大葉千斤拔活性成分分布及積累動(dòng)態(tài)

牛迎鳳等

[摘要] 目的 考察染料木苷、染料木素及大豆苷元在大葉千斤拔植株不同部位分布與積累的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。 方法 利用高效液相色譜法，采用C18反相色譜柱，柱溫為35℃，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（48∶52，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，測(cè)定和比較不同采收期大葉千斤拔根、莖、葉中染料木苷、染料木素和大豆苷元的含量以及不同生長(zhǎng)年限的大葉千斤拔根中三種成分的含量。 結(jié)果 染料木苷、染料木素和大豆苷元主要分布于大葉千斤拔根中，且在10月份積累量最高，2月份積累量最低；6.5～7.5年生大葉千斤拔根中這三種成分的含量最高，但從種植成本考慮，3.5年采收比較合適。 結(jié)論 根據(jù)大葉千斤拔中活性成分的分布與積累規(guī)律，發(fā)現(xiàn)大葉千斤拔的最佳采收期為10月份，最佳采收年限為三年半，最佳藥用部位為根。

[關(guān)鍵詞] 大葉千斤拔；染料木素；染料木苷；大豆苷元；分布；積累動(dòng)態(tài)

[中圖分類號(hào)] R282.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）10（a）-0017-04

Distribution and accumulative dynamic variation of bioactive components in Moghania macrophylla

NIU Yingfeng LI Xiaohua LI Haitao ZHANG Zhonglian GUAN Yanhong ZHANG Lixia▲

Key Laboratory of Dai and Southern Medicine of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture， Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Yunnan Province， Jinghong 666100， China

[Abstract] Objective To investigate the content and dynamic distribution of three active ingredients include genistein， genistin and daidzin in Moghania macrophylla. Methods The HPLC method was adopted， the chromatograph column was C18 spincolumn and the column temperature was 35℃， the mobile phase was methanol-0.1% phosphoric acid （48∶52， V/V）， and the detection wavelength was 250 nm. The content of genistin， genistein and isoflavoues aglycone in the root， steem and leaf of Moghania macrophylla which harvested in different periods were determinated， the content of the three active ingredients in the root of Moghania macrophylla which harvested in different year were determinated. Results The three active ingredients were mainly distributed in the root of Moghania macrophylla， the accumulation content of the three active ingredients were the highest in October and lowest in February， for different growth ages， the contents of the three active ingredients were the highest in the root of Moghania macrophylla which were 6.5-7.5 years old， but the 3.5 years old Moghania macrophylla was more appropriate for harvest when considering the plant cost. Conclusion According to the distribution and accumulative dynamic variation of bioactive components in Moghania macrophylla， the optimal harvest time is October， the best growth age is 6.5 years old and the best medicinal part is the root.

[Key words] Moghania macrophylla； Genistein； Genistin； Isoflavoues aglycone； Distribution； Dynamic accumulation

千斤拔作為我國(guó)傳統(tǒng)的重要中藥之一[1]，是豆科植物大葉千斤拔[M. macrophylla（Willd.） O. Kuntze]、蔓性千斤拔[M. philippinensis（Merr. et Rolfe）Li.]及繡毛千斤拔[M. ferruginea （Wall. ex Benth.）Li.]的干燥根[2-4]，具有祛風(fēng)除濕，舒筋活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、消炎止痛、活血解毒等功效[5-7]，臨床上常用于治療風(fēng)濕骨痛、腰肌勞損、氣虛腳腫、勞傷久咳、咽喉腫痛等[8-9]，具有較高的藥用和食用價(jià)值。千斤拔屬植物主要分布于我國(guó)云南、貴州、廣東、廣西等南方省區(qū)，是西雙版納傣族民間和傣醫(yī)臨床上的傳統(tǒng)傣藥材[10]。因其重要的藥用價(jià)值及較大的市場(chǎng)需求，導(dǎo)致野生藥材資源逐漸匱乏，目前臨床使用的千斤拔類藥材主要以種植為主，而云南省內(nèi)種植最多的則是大葉千斤拔。因此本研究以大葉千斤拔為材料，對(duì)其有效成分在不同藥材部位的分布規(guī)律及不同生長(zhǎng)年限與采集月份的積累動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究。

