浸浴硝唑尼特對刺激隱核蟲的驅(qū)蟲效果

樊海平　林煜　鐘全福　秦志清

摘要：【目的】明確浸浴硝唑尼特（NTZ）對刺激隱核蟲的驅(qū)蟲效果，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應用提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉TZ溶于二甲亞砜（DMSO）制成溶液，探討NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲和滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲效果，并分析藥物濃度、日換水量、硫酸銅（CuSO4）和滲透劑對其驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的影響?！窘Y(jié)果】NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲的殺滅作用隨藥物濃度的升高而逐漸提高，至20.0 μg/L時刺激隱核蟲感染幼蟲的死亡率達97.33%。經(jīng)1.0 g/m3 NTZ浸浴72 h后，患病大黃魚的刺激隱核蟲滋養(yǎng)體完全脫落；NTZ與CuSO4配伍能有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3浸浴72 h后患病大黃魚體表和鰓部均無刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生，病魚存活率達100.00%；滲透劑氮酮和換水方式與NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果無相關(guān)性。【結(jié)論】NTZ浸浴魚體能有效驅(qū)殺刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，尤其與CuSO4配伍可有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，生產(chǎn)中建議使用劑量為NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3。

關(guān)鍵詞： 刺激隱核蟲；硝唑尼特；大黃魚；浸?。或?qū)蟲效果

中圖分類號： S941.51 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0489-05

0 引言

【研究意義】刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans Brown）又稱海水小瓜蟲（Ichthyophthirius marinus），隸屬于原生動物門、纖毛亞門、寡膜纖毛綱、膜口亞綱、膜口目、凹口科、隱核蟲屬（許丹和劉興旺，2014）。除黃斑藍子魚（Siganus oramin）等少數(shù)魚類外，刺激隱核蟲能感染大部分海水硬骨魚類，且易導致大量死亡，對海水養(yǎng)殖業(yè)的危害極其嚴重（Wang et al.，2010）。在我國大黃魚（Pseudosciaena crocea）養(yǎng)殖生產(chǎn)中，刺激隱核蟲的發(fā)病死亡率高達60%～100%（王國良等，2013），流行季節(jié)病死率在80%以上，每年造成的經(jīng)濟損失在2億元以上（蘇躍中，2009）。因此，尋找可有效防治刺激隱核蟲病的新型藥物對保障海水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中預防刺激隱核蟲病的常見措施有強化營養(yǎng)提高魚體免疫力、降低養(yǎng)殖密度、定期消毒等（陸建學等，2007）。此外，也有采用硫酸銅、奎寧、亞甲藍、苯扎氯銨、苯氧乙醇、福爾馬林（Pironet and Jones，2000；Hirazawa et al.，2003）及四環(huán)素（Reichenbach-Klinke，1978）、中草藥（陳章群，2005）、乙酸（鄔陽等，2013）等進行浸浴治療。Reichenbach-Klinke（1978）提出，將病魚放在13 mg/L四環(huán)素溶液中浸浴30 s可殺死部分刺激隱核蟲；陳章群（2005）用檳榔、苦參和苦楝等中草藥配伍，熬制湯藥后全池潑灑，4 d后患有刺激隱核蟲病的紅鰭東方鲀體表白點消失，治愈率達90%；鄔陽等（2013）研究表明，使用157.4 mg/L乙酸累計處理2 h可有效殺滅全部刺激隱核蟲幼蟲；馬寧等（2015）研究了18種中草藥浸出液在體外對刺激隱核蟲幼蟲和包囊的殺滅效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以辣椒和檳榔的殺蟲效果最佳，而牽牛子、貫眾、黃柏、茯苓、荊芥、熟地黃、鶴虱沒有殺蟲效果?！颈狙芯壳腥朦c】硝唑尼特（Nitazoxanide，NTZ）是一種新型廣譜、高效抗寄生蟲和微生物藥物，對多種原蟲、吸蟲、線蟲、蠕蟲感染和敏感腸道菌感染有特效，且安全性高、應用范圍廣（董靖等，2010）。但目前僅見NTZ對斑馬魚的急性毒性試驗報道（張德利等，2011），對其他水產(chǎn)動物的毒性及對魚類寄生蟲的驅(qū)殺效果鮮見研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲和滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲效果，并分析藥物濃度、日換水量、硫酸銅（CuSO4）和滲透劑對其驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的影響，以期為NTZ在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

