響應面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液的脫氟工藝

張迪 吉薇 吉宏武 高靜 豐險

摘要：【目的】利用響應面法對南極磷蝦酶解液的脫氟工藝條件進行優(yōu)化，為南極磷蝦在食品工業(yè)中開發(fā)應用提供技術依據(jù)?！痉椒ā吭趩我蛩卦囼灥幕A上，以脫氟率（Y）為響應值，選擇醋酸鈣添加量（A）、初始pH（B）、反應溫度（C）為自變量，采用Box-Bohnken試驗設計方法，研究各自變量及其相互作用對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響，并分析酶解液中主要營養(yǎng)成分的變化?！窘Y果】建立二次回歸方程：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2；醋酸鈣添加量、初始pH及醋酸鈣添加量與反應溫度的交互作用對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響極顯著（P<0.01）。南極磷蝦酶解液脫氟工藝的最佳條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應時間140 min、反應溫度30.24 ℃，在此條件下的脫氟率為（84.15±1.37）%，與理論預測值（85.37%）的相對誤差較小。在最佳條件下脫氟后，酶解液中總氮和氨基態(tài)氮含量分別損失3.11%和2.52%，反應前后含量變化不顯著（P>0.05）?！窘Y論】采用響應面法優(yōu)化得到的南極磷蝦酶解液脫氟工藝具有操作簡單、對酶解液的營養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點，有較高的可行性；建立的回歸模型可用于實際預測。

關鍵詞： 南極磷蝦；酶解液；脫氟；醋酸鈣；響應面法

中圖分類號： TS254.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1187-06

0 引言

【研究意義】南極磷蝦（Euphausia superba）是重要的蛋白質資源之一，全球總儲量達3.79億t（Atkinson et al.，2011）。南極磷蝦營養(yǎng)豐富，含有鈉、鈣、鐵、鉀、磷等多種礦物質元素及人體必需的全部氨基酸，且不飽和脂肪酸、磷脂和類胡蘿卜素的含量豐富，具有很高的食用價值（Yoshitomi，2004；孫雷等，2008）。氟是人類必需的微量元素之一，每日攝入量不能超過4～5 mg，少量的氟有助于牙齒和骨骼正常發(fā)育，但攝入量過高會導致骨質疏松癥和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，甚至出現(xiàn)無法站立、癱瘓等癥狀（Meenakshi and Maheshwari，2006；Wang et al.，2011）。南極磷蝦具有富集氟的特性（Tou et al.，2007），其酶解液存在氟含量過高的問題，限制了其開發(fā)利用，因此有必要先對磷蝦酶解液中的氟進行脫除，才能被用于食品開發(fā)?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有不少降低南極磷蝦制品中氟含量的方法，包括酸洗法、化學沉淀法（Yang et al.，2001）、電解法（Tahir，2005）、吸附法（Tripathy et al.，2006）等。酸洗法和化學沉淀法簡單方便，是南極磷蝦較常用的處理方法。酸洗法是利用酸對整只磷蝦、磷蝦勻漿物或煮熟的粉碎磷蝦肉進行處理，將磷蝦中無機氟轉變?yōu)橛坞x態(tài)的氟離子除去；此法能除去磷蝦中的部分氟，但會破壞產(chǎn)品的組織特性和風味，使磷蝦中的營養(yǎng)物質大量損失（Jung et al.，2013）。化學沉淀法主要采用可溶性鈣鹽，使F-和Ca2+生成CaF2沉淀除去，該方法操作簡單、成本低廉，具有良好的應用前景。已有研究以氯化鈣（李紅艷等，2011）、生石灰（呂傳萍等，2012）等無機鈣作為脫氟劑處理南極磷蝦酶解液，可去除酶解液中大部分的氟。但無機鈣在食品加工中作為食品添加劑不宜大量使用，反應后會使酶解液產(chǎn)生苦味和酸澀味，影響其在食品工業(yè)中推廣應用（李春發(fā)，2012）?！颈狙芯壳腥朦c】醋酸鈣是常用的食品添加劑，在食品工業(yè)中一直作為螯合劑、增香劑、穩(wěn)定劑等（鄭海鵬和董全，2008）。但目前鮮見利用響應面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液醋酸鈣法脫氟工藝的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以醋酸鈣為鈣源，脫氟率為考察指標，在單因素試驗基礎上，采用響應面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液的脫氟工藝，為南極磷蝦在食品工業(yè)中開發(fā)應用提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

