四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律

謝木嬌 區(qū)又君 溫久福 李加兒 周慧 王鵬飛 劉奇奇

摘要：【目的】研究四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律，為指導(dǎo)四指馬鲅育苗過(guò)程中適時(shí)更換餌料及制定投餌策略、完善育苗工藝和提高育苗成活率提供參考依據(jù)。【方法】利用組織石蠟切片和阿利新蘭—高碘酸雪夫試劑（AB-PAS）染色，觀察研究1～30日齡四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程?！窘Y(jié)果】四指馬鲅的食道最早在5日齡時(shí)出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞；9日齡仔魚(yú)食道黏液細(xì)胞數(shù)量有所增加，胃部已有賁門(mén)部、幽門(mén)部、胃體部和盲囊部的明顯區(qū)域分化，黏膜皺褶豐富，各區(qū)域大部分的黏膜表面均有I型黏液細(xì)胞分布；15日齡仔魚(yú)胃腺區(qū)域出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，腸道前、中、后段均出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，且以圓形為主；17日齡仔魚(yú)幽門(mén)盲囊區(qū)域出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞；23和30日齡仔魚(yú)消化道黏液細(xì)胞以II型為主，數(shù)量持續(xù)增加。四指馬鲅消化道各段黏液細(xì)胞密度、大小及分泌能力均隨日齡的增加而增加，且同日齡仔魚(yú)消化道中以食道的黏液分泌能力最強(qiáng)。【結(jié)論】四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)生和分布特征與仔魚(yú)攝食能力日益增強(qiáng)及消化道結(jié)構(gòu)逐漸完善的趨勢(shì)相適應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 四指馬鲅；消化道；黏液細(xì)胞；發(fā)生；分布；開(kāi)口攝食

中圖分類(lèi)號(hào)： S965.329 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）07-1222-06

0 引言

【研究意義】四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）隸屬于鯔形目（Mugiliformes）馬鲅亞目（Polynemoidei）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）（孫典榮和陳錚，2013），廣泛分布于熱帶和溫帶的砂石底海區(qū)，如澳大利亞?wèn)|西海岸、美國(guó)夏威夷海域、印度尼西亞海域等（Zischke et al.，2009；Moore et al.，2011；Newman et al.，2011；Ballagh et al.，2012），我國(guó)的黃海、渤海、東海和南海也有分布（Wang et al.，2014），目前在我國(guó)臺(tái)灣、廣東、海南、浙江等地已有人工養(yǎng)殖。黏液細(xì)胞隨著機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，其成分、形態(tài)和分布均會(huì)發(fā)生明顯變化，可作為檢測(cè)消化道功能發(fā)育的一項(xiàng)參考依據(jù)（謝木嬌等，2015），而消化道的結(jié)構(gòu)發(fā)育與功能完善又直接影響仔稚魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用及其成活率，因此，研究觀察魚(yú)類(lèi)消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律對(duì)揭示仔稚魚(yú)消化道的變化規(guī)律及苗種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黏液細(xì)胞分泌的黏液物質(zhì)包含水解酶、糖蛋白、免疫蛋白、黏多糖等多種活性物質(zhì)，進(jìn)而形成協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境平衡的黏液屏障（Khojasteh et al.，2009），在潤(rùn)滑食物、協(xié)助消化吸收、抗菌、抗病毒及離子轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮作用（Sarasquete et al.，2009）。近年來(lái)，已有關(guān)于不同魚(yú)種消化道黏液細(xì)胞發(fā)育的研究報(bào)道，如波紋唇魚(yú)（Cheilinus undulates）（王永波等，2010）、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus malabaricus）（李鑫煒等，2012）、哲羅魚(yú)（Hucho taimen）（關(guān)海紅和尹家勝，2013）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）（張建業(yè)等，2014）等。李鑫煒等（2012）研究表明，點(diǎn)帶石斑魚(yú)黏液細(xì)胞出現(xiàn)的日齡與開(kāi)口攝食日齡一致，即黏液細(xì)胞的存在可能是仔稚魚(yú)開(kāi)口攝食的前提。關(guān)海紅和尹家勝（2013）研究發(fā)現(xiàn)，哲羅魚(yú)黏液細(xì)胞發(fā)生的部位分別是口咽腔、消化道，黏液細(xì)胞開(kāi)始為囊狀，隨后發(fā)育成梨狀，最終發(fā)育為杯狀。張建業(yè)等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍仔魚(yú)3日齡時(shí)口腔、食道出現(xiàn)黏液細(xì)胞，7日齡時(shí)消化道開(kāi)始出現(xiàn)黏液細(xì)胞，且黏液細(xì)胞的類(lèi)型按幼稚型到成熟型的規(guī)律發(fā)生，并認(rèn)為3～10日齡是泥鰍仔魚(yú)消化道發(fā)育的敏感期，20日齡左右消化道功能發(fā)育逐漸完善?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】除本課題組研究報(bào)道過(guò)四指馬鲅稚魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)消化道黏液細(xì)胞的組織化學(xué)（謝木嬌等，2015）外，至今未見(jiàn)有關(guān)四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞發(fā)育的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】針對(duì)仔魚(yú)在培育過(guò)程中呈現(xiàn)生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)，從功能細(xì)胞角度分析四指馬鲅仔魚(yú)消化機(jī)能的發(fā)育規(guī)律，為指導(dǎo)其育苗過(guò)程中適時(shí)更換餌料及制定投飼策略、完善育苗工藝和提高育苗成活率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 苗種來(lái)源