前人通過化學(xué)成分預(yù)分析推測(cè)，大葉千斤拔的主要成分包括糖類、苷類、黃酮類、鞣質(zhì)、酚類、氨基酸、甾體、皂苷、有機(jī)酸、生物堿、揮發(fā)油、蒽醌類化合物等[11-12]。作為蝶形花科植物，異黃酮類化合物在千斤拔類藥材中的含量非常豐富[13]，且是其藥材的主要化學(xué)成分，而染料木素則是其異黃酮類化合物中含量最高的成分[14-16]，也是大葉千斤拔中活性最高的化合物[17]。根據(jù)近年來的相關(guān)研究報(bào)道，染料木素可防治一系列常見疾病，包括：前列腺癌、乳腺癌、婦女更年期綜合征及心腦血管疾病[18]，這與千斤拔藥材的藥效極為一致，因此可推測(cè)染料木素與其異黃酮類化合物應(yīng)是大葉千斤拔藥材的主要藥效成分。然而，異黃酮類成分的積累動(dòng)態(tài)及其在大葉千斤拔體內(nèi)的分布狀況尚不明確。本研究對(duì)大葉千斤拔中異黃酮類物質(zhì)在不同生長(zhǎng)期及不同生長(zhǎng)年限的積累動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)異黃酮類物質(zhì)在大葉千斤拔葉、莖、根幾個(gè)不同部位的分布進(jìn)行了分析，以期為大葉千斤拔藥材原料質(zhì)量的穩(wěn)定控制提供參考，同時(shí)對(duì)云南種植的大葉千斤拔合理采收及進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

分別在2014年8、10、12月，2015年2、4、6月這6個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期，采收西雙版納州勐海縣試驗(yàn)田種植的3～4年生大葉千斤拔6批，每批10株，每批樣品又分為根、莖、葉三份。

2015年12月，分別采集西雙版納州勐?？h試驗(yàn)田種植的1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5年生的大葉千斤拔共7批樣品，每批樣品10株，取根備用。

所采樣品經(jīng)張麗霞副研究員鑒定為豆科植物大葉千斤拔[M. macrophylla （Willd.） O. Kuntze]的全株。

1.2 儀器和試劑

Waters 600型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），PL203電子天平（美國(guó)Mettler Toledo公司，感量：0.001 g），AB135-S電子天平（美國(guó)Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg）。

染料木苷、染料木素和大豆苷元對(duì)照品購自廣州泛宏貿(mào)易有限公司，含量為98%；

無水乙醇為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水（經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取對(duì)照品染料木苷1.01 mg，大豆苷元1.05 mg，染料木素1.18 mg，用甲醇配制成儲(chǔ)備溶液，濃度分別為1.01、1.05、1.18 mg/mL。使用時(shí)，再根據(jù)需要稀釋成相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液。

1.4 樣品溶液的制備

大葉千斤拔樣品晾干后，粉碎過60目篩，取樣品粉末，精密稱定3份，每份5 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入100 mL 80%乙醇，稱定并記錄重量。80℃的溫度下，水浴回流法提取3.5 h，靜置至室溫，再稱定重量，用提取溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.5 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇和0.1%磷酸水溶液的比例為48∶52（V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量為20 μL。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取儲(chǔ)備對(duì)照品溶液，配制成染料木素0.0059 mg/mL，染料木苷0.0505 mg/mL，大豆苷元0.000 525 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1和染料木素0.0472 mg/mL，染料木苷0.126 mg/mL，大豆苷元0.002 63 mg/mL的混合對(duì)照品溶液2。取1號(hào)和2號(hào)混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣18、14、10、6、2 μL，測(cè)得各峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），繪制得到兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 精密度試驗(yàn) 按照樣品溶液制備方法，制備一份樣品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定三種活性成分峰面積。染料木苷、染料木素和大豆苷元的峰面積RSD分別為1.42%、1.28%、1.65%，表明精密度良好。

1.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照樣品溶液制備方法，制備一份樣品溶液，在上述色譜條件下，每隔2 h測(cè)定一次，結(jié)果表明三種活性成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。染料木苷、染料木素和大豆苷元的峰面積RSD分別為1.26%、1.49%、2.03%。

1.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大葉千斤拔樣品粉末，平行6次取樣，制備樣品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定三種活性成分的峰面積。染料木苷、染料木素和大豆苷元的峰面積RSD分別為3.45%、2.81%、3.02%，表明重復(fù)性良好。

1.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密配制染料木苷對(duì)照品溶液（1.33 mg/mL），染料木素對(duì)照品溶液（1.04 mg/mL）和大豆苷元對(duì)照品溶液（0.00715 mg/mL）。采取加樣回收法，平行稱取已知含量的樣品粉末9份，分為3組，每份樣品2.5 g。分別向3組樣品中精密加入對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，然后制備樣品溶液。在上述色譜條件下，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各色譜峰峰面積，染料木苷、染料木素和大豆苷元回收率的RSD均小于2%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2 結(jié)果