南極磷蝦由湛江國聯(lián)水產(chǎn)開發(fā)股份有限公司提供，冷凍方式運到實驗室，貯藏于-70 ℃冰箱。醋酸鈣、高氯酸、氟化鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、冰乙酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。主要儀器設備：PF-1氟選擇電極（上海雷磁精密儀器有限公司）、232-01型甘汞參比電極（上海雷磁精密儀器有限公司）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（常州國華電器有限公司）、MS300磁力攪拌器（上海精密科學儀器有限公司）、WFO-700型恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、PHST-3F酸度計（上海雷磁精密儀器有限公司）、GL-10LND型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 南極磷蝦酶解液制備 南極磷蝦切碎，用分散均質機以10000 r/min均質5 min，均質后的漿液加入900 U/g混合酶（150000 U/g動物蛋白水解酶∶140000 U/g風味酶=1∶1），于50 ℃下攪拌反應4 h，反應完全的酶解液在離心力4000 g的條件下離心5 min，取離心后的上清液于4 ℃存放備用。

1. 2. 2 脫氟率計算 采用氟離子選擇電極法（GB/T 5009.18-2003）測定氟離子含量，并計算脫氟率。

脫氟率（%）=1-脫氟后酶解液氟含量/脫氟前酶解液氟含量×100

1. 2. 3 單因素試驗

1. 2. 3. 1 醋酸鈣添加量的選擇 在南極磷蝦酶解液中分別添加1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/mL的醋酸鈣，pH調至10.0，25 ℃攪拌反應1 h，測定反應后酶解液脫氟率。

1. 2. 3. 2 初始pH的選擇 將酶解液pH分別調至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，添加20.0 mg/mL醋酸鈣，25 ℃攪拌反應1 h，測定反應后酶解液脫氟率。

1. 2. 3. 3 反應溫度的選擇 在酶解液中添加20.0 mg/mL醋酸鈣，pH調至10.0，分別于4、10、20、30、40、50和60 ℃下攪拌反應1 h，測定反應后酶解液脫氟率。

1. 2. 3. 4 反應時間的選擇 在酶解液中添加20.0 mg/mL醋酸鈣，pH調至10.0，25 ℃攪拌分別反應20、40、60、80、100、120、140、180、220和260 min，測定反應后酶解液脫氟率。

1. 2. 4 響應面試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，根據(jù)Box-Bohnken設計方法，選擇對南極磷蝦酶解液脫氟率影響較大的3個因素（醋酸鈣添加量、初始pH、反應溫度），取-1、0、1代表變量的3個水平，以脫氟率為響應值建立二次響應面分析模型。共進行17個試驗，其中12個為析因點，5個為零點用于估算誤差。每個試驗重復3次，試驗結果表示為測定結果的平均值±標準偏差。響應面因素與水平見表1。

1. 2. 5 酶解液中營養(yǎng)物質的變化分析 取少量脫氟前后的酶解液，分析脫氟過程中營養(yǎng)物質的變化。采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010）測定總氮，甲醛滴定法（GB 18186-2000）測定氨基態(tài)氮，分別計算總氮和氨基態(tài)氮損失率。

總氮損失率（%）=1-脫氟后酶解液總氮含量/脫氟前酶解液總氮含量×100

氨基態(tài)氮損失率（%）=1-脫氟后酶解液氨基態(tài)氮含量/脫氟前酶解液氨基態(tài)氮含量×100

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.5、Origin 7.0和Excel 2007進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2. 1 氟離子標準曲線的繪制