四指馬鲅受精卵和初孵仔魚(yú)由本課題組在南海水產(chǎn)研究所珠海試驗(yàn)基地培育獲得。仔魚(yú)先在室內(nèi)水泥池培育7 d后轉(zhuǎn)移到室外土池繼續(xù)培育，各階段培育條件：水溫29～32 ℃，鹽度25‰～28‰，溶氧4.80～5.50 mg/L，pH 8.00～8.30，氨氮含量0.20～0.40 mg/L，亞硝酸鹽含量0.005～0.015 mg/L。培育過(guò)程中仔魚(yú)餌料系列為輪蟲(chóng)、小球藻、枝角類(lèi)（2～15日齡）→鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體和部分紅蟲(chóng)（16～30日齡）→粉狀配合飼料和魚(yú)肉糜或貝肉糜（31～50日齡）。孵化后第1 d的仔魚(yú)為1日齡，以此類(lèi)推，培育過(guò)程中對(duì)1～30日齡的魚(yú)苗進(jìn)行連續(xù)采樣，每次取樣20尾用10%中性甲醛固定，期間定期更換固定液以延長(zhǎng)樣品的保存時(shí)間。

1. 2 樣品處理及分析方法

采集樣品中每個(gè)日齡段的仔魚(yú)取10尾進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作，切片用阿利新蘭—高碘酸雪夫試劑（AB-PAS）進(jìn)行染色（AB-PAS試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司），具體染色步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察拍照。根據(jù)AB-PAS顯色結(jié)果將黏液細(xì)胞分為I型、II型、III型和IV型，分別呈紅色（含PAS陽(yáng)性的中性黏多糖）、藍(lán)色（含AB陽(yáng)性的酸性黏多糖）、紫紅色（主要含PAS陽(yáng)性的中性黏多糖，同時(shí)含少量AB陽(yáng)性的酸性黏多糖）和藍(lán)紫色（主要含AB陽(yáng)性的酸性黏多糖，同時(shí)含少量PAS陽(yáng)性的中性黏多糖）。同時(shí)參照王永波等（2010）的方法統(tǒng)計(jì)消化道各段各類(lèi)型黏液細(xì)胞的密度、細(xì)胞長(zhǎng)短徑及消化道各段的分泌能力[單位面積黏液細(xì)胞密度與細(xì)胞表面積（π×長(zhǎng)徑×短徑/4）的乘積]，其中細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)樣本為消化道各段取3張相鄰切片隨機(jī)選10個(gè)視野，分別測(cè)量每個(gè)視野中1 mm2范圍內(nèi)各類(lèi)型黏液細(xì)胞的總數(shù)，同時(shí)測(cè)量黏液細(xì)胞（n=10）的長(zhǎng)徑和短徑。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黏液細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程