NTZ（生產(chǎn)批號20150217XZ，純度在98%以上）購自湖北巨勝科技有限公司，試驗時按1∶5（g/mL）比例溶于二甲基亞砜（DMSO，天津恒興化學試劑制造有限公司）；氮酮（純度在98%以上）購自南京峰云化工有限公司；CuSO4（分析純）購自天津恒興化學試劑制造有限公司；鹽酸土霉素（純度在98%以上）購自陜西正大生物科技有限公司。大黃魚由福建福鼎海鷗水產(chǎn)食品有限公司網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地提供，其規(guī)格為50～130 g/尾，抽樣檢查發(fā)現(xiàn)魚體表和鰓部寄生有大量刺激隱核蟲；經(jīng)活水船運回實驗室后，暫養(yǎng)于直徑為1.0 m的玻璃鋼桶中，連續(xù)充氣增氧，每天換水1次（砂濾），每次換水30%左右；暫養(yǎng)2～3 d后檢查，蟲體數(shù)量不斷增加，即可用于后續(xù)試驗。

1. 2 刺激隱核蟲感染幼蟲培養(yǎng)

收集從大黃魚體表和鰓部脫落的刺激隱核蟲包囊，于25 ℃下孵化40 h后可獲得感染幼蟲，海水調(diào)整幼蟲濃度至1000個/mL。

1. 3 NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲的殺滅試驗

將DMSO溶解的NTZ用海水分別稀釋至2.0、4.0、10.0、20.0和40.0 μg/L，各取50.0 μL加至96孔細胞板中，然后加入刺激隱核蟲感染幼蟲液50.0 μL，NTZ終濃度為1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/L，每個濃度梯度設3個重復。培養(yǎng)板放入25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，倒置顯微鏡下觀察刺激隱核蟲感染幼蟲的死亡情況。

1. 4 NTZ對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲試驗

設NTZ 0.5 g/m3、NTZ 1.0 g/m3、NTZ 0.5 g/m3+ CuSO4 0.5 g/m3及無藥對照組（CK），每組6尾病魚，3個重復。試驗期間連續(xù)充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，每隔24 h換水補藥（1/2）一次。共浸浴72 h，每日記錄魚體死亡情況，并分別于浸浴48和72 h取全鰓鏡檢刺激隱核蟲滋養(yǎng)體數(shù)量。

1. 5 NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的正交試驗

選取NTZ濃度（0、1.0和1.6 g/m3）、日換水量（0、40%和70%）、CuSO4（0、0.3和0.6 g/m3）和滲透劑氮酮（0、0.3和0.6 g/m3）4個因素進行正交試驗（表1），每組20尾大黃魚苗（規(guī)格6～8 cm）。試驗在盛有50 L海水的150 L塑料桶內(nèi)進行，試驗期間連續(xù)充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，每隔24 h換水補藥（1/2）一次。共浸浴72 h，分別于浸浴24、48和72 h取病魚的鰓、鰭和30%左右體表黏液進行鏡檢，每組每次取病魚3尾。

1. 6 NTZ與CuSO4配伍對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲試驗

設NTZ 2.0 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3、NTZ 1.5 g/m3+ CuSO4 0.5 g/m3及無藥對照組（CK），每組15尾病魚。試驗期間連續(xù)充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，每隔24 h換水補藥（1/2）一次。共浸浴72 h，分別于浸浴48和72 h取病魚全鰓和30%左右黏液檢查刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生情況。同時，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3對刺激隱核蟲感染率達100%且出現(xiàn)輕度爛鰓和鱗片脫落的大黃魚苗（規(guī)格6～8 cm）進行驅(qū)蟲治療。

2 結(jié)果與分析

2. 1 NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲的殺滅效果

由表2可以看出，在4 h內(nèi)1.0 μg/L NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲無殺滅作用，但隨藥物濃度的升高，其殺滅能力逐漸提高，至20.0 μg/L時刺激隱核蟲感染幼蟲的死亡率達97.33%。

2. 3 NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的正交試驗結(jié)果

由表4可以看出，NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果與藥物濃度呈正相關(guān)，即藥物濃度越高，其驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果越佳；NTZ與CuSO4配伍可明顯提高其對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，呈疊加效應；滲透劑氮酮和日換水量與NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果無相關(guān)性。