根據(jù)國標GB/T 5009.18-2003中的氟離子選擇電極法繪制氟離子標準曲線，得到標準曲線的線性回歸方程為y=-46.115x+240.46（其中y為電位值，x為氟離子濃度的對數(shù)值）。在氟濃度為0.04～1.00 μg/mL線性范圍內，該回歸方程的相關系數(shù)R2=0.9992，表明該標準曲線具有較好的相關性，根據(jù)此標準曲線可測定南極磷蝦酶解液中的氟濃度。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 醋酸鈣添加量對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 由圖1可知，隨著醋酸鈣添加量的增加，南極磷蝦酶解液脫氟率逐漸上升，添加量為20.0～25.0 mg/mL時達最大值范圍，繼續(xù)添加醋酸鈣，脫氟率變化不明顯?？紤]到成本和實際生產(chǎn)的需要，選擇醋酸鈣最佳添加量為20.0 mg/mL。

2. 2. 2 初始pH對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 如圖2所示，當南極磷蝦酶解液pH在7.0～10.0范圍時，脫氟率由61.25%增至89.76%；酶解液pH超過10.0后，脫氟率略有下降，其中pH在10.0～11.0范圍時，脫氟率由89.76%降至84.47%。這是由于醋酸鈣屬于強堿弱酸鹽，當pH>10.0時，Ca2+與OH-形成Ca（OH）2，使Ca2+濃度降低。因此，選擇南極磷蝦酶解液脫氟反應的最佳初始pH為10.0。

2. 2. 3 反應溫度對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 由圖3可知，南極磷蝦酶解液脫氟率隨著反應溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢。反應溫度由4 ℃升至30 ℃，脫氟率平緩上升；超過30 ℃后，脫氟率隨反應溫度的升高持續(xù)下降。隨溫度升高，蛋白質分子的天然構象改變會導致其生物活性喪失，次級鍵遭到破壞使帶電基團也被破壞，其帶電性能發(fā)生變化可能影響了溶液中的離子反應，從而使脫氟率降低。因此，選擇南極磷蝦酶解液脫氟工藝的最佳反應溫度為30 ℃。

2. 2. 4 反應時間對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 如圖4所示，隨著反應時間的延長，南極磷蝦酶解液脫氟率逐漸上升，140 min時脫氟率達最大值，繼續(xù)反應，脫氟率變化不明顯。醋酸鈣是強堿弱酸鹽，在反應過程中需要一定時間Ca2+才能達到平衡狀態(tài)，因而CaF2的沉降速度慢，達到最大的脫氟率所需時間較長。考慮到食品工業(yè)生產(chǎn)中的效率和能耗等問題，選擇酶解液最佳反應時間為140 min。

2. 3 響應面結果分析

2. 3. 1 響應面結果及方差分析 利用Design-Expert 8.0.5對響應面試驗結果（表2）進行二次多元回歸分析，除去不顯著項得到模型的二次多項回歸方程為：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2。

由表3可知，模型P<0.0001，而失擬項不顯著（P=

0.2213>0.05），表明模型極顯著。因素一次項A和B、交互項AC及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P<0.01），一次項C、交互項AB和BC對結果影響不顯著（P>0.05，下同）。同時，軟件分析的復相關系數(shù)R的R2Adj為97.93%，表明模型中殘差相互獨立，擬合程度良好，試驗誤差小，可用于對南極磷蝦酶解液的脫氟率進行分析和預測。

2. 3. 2 響應曲面圖分析 醋酸鈣添加量、初始pH和反應溫度3個因素間交互作用對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響如圖6～8所示。反應溫度與醋酸鈣添加量的交互作用對脫氟率的影響最大，其曲線圖最陡峭，隨著反應溫度的升高和醋酸鈣添加量的增加，脫氟率呈先升高后降低的趨勢；而初始pH與反應溫度、初始pH與醋酸鈣添加量間的交互作用對脫氟率的影響不明顯，曲線較平滑。響應面分析結果與表3的結果一致。

2. 3. 3 驗證試驗結果 通過Design-Expert 8.0.5得到二次多項回歸方程，在試驗因素水平范圍內預測南極磷蝦酶解液脫氟的最佳工藝條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應溫度30.24 ℃，此時的酶解液脫氟率理論預測值為85.37%。為檢驗回歸方程預測結果的可靠性，在最優(yōu)條件下進行3次驗證試驗，實際測得的脫氟率為（84.15±1.37）%，與理論值的平均誤差為1.42%。試驗結果充分驗證了該模型的正確性，得到的二次多項回歸方程可較準確預測醋酸鈣法制備南極磷蝦酶解液的脫氟率。