1～4日齡四指馬鲅仔魚(yú)消化道由簡(jiǎn)單的直線管發(fā)育到基本與外界連通狀態(tài)，包括食道、胃部和腸道基礎(chǔ)的分化，但黏膜上皮間未見(jiàn)有黏液細(xì)胞分布。5日齡仔魚(yú)食道形成1～2個(gè)黏膜皺褶，上皮基底層和中間層出現(xiàn)少量II型黏液細(xì)胞，均為圓形且被染成深藍(lán)色的細(xì)胞，胞質(zhì)均勻（圖1-1）；胃腸黏膜皺褶增多變扁平，其黏膜邊緣呈淡藍(lán)色，但仍未見(jiàn)有黏液細(xì)胞分布。9日齡仔魚(yú)食道黏液細(xì)胞仍是圓形的II型黏液細(xì)胞（圖1-2）；胃部呈Y形，賁門(mén)部、幽門(mén)部、胃體部和盲囊部呈明顯的區(qū)域分化，黏膜皺褶豐富，各區(qū)域大部分的黏膜表面被染成淺紅色，為含中性黏多糖的I型黏液細(xì)胞；腸道仍無(wú)前、中、后腸的分化，上皮間未見(jiàn)黏液細(xì)胞。15日齡仔魚(yú)胃部以I型黏液細(xì)胞為主，但在有胃腺分布的區(qū)域（除幽門(mén)部外）分布有藍(lán)色的II型黏液細(xì)胞（圖1-3），腸道前、中、后段也出現(xiàn)藍(lán)色的II型黏液細(xì)胞，且以圓形為主（圖1-4和圖1-5）。17日齡仔魚(yú)食道上皮分布有大量的II型黏液細(xì)胞，復(fù)層上皮因黏液細(xì)胞密集而被染成深藍(lán)色，部分細(xì)胞染色較淺呈空泡狀（圖1-6），胃部胃腺區(qū)域的II型黏液細(xì)胞數(shù)量增多，黏膜表層檢測(cè)出藍(lán)色（II型）和紅色（I型）交替的黏液細(xì)胞線，幽門(mén)盲囊區(qū)域形成4～6個(gè)管腔，均可檢測(cè)出II型黏液細(xì)胞（圖1-7）。23和30日齡仔魚(yú)消化道黏液細(xì)胞類(lèi)型維持不變，以II型為主，但數(shù)量持續(xù)增加（圖1-8～圖1-15）。

2. 2 消化道各段黏液細(xì)胞密度的變化

由表1可以看出，四指馬鲅消化道各段的黏液細(xì)胞密度隨日齡增加呈顯著的增加趨勢(shì)（P<0.05）。5日齡仔魚(yú)食道開(kāi)始分化出黏液細(xì)胞，密度為52.09±1.01個(gè)/mm2，發(fā)育至9、15、17、23、30日齡時(shí)分別為161.45±0.90、259.98±12.34、216.65±12.82、471.62±10.38和1489.49±8.45個(gè)/mm2；幽門(mén)盲囊黏液細(xì)胞發(fā)生時(shí)（17日齡）的密度為200.65±8.30個(gè)/mm2，23日齡時(shí)增加至590.38±2.91個(gè)/mm2，30日齡時(shí)達(dá)687.45±3.81個(gè)/mm2；腸道從15日齡起出現(xiàn)黏液細(xì)胞，密度為239.98±9.31個(gè)/mm2，至30日齡時(shí)達(dá)462.72±10.29個(gè)/mm2。

2. 3 消化道黏液細(xì)胞大小變化及各段的分泌能力

四指馬鲅消化道各段黏液細(xì)胞的大小也隨日齡的增加而增大，其中以食道黏液細(xì)胞大小增長(zhǎng)最明顯（表2）。黏液細(xì)胞大小與其密度的乘積可用于衡量消化道各段的黏液分泌能力，由表3可知，四指馬鲅消化道各段的黏液分泌能力亦隨日齡的增加而不斷提高，同日齡仔魚(yú)消化道中以食道的黏液分泌能力最強(qiáng)。

