐素萍　劉增援　吳永繼　梁政　潘婕　孫燕杰　宋劍武　黃凱　司紅彬

摘要：【目的】探討黃柏水提物與抗菌藥聯(lián)用對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）大腸桿菌的抑制效果，為黃柏的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。【方法】采用二倍微量肉湯稀釋法測定黃柏水提物與抗菌藥的最小抑菌濃度（MIC），并采用微量棋盤稀釋法測定黃柏水提物與抗菌藥聯(lián)用后的分級抑菌濃度指數(shù)（FICI）?！窘Y(jié)果】黃柏水提物對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的MIC為500 mg/mL，黃柏水提物與頭孢曲松鈉、阿莫西林、痢菌凈、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻呋鈉、頭孢他啶、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、加替沙星、頭孢噻肟聯(lián)用后的FICI為0.50～2.01，其中，黃柏水提物與阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻呋鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟、痢菌凈聯(lián)用存在相加作用，與氟苯尼考聯(lián)用存在協(xié)同作用，與諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶間為無關(guān)作用，與環(huán)丙沙星、加替沙星聯(lián)用呈拮抗作用?！窘Y(jié)論】黃柏水提物與青霉素類、第三代頭孢菌素、痢菌凈、氟苯尼考聯(lián)用是通過相加或協(xié)同作用提高藥物對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，但不宜與喹諾酮類抗菌藥聯(lián)合用藥。

關(guān)鍵詞： 黃柏；抗菌藥；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌；聯(lián)合用藥；微量棋盤稀釋法；FICI

中圖分類號： S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0500-06

0 引言

【研究意義】由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended spectrum-lactamases，ESBLs）細(xì)菌廣泛流行（吳英等，2013）。耐藥性大腸桿菌的主要機(jī)制為大腸桿菌產(chǎn)生ESBLs，而ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的一種能水解氧亞胺頭孢菌素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類和青霉素類的β-內(nèi)酰胺酶，對青霉素類、第三代頭孢菌素、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素均呈耐藥性（馬冬雪等，2010）。產(chǎn)ESBLs菌在大腸桿菌中分布廣泛，以其耐藥性強(qiáng)、水解底物廣、易傳播等特點(diǎn)備受關(guān)注，且引起的畜禽感染發(fā)病給臨床藥物治療帶來極大困難。因此，尋找對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌作用效果明顯的中藥，研制出廉價高效的抗菌新藥物，對防治該菌引起的疾病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】梁瑩（2005）采用體外抑菌試驗測定黃柏對大腸桿菌抑制作用，結(jié)果顯示，黃柏對大腸桿菌作用效果較小，大腸桿菌在反應(yīng)管中均長出細(xì)菌，測試為陽性。趙晶晶等（2012）的研究結(jié)果表明，黃柏可有效提高點(diǎn)帶石斑魚嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫。李敬峰等（2013）研究表明，復(fù)方黃柏液保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎具有良好的療效。關(guān)于中西藥聯(lián)合用藥對產(chǎn)ESBLs細(xì)菌抑制作用的研究也有一些文獻(xiàn)報道，何明等（2010）研究表明，清開靈注射劑和雙黃連粉劑分別聯(lián)合頭孢—舒巴坦鈉，具有協(xié)同作用，可增強(qiáng)合頭孢—舒巴坦鈉對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的敏感性；羅芬芳（2013）的研究結(jié)果表明，黃藤素、沒食子酸分別聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素，可明顯抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的生長?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】黃柏資源豐富，具有免疫抑制（邱全瑛等，1996）、減壓強(qiáng)心（李峰和賈彥竹，2004）、抗真菌（劉春平等，2005）、抗活螨（張榮波等，2006）、抗炎（賈紅慧等，2007）等作用，其提取物對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、變形桿菌有明顯的抑菌作用（陳蕾和邸大琳，2006），但目前將黃柏水提物聯(lián)合抗菌藥應(yīng)用于抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】探討黃柏水提物與抗菌藥聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，采用微量棋盤稀釋法測定兩者聯(lián)用后的部分抑菌濃度指數(shù)（FICI），判定抗菌活性是否明顯增強(qiáng)，是否存在協(xié)同或相加作用，為黃柏的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

黃柏購自廣西萬豐藥業(yè)有限公司。頭孢曲松鈉、頭孢噻呋鈉、頭孢他啶、阿莫西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、加替沙星、痢菌凈、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、頭孢噻肟、克拉維酸均在質(zhì)量有效期內(nèi)。MH肉湯、MH瓊脂、普通瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、營養(yǎng)肉湯、三糖鐵瓊脂、細(xì)菌生化微量鑒定管、V-P試劑、M.R.試劑、吲哚試劑均購自杭州天和微生物試劑有限公司。菌種由廣西大學(xué)臨床中獸醫(yī)實(shí)驗室分離并鑒定。