2. 4 酶解液中營養(yǎng)物質的變化情況

南極磷蝦酶解液在脫氟的過程中其營養(yǎng)成分可能會發(fā)生變化，因此以總氮和氨基態(tài)氮為指標反映酶解液中營養(yǎng)物質的變化情況，在最佳工藝條件下，檢測脫氟反應對南極磷蝦酶解液中營養(yǎng)物質的影響。由表4可知，酶解液反應后，其總氮損失3.11%，氨基態(tài)氮損失2.52%。利用醋酸鈣脫氟對酶解液的營養(yǎng)成分影響不顯著，說明脫氟反應對南極磷蝦酶解液的主要營養(yǎng)成分影響不明顯，醋酸鈣法是一種比較理想的脫氟方法。

3 討論

南極磷蝦營養(yǎng)豐富且儲量巨大，有廣闊的應用前景，但其酶解液中的氟含量過高限制其進一步開發(fā)應用。在保留營養(yǎng)物質和原有風味的前提下，將酶解液中過量的氟除去，對于南極磷蝦的開發(fā)應用具有重要意義。有關南極磷蝦的脫氟工藝，已有學者對其進行研究。李紅艷等（2011）利用氯化鈣脫氟，反應得到酶解液的脫氟率為89.43%。F-和Ca2+形成的CaF2顆粒較小，根據(jù)斯托克斯原理，顆粒粒徑的平方與微粒的沉降速度呈正比，因此CaF2的沉降速度很慢，達到平衡需較長時間；在反應過程中為了加快反應速率，需加大氯化鈣用量，但用氯化鈣反應后酶解液有苦澀味，影響南極磷蝦酶解液進一步的開發(fā)應用。呂傳萍等（2012）以生石灰作為鈣源，得到酶解液脫氟率為88.25%。生石灰價廉易得，但其溶解度較小，需形成乳濁液才能參與反應。由于F-和Ca2+反應生成的CaF2沉淀會附著在Ca（OH）2顆粒的表面，影響反應速率，因此在反應過程中一般也需加入較多的生石灰。生石灰參與反應釋放出大量熱，致使蛋白變性，同時使酶解液產(chǎn)生苦澀味和石灰味。本研究以醋酸鈣為脫氟劑，采用響應面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液脫氟工藝條件，結果發(fā)現(xiàn)在最佳條件下酶解液脫氟率為（84.15±1.37）%。雖然與無機鈣相比，醋酸鈣的脫氟率略低，但醋酸鈣作為常用的食品添加劑和營養(yǎng)強化劑，能有效降低酶解液中氟含量，同時對酶解液的風味和營養(yǎng)成分影響較小，是一種理想的脫氟劑，適用于食品工業(yè)大規(guī)模推廣使用。

本研究通過單因素試驗和響應面試驗對醋酸鈣法制備南極磷蝦低氟酶解液的工藝條件進行優(yōu)化，從而建立以醋酸鈣添加量（A）、初始pH（B）和反應溫度（C）3個因素對南極磷蝦酶解液脫氟率（Y）的回歸模型：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-

3.20C2。經(jīng)過驗證試驗證明，該模型可預測南極磷蝦酶解液脫氟率的變化規(guī)律，適用于實際生產(chǎn)中的預測。在響應面優(yōu)化試驗中，單因素和雙因素交互作用對脫氟率的影響為：醋酸鈣添加量、初始pH及醋酸鈣添加量與反應溫度的交互作用對脫氟率的影響極顯著，與呂傳萍等（2012）的研究結果不完全一致。優(yōu)化得出的脫氟工藝條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應時間140 min、反應溫度30.24 ℃，在此條件下反應后的酶解液營養(yǎng)成分總氮和氨基態(tài)氮的含量變化小。在實際生產(chǎn)中采用該工藝參數(shù)，可除去酶解液中的過量氟，同時最大限度保留南極磷蝦的原有風味和營養(yǎng)成分，有利于南極磷蝦酶解液進一步的開發(fā)應用，為南極磷蝦的食品工業(yè)化發(fā)展打下基礎。