3 討論

3. 1 四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞發(fā)生的規(guī)律

黏液細(xì)胞的成分差異可反映魚(yú)類(lèi)發(fā)育階段（Leknes，2010，2011；辛儉等，2013）。四指馬鲅仔魚(yú)消化道最早（5日齡）在食道黏膜出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，而胃部最先（9日齡）出現(xiàn)I型黏液細(xì)胞，隨著日齡增加才逐漸出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，幽門(mén)盲囊在17日齡時(shí)可檢測(cè)到II型黏液細(xì)胞，腸道最先（15日齡）發(fā)育的是II型黏液細(xì)胞，同時(shí)含有少量I型黏液細(xì)胞，且消化道各段在30日齡時(shí)均未見(jiàn)III型和IV型黏液細(xì)胞。四指馬鲅的I型和II型黏液細(xì)胞均為幼稚型黏液細(xì)胞，僅含有單一種類(lèi)的黏多糖，與點(diǎn)帶石斑魚(yú)（李鑫煒等，2012）、泥鰍（張建業(yè)等，2014）的消化道黏液細(xì)胞發(fā)育特點(diǎn)相似，表明在魚(yú)類(lèi)的早期發(fā)育過(guò)程中，黏液細(xì)胞與消化道自身發(fā)育有緊密聯(lián)系，黏液細(xì)胞從幼稚型向成熟型轉(zhuǎn)變體現(xiàn)了消化道結(jié)構(gòu)從發(fā)生到成熟的變化過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅仔魚(yú)在不同日齡中消化道各段所含的黏液細(xì)胞總密度各不相同，分泌能力也存在日齡和部位的差異，即反映消化道各段在執(zhí)行消化吸收功能的地位，其中以食道在不同日齡中的黏液分泌能力最強(qiáng)，表明食道在協(xié)助食物消化吸收過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。大多數(shù)硬骨海水魚(yú)類(lèi)食道被覆復(fù)層的黏膜上皮并分布有大量黏液細(xì)胞（Díaz et al.，2008），由其分泌的黏液物質(zhì)在保護(hù)黏膜上皮免受機(jī)械損傷和細(xì)菌入侵及離子吸收等方面發(fā)揮作用（Díaz et al.，2006）。此外，四指馬鲅為肉食性魚(yú)類(lèi)，食道很短，借助其發(fā)達(dá)的肌肉層和黏膜層實(shí)現(xiàn)攝入足量食物進(jìn)行機(jī)械消化的目的，而豐富的黏液物質(zhì)有利于潤(rùn)滑食物使其快速往胃部推送。

3. 2 四指馬鲅消化道早期發(fā)育中黏液細(xì)胞的功能

四指馬鲅早期發(fā)育的消化道黏液細(xì)胞發(fā)育順序?yàn)镮I型→I型，其中II型黏液細(xì)胞在17日齡后整個(gè)消化道均有分布，尤其在食道和腸道分布較多，其分泌的酸性黏液物質(zhì)（主要含有酸性糖蛋白復(fù)合物）與含中性糖蛋白的黏液物質(zhì)不同，可增加表面黏液的黏性（Kumari et al.，2009），以此潤(rùn)滑食物（魚(yú)類(lèi)攝入的一些軟體動(dòng)物、甲殼類(lèi)小型魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)等）并保護(hù)黏膜表面，還起到協(xié)助機(jī)體對(duì)食物的轉(zhuǎn)運(yùn)和吞咽作用，而且腸道是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及清除有害微生物的場(chǎng)所，富含的II型黏液細(xì)胞可能與刺激黏膜免疫發(fā)生有關(guān)（Khojasteh et al.，2009）。本研究中，5日齡四指馬鲅仔魚(yú)食道開(kāi)始出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，隨著日齡的增加，消化道II型黏液細(xì)胞數(shù)量呈明顯的增加趨勢(shì)，但未見(jiàn)其他類(lèi)型（III型、IV型）黏液細(xì)胞，故推測(cè)II型黏液細(xì)胞在仔魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中維持機(jī)體正常消化功能和形成一定黏膜免疫能力方面占主導(dǎo)地位。四指馬鲅仔魚(yú)在3日齡時(shí)開(kāi)口，體內(nèi)消化道與外界連通，消化道具備簡(jiǎn)單的攝食和消化能力，但尚未分化完備的消化器官，隨著營(yíng)養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變?yōu)橥庠葱誀I(yíng)養(yǎng)，攝食同時(shí)也增加了有害微生物入侵的機(jī)會(huì)，分泌酸性黏液物質(zhì)的II型黏液細(xì)胞在一定程度上能協(xié)助食物消化吸收及提高機(jī)體抵御不良環(huán)境的能力；四指馬鲅腸道從15日齡開(kāi)始分化出II型黏液細(xì)胞和少量I型黏液細(xì)胞，其中I型黏液細(xì)胞分泌的中性黏多糖常與堿性磷酸酶共存，有利于乳化食物，且中性黏液物質(zhì)可作為酶解食物過(guò)程中的必需輔助因子（Carrassón et al.，2006），表現(xiàn)為吸收功能與防御能力相協(xié)調(diào)。四指馬鲅從9日齡起胃部黏膜開(kāi)始出現(xiàn)I型黏液細(xì)胞，且數(shù)量隨日齡的增加而增加，營(yíng)造出中性黏液環(huán)境以利于食物的快速消化，與平鯛（Rhabdosargus sarba）（勾效偉等，2008）、黃鰭鯛（Sparus latus）（王永翠等，2012）、黃斑籃子魚(yú)（Siganus oramin）（區(qū)又君等，2013）的研究結(jié)果相似。