1. 2 菌株分離鑒定

無菌采集病豬病料，分別接種于麥康凱瓊脂板和SS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取可疑菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h；再將菌液分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上純化多次后，對疑似細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢；然后用生化鑒定管對純化后的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，同時對分離菌株進(jìn)行三糖鐵（TSI）、糖發(fā)酵、IMViC、明膠液化等試驗。

1. 3 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢測

按美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的ESBLs標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行初篩試驗。檢測受試菌的抑菌環(huán)直徑是否滿足頭孢他啶（30 μg/片）≤22 mm、氨曲南（30 μg/片）≤27 mm、頭孢噻肟（30 μg/片）≤27 mm、頭孢曲松（30 μg/片）≤25 mm，滿足上述抑菌環(huán)要求的受試菌有可能產(chǎn)ESBLs，再對初篩出的菌株進(jìn)行表型確證試驗。若頭孢他啶與頭孢噻肟兩種藥物中有任何一種在添加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不添加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑相比，增大值≥5 mm時，即可判定為產(chǎn)ESBLs菌株。

1. 4 產(chǎn)ESBLs基因型檢測

參照GenBank中的TEM、SHV、CTX-M、OXA、FosA3基因序列，分別設(shè)計其通用引物（表1）并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25.00 μL，即模板DNA 2.00 μL，上、下游引物各1.00 μL，10×Easy Taq Buffer 2.50 μL，High Pure dNTPs 0.50 μL，Easy Taq DNA合成酶0.25 μL，加去離子水至25.00 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，在各退火溫度（TEM 52.5 ℃，OXA 52.5 ℃，SHV 56.5 ℃，CTX-M 55.0 ℃，F(xiàn)osA3 55.0 ℃）下退火30 s，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以純水作空白對照組。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染液染色在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，再利用BLAST（NCBI）對所得的基因序列進(jìn)行對比分析。

1. 5 黃柏水提物制備及抗菌藥物處理

取黃柏干燥粗粉100 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡過夜，大火煮至沸騰后文火保持30 min，過濾收集濾液。再依次加8倍量與6倍量的水反復(fù)提取2次，合并3次濾液，濃縮至100 mL，此時藥物濃度為1 g/mL，高壓分裝至50 mL離心管，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用無菌蒸餾水將抗菌藥配制成6400 μg/mL，氟苯尼考配制成5120 μg/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 6 單藥最小抑菌濃度（MIC）測定

取培養(yǎng)好的菌液，以高壓過的MH肉湯采用二倍微量肉湯稀釋法測定黃柏水提物及各抗菌藥的MIC，并記錄。

1. 7 黃柏水提物與抗菌藥體外聯(lián)合藥敏試驗

黃柏水提物及各抗菌藥采用微量方陣棋盤法設(shè)計（王爽等，2014），調(diào)整菌液濃度為1×106 CFU/mL，接種于96孔無菌培養(yǎng)板，在縱橫兩個方向上對兩種藥物分別進(jìn)行倍比稀釋，微量振蕩器振蕩，37 ℃下培養(yǎng)16～18 h，觀察黃柏水提物與抗菌藥聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC，以無菌生長孔的最低藥物濃度為MIC，并計算分級抑菌濃度指數(shù)（FICI）。計算公式如下：

聯(lián)合用藥判讀：FICI≤0.50為協(xié)同作用，0.502.00為拮抗作用（陳廣燦等，2011）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成玫瑰紅色、表面光滑的圓形菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色、半透明的圓形菌落；在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色隆起、濕潤、光滑、直徑1～3 mm的菌落。該分離菌在三糖鐵培養(yǎng)基的斜面和底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S，不產(chǎn)氣；在葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖培養(yǎng)基中，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不分解肌醇和尿素；V-P試驗陰性；M.R.試驗陽性；枸櫞酸鹽利用試驗陰性，無液化明膠。經(jīng)鑒定，該分離菌為大腸桿菌。

2. 2 菌株表征鑒定結(jié)果

對分離菌株進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南的抑菌圈直徑分別為14、16、17和14 mm，均符合判斷標(biāo)準(zhǔn)，說明該菌株為產(chǎn)ESBLs可疑菌株。對該菌株進(jìn)行表征確證試驗，由表2可知，頭孢噻肟與頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈直徑之間相差5 mm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)確定該分離菌株產(chǎn)ESBLs。

2. 3 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢測結(jié)果

以TEM、SHV、CTX-M引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR檢測結(jié)果（圖1）顯示，得到TEM基因片段大小為520 bp、CTX-M基因片段大小為898 bp的條帶，不含SHV基因，表明產(chǎn)ESBLs大腸桿菌攜帶TEM和CTX-M基因。經(jīng)BLAST（NCBI）比對發(fā)現(xiàn)，該菌株所含的TEM基因型與KM598665.1的同源性為100%，CTX-M基因型與KC121030.1的同源性為99%。