4 結論

采用響應面法優(yōu)化得到南極磷蝦酶解液的最佳脫氟工藝條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應時間140 min、反應溫度30.24 ℃，在此條件下的脫氟率為（84.15±1.37）%，與理論預測值的相對誤差小。該工藝具有操作簡單、對酶解液的營養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點，有較高的可行性；建立的回歸模型可用于實際預測。

參考文獻：

李春發(fā). 2012. 食品中使用的幾種無機鈣鹽的分析比較[J]. 飲料工業(yè)，15（9）：3-5.

Li C F. 2012. Analysis and comparison of several inorganic calcium salts used in food[J]. The Beverage Industry， 15（9）：3-5.

李紅艷，薛長湖，王靈昭，王玉明，薛勇. 2011. 南極磷蝦酶解液氯化鈣法脫氟工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技，32（3）：330-333.

Li H Y，Xue C H，Wang L Z，Wang Y M，Xue Y. 2011. Study on defluoridation technology of Antarctic krill hydrolyzate by adding calcium chloride[J]. Science and Technology of Food Industry，32（3）：330-333.

呂傳萍，李學英，楊憲時，郭全友. 2012. 生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的研究[J]. 食品工業(yè)科技，33（12）：106-110.

Lü C P，Li X Y，Yang X S，Guo Q Y. 2012. Study on removal efficiency of fluoride from Antarctic krill hydrolyzate using quick lime[J]. Science and Technology of Food Industry，33（12）：106-110.

孫雷，周德慶，盛曉風. 2008. 南極磷蝦營養(yǎng)評價與安全性研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，29（2）：57-64.

Sun L，Zhou D Q，Sheng X F. 2008. Nutrition and safety evaluation of Antarctic krill[J]. Marine Fisheries Research，29（2）：57-64.

鄭海鵬，董全. 2008. 蛋殼制取有機活性鈣的研究進展[J]. 中國食品添加劑，（3）：87-92.

Zheng H P，Dong Q. 2008. Progress in development of organic and activity calcium from egg shell[J]. China Food Additives，（3）：87-92.

Atkinson A，Siegel V，Pakhomov E A，Jessopp M J，Loeb V. 2011. A re-appraisal of the total biomass and annual production of Antarctic krill[J]. Applied & Environmental Microbiology，77（16）：5826-5829.

Jung H R，Kim M A，Seo Y S，Lee Y B，Chun B S. 2013. Decreasing effect of fluoride content in Antarctic krill（Euphausia superba） by chemical treatments[J]. International Journal of Food Science and Technology， 48（6）：1252-1259.

Meenakshi，Maheshwari R C. 2006. Fluoride in drinking water and its removal[J]. Journal of Hazardous Materials，137（1）：456-463.

Tahir H. 2005. Comparative trace metal contents in sediments and liquid wastes from tanneries and the removal of chromium using zeolite-5A[J]. Electronic Journal of Environmental，Agricultural and Food Chemistry，4（4）：1021-1032.

Tou J C， Jaczynski J， Chen Y C. 2007. Krill for human consumption： nutritional value and potential health benefits[J]. Nutrition Reviews，65（2）：63-77.

Tripathy S S，Bersillon J L，Gopal K. 2006. Removal of fluoride from drinking water by adsorption onto alum-impregnated activated alumina[J]. Separation and Purification Techno-

logy，50（3）：310-317.

Wang Y，Chen N P，Wei W，Cui J，Wei Z G. 2011. Enhanced adsorption of fluoride from aqueous solution onto nanosized hydroxyapatite by low-molecular-weight organic acids[J]. Desalination，276（1）：161-168.

Yang M，Zhang Y，Shao B，Qi R，Myoga H. 2001. Precipitative removal of fluoride from electronics wastewater[J]. Journal of Environmental Engineering，127（10）：902-907.

Yoshitomi B. 2004. Utilization of Antarctic krill for food and feed[J]. Food Chemistry，42（4）：45-54.

（責任編輯 羅 麗）