3. 3 研究黏液細(xì)胞發(fā)育對(duì)育苗的指導(dǎo)意義

在仔魚(yú)培育過(guò)程中，選擇適口餌料與及時(shí)更換餌料并制定投餌策略是提高育苗成活率的關(guān)鍵措施之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，黏液細(xì)胞的出現(xiàn)與仔稚魚(yú)開(kāi)口日齡具有一致性，且黏液細(xì)胞的存在可能是仔魚(yú)開(kāi)口的前提（李鑫煒等，2012）。張建業(yè)等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍在開(kāi)口時(shí)（3日齡）口咽腔即出現(xiàn)酸性黏液細(xì)胞，且其分泌的黏液物質(zhì)在仔魚(yú)進(jìn)入外源性營(yíng)養(yǎng)期間對(duì)食物的消化起主要作用。但本研究發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅仔魚(yú)的開(kāi)口日齡（3日齡）與黏液細(xì)胞發(fā)生日齡（5日齡）并不一致，可能與種屬特異性、培育環(huán)境及仔魚(yú)營(yíng)養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變有關(guān)，仔魚(yú)開(kāi)口前由卵黃囊提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)期，開(kāi)口攝食后由于消化道發(fā)育尚不完善，并未直接進(jìn)入完全外源營(yíng)養(yǎng)階段，而是經(jīng)歷短暫的混合營(yíng)養(yǎng)期，此期間（3～5日齡）尚未分化出黏液細(xì)胞，表明此階段仔魚(yú)體內(nèi)執(zhí)行消化功能的并非黏液細(xì)胞分泌的黏液物質(zhì)。至5日齡時(shí)卵黃囊吸收完畢，消化道結(jié)構(gòu)得到發(fā)育的同時(shí)出現(xiàn)黏液細(xì)胞，消化機(jī)能進(jìn)一步提高，使得仔魚(yú)具備獨(dú)立攝食、消化和吸收的能力，進(jìn)入完全外源性營(yíng)養(yǎng)期成為可能。值得注意的是，雖然仔魚(yú)在5日齡時(shí)出現(xiàn)黏液細(xì)胞，但分泌黏液物質(zhì)單一且量不多，消化吸收能力較差且應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的能力較低，極易感染疾病，因此，此階段除了要保證餌料充足外，還應(yīng)加強(qiáng)仔魚(yú)培育的日常管理。

4 結(jié)論

四指馬鲅消化道內(nèi)黏液細(xì)胞按食道、胃部、腸道、幽門(mén)盲囊的次序發(fā)生，其類(lèi)型從II型→I型的順序出現(xiàn)，且不同部位黏液細(xì)胞密度、大小及分泌能力均隨日齡的增加而增加，黏液細(xì)胞這種發(fā)生和分布的特征與仔魚(yú)攝食能力日益增強(qiáng)及消化道結(jié)構(gòu)逐漸完善的趨勢(shì)相適應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）