2. 3 黃柏水提物與抗菌藥MIC測定結(jié)果

采用二倍微量肉湯稀釋法測得黃柏水提物的MIC為500 mg/mL，各抗菌藥的MIC見表3。由表3可知，頭孢曲松鈉、阿莫西林、痢菌凈、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻呋鈉、頭孢他啶、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、加替沙星和頭孢噻肟對ESBLs大腸桿菌的MIC較高，說明產(chǎn)ESBLs細(xì)菌對這些藥物不敏感。

2. 4 黃柏水提物與抗菌藥體外聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果

由表4可知，黃柏水提物與阿莫西林、頭孢曲松鈉的FICI=1.00，與頭孢他啶、頭孢噻呋鈉、頭孢噻肟、痢菌凈的FICI=0.75，與氟苯尼考的FICI=0.50，與諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶的FICI為1.02～1.03，與環(huán)丙沙星、加替沙星的FICI>2.00。表明黃柏水提物聯(lián)合阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻呋鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟、痢菌凈的體外抗菌活性明顯增強(qiáng)，呈相加作用；黃柏水提物與氟苯尼考聯(lián)用呈協(xié)同作用；黃柏水提物與諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)用效果不明顯，為無關(guān)作用；黃柏水提物與環(huán)丙沙星、加替沙星聯(lián)用呈拮抗作用。

3 討論

本研究結(jié)果表明，黃柏水提物與部分抗菌藥聯(lián)合后，對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌有抑制作用，其中黃柏水提物與氟苯尼考聯(lián)用存在協(xié)同作用，與青霉素類、第三代頭孢菌素、痢菌凈聯(lián)用存在相加作用。青霉素類藥物對產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌不敏感，但與黃柏水提物聯(lián)合誘導(dǎo)后，其抗菌效果明顯加強(qiáng)，從而對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌起到抑菌作用。說明黃柏水提物中含有能與青霉素類、氟苯尼考產(chǎn)生相加或協(xié)同作用的有效成分，可增強(qiáng)抑菌效果，具體成分和抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步鑒定及研究。中西藥聯(lián)用可減少用藥量，增強(qiáng)藥效，但一些中藥與西藥聯(lián)合使用后會降低西藥療效，如本研究中黃柏水提物與克林沙星聯(lián)用后對大腸桿菌的抑制效果降低。黃柏的有效成分含有生物堿類，包括小檗堿、黃柏堿、木蘭堿、藥根堿等，黃柏水提物呈弱堿性，與喹諾酮類藥物聯(lián)用會降低或消除喹諾酮類藥物療效（金建玲等，2011；劉紅英和孫玉杰，2013）。本研究中，黃柏水提物與喹諾酮類藥物（諾氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星）的聯(lián)合效果不明顯甚至呈拮抗作用，與上述的前人研究結(jié)果一致。

由于抗菌藥的濫用導(dǎo)致大腸桿菌對一些抗菌藥產(chǎn)生耐藥性，其中產(chǎn)ESBLs大腸桿菌是目前較常見的一種耐藥菌。尋找對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌作用效果明顯的中藥，研制出廉價高效抗菌新藥物是今后研究趨勢。中西藥聯(lián)用能否提高抗菌效果、降低抗菌藥物耐藥性極具研究價值。本研究的體外抑菌效果說明黃柏水提物與部分抗菌藥聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌具有一定的協(xié)同或相加作用，并證實(shí)喹諾酮類藥物與偏堿性中藥存在配伍禁忌，可為臨床研發(fā)出治療耐藥菌、超級菌的新藥物提供依據(jù)。本研究采用體外抑菌試驗，但藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制較體外復(fù)雜，黃柏水提物與抗菌藥聯(lián)合使用是否在體內(nèi)具有相同的效果還需進(jìn)一步探究。中藥成分聯(lián)合抗菌藥使用，既能減少藥品用量、提高治療效果，又可減少不良反應(yīng)現(xiàn)象，甚至能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對一些抗生素的耐藥性（王靜和張淑文，2007），對于開發(fā)新型抗菌劑尤其是抗耐藥菌藥物是一條有效途徑，可成為治療產(chǎn)ESBLs細(xì)菌感染的一個新方向。此外，對中西藥聯(lián)用的研究及篩選出具有良好抑菌效果的中藥，進(jìn)行合理的配伍作用，也將是今后的研究熱點(diǎn)。

4 結(jié)論

黃柏水提物與青霉素類、第三代頭孢菌素、痢菌凈、氟苯尼考聯(lián)用是通過相加或協(xié)同作用提高藥物對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，但不宜與喹諾酮類抗菌藥聯(lián)合用藥。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）