2. 4 NTZ與CuSO4配伍對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果

由表5可以看出，NTZ 2.0 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3和NTZ 1.5 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3處理組病魚經(jīng)浸浴24、48和72 h的死亡率分別為6.67%、20.00%、26.67%和6.67%、19.67%、26.33%；而CK組病魚在浸浴24、48和72 h的死亡率分別為13.33%、73.33%和100.00%。浸浴48和72 h后檢查試驗組大黃魚的體表和鰓，未發(fā)現(xiàn)有刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生；而CK組48 h時檢查大黃魚的體表和鰓，發(fā)現(xiàn)仍有大量刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生。以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3對刺激隱核蟲感染率達100%且出現(xiàn)輕度爛鰓和鱗片脫落的大黃魚苗進行驅(qū)蟲治療，病魚存活率達100.00%，浸浴48 h檢查發(fā)現(xiàn)病魚的鰓和體表有少量刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生，浸浴72 h后大黃魚體表和鰓部已無刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生。

3 討論

NTZ為口服藥物，是第一個被美國食品和藥品管理局（FDA）批準為專門用于治療隱孢子蟲感染的藥物（劉耀文，2003），其優(yōu)點是既可驅(qū)治多種蠕蟲，又可驅(qū)治原蟲（主要是腸道及腔道寄生原蟲）（沈一平等，2006），但至今其藥效作用機制尚未明確。根據(jù)藥物活性譜研究結(jié)果可知，NTZ首先對厭氧或微需氧蟲種有效，其結(jié)構(gòu)特征與氯氰碘柳胺及其相關(guān)化合物相似，與阿苯達唑、甲苯達唑和甲硝唑相比，NTZ的抗寄生蟲譜與抗菌譜更廣（張可煜等，2007）。在國外，NTZ主要用于治療犬、貓的蠕蟲感染（趙占中，2009）；而國內(nèi)的研究表明，NTZ對犬、羊、雞、兔、鼠等動物體內(nèi)的寄生蟲均有治療作用（趙占中，2009；Zhang et al.，2010）。本研究通過對大黃魚刺激隱核蟲進行藥物浸浴驅(qū)殺試驗，結(jié)果證實NTZ浸浴魚體能有效驅(qū)殺刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，也佐證了該藥在水產(chǎn)寄生蟲病防治中應用的可能性。

CuSO4對刺激隱核蟲的有效性已得到證實（潘孝益等，1994；毛國民等，2005；陸建學等，2007）。本研究通過TNZ與CuSO4配伍，既充分發(fā)揮TNZ對寄生蟲幼蟲和滋養(yǎng)體的殺滅作用及對包囊的抑制作用，又兼顧CuSO4對刺激隱核蟲成蟲和幼蟲的殺滅作用，結(jié)果顯示，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3對感染刺激隱核蟲且出現(xiàn)輕度爛鰓和鱗片脫落的大黃魚苗進行浸浴治療，病魚存活率達100.00%，浸浴72 h后大黃魚體表和鰓部已無刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生?？梢姡琓NZ與CuSO4配伍可有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果。

本研究結(jié)果表明，通過浸浴驅(qū)殺刺激隱核蟲，除部分蟲體被殺滅外，大部分滋養(yǎng)體在藥物作用下迅速形成包囊并脫離魚體。這些脫落的刺激隱核蟲包囊經(jīng)過一段時間的發(fā)育，又能孵化出感染幼蟲重復感染魚體，且感染幼蟲數(shù)量較原滋養(yǎng)體數(shù)量呈幾百倍增長，重復感染對魚體危害更嚴重。因此，實際生產(chǎn)中要有效控制刺激隱核蟲重復感染，可用水流將脫落的刺激隱核蟲包囊沖出養(yǎng)殖區(qū)，并集中進行殺滅處理，且必須在包囊孵出感染幼蟲前進行殺滅處理等。

4 結(jié)論

NTZ浸浴魚體能有效驅(qū)殺刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，尤其與CuSO4配伍可有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，生產(chǎn)中建議使用劑量為NTZ 1.2 g/m3+

CuSO4 0.5 g/m3。

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（責任編輯 蘭宗寶）