2.1 不同生長(zhǎng)期樣品測(cè)定結(jié)果

精密稱取不同生長(zhǎng)期的樣品粉末各5 g，按樣品溶液制備項(xiàng)方法制備樣品溶液，平行測(cè)定3次，結(jié)果見表3。以不同生長(zhǎng)期為橫坐標(biāo)，三種異黃酮成分的含量總和為縱坐標(biāo)作圖。見圖1。

由圖1可以看出，不同生長(zhǎng)期的大葉千斤拔中三種異黃酮類化合物的含量差異不大，總體來看，10月份的含量最高，8月和12月次之。大葉千斤拔不同部位中三種異黃酮類化合物的含量差異較大，根中異黃酮類成分的含量明顯高于莖和葉。

2.2 不同生長(zhǎng)年限樣品測(cè)定結(jié)果

精密稱取不同生產(chǎn)年限大葉千斤拔的根粉末各5 g，按樣品溶液制備項(xiàng)方法制備樣品溶液，平行測(cè)定3次，結(jié)果見表4。因大豆苷元只在6.5年的大葉千斤拔根中測(cè)得，故不作考慮。以不同生長(zhǎng)年限為橫坐標(biāo)，染料木苷和染料木素的含量為縱坐標(biāo)作圖。

從圖2可以看出，不同生長(zhǎng)年限的大葉千斤拔中染料木素和染料木苷的含量發(fā)生明顯變化。染料木苷和染料木素的含量前3年緩慢增加，第4年稍有回落，第5年之后又逐步增長(zhǎng)。

3 討論

本研究首次系統(tǒng)研究了大葉千斤拔中異黃酮類成分的周年積累規(guī)律，根據(jù)本研究可以初步推斷，大葉千斤拔目前采用的8～10月的采收時(shí)間較為合理，其中10月最為理想。此外，12月也可進(jìn)行采收。

本研究對(duì)大葉千斤拔中異黃酮類成分在不同植株部位的分布規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)大葉千斤拔的傳統(tǒng)藥用部位選用根是比較合理的，盡管其莖和葉中也有一定量的異黃酮類化合物，但是含量較低，不建議替代根入藥，但可考慮用作飼料或其他用途。

對(duì)1.5～7.5年生不同生產(chǎn)年限的大葉千斤拔根中染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量測(cè)定和分析發(fā)現(xiàn)，6.5～7.5年生大葉千斤拔根中上述三種活性成分的含量最高，但總體而言3.5年采收較為適宜，此時(shí)采收既不會(huì)造成過高的種植和管理成本，又可保證藥材中有較高的異黃酮類活性成分含量。

目前，千斤拔類藥材被廣泛用于婦科、風(fēng)濕痹痛等類型的中成藥生產(chǎn)，如金雞膠囊、補(bǔ)血調(diào)經(jīng)片、婦科千金片、壯腰健腎丸和千斤拔飲等中成藥[10]，對(duì)治療乳房疾病、跌打損傷、婦科病、慢性腎炎、牙痛、食欲不振和病后氣虛均有良好效果[20]；此外，對(duì)急性乳腺炎、白細(xì)胞減少癥及軟組織損傷及感染，千斤拔的治療效果也較佳[21]；并且，我國(guó)民間及中醫(yī)臨床有采用千斤拔治療各類疾病的有效單驗(yàn)方，包括毒蛇咬傷、各種腫毒、急性咽喉炎、風(fēng)濕骨疼、產(chǎn)后關(guān)節(jié)疼痛及婦女白帶過多等，均有較好的療效[22]，說明千斤拔類藥材的用途極其廣泛，市場(chǎng)對(duì)千斤拔類藥材的需要將持續(xù)旺盛。因此，今后應(yīng)對(duì)其進(jìn)行全面深入研究，以保障千斤拔類藥材原料質(zhì)量的可靠性和可控性，促進(jìn)千斤拔類藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳鵬，李敏，秦海洸.千斤拔藥材質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2016，51（8）：601-606.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].四部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：418.

[3] 林麗珍，劉夢(mèng)楚，馬鴻雁，等.蔓性千斤拔與大葉千斤拔的鑒別研究[J].中藥材，2015，38（7）：1417-1421.

[4] 張忠廉，宋美芳，李海濤，等.千斤拔屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究[J].中草藥，2015，46（1）：118-122.

[5] 宋立人，洪恂，丁續(xù)亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典（上）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：195.

[6] 吳征鎰.新華本草綱要[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991：1.

[7] 陳一，李開雙，黃鳳嬌.千斤拔的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[J].廣西醫(yī)學(xué)，1993，15（2）：77-79.

[8] 喬雪，卓燊，楊子明，等.千斤拔屬植物化學(xué)成分及藥理作用的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2016，8（12）：1546-1550.

[9] 禹建春，孫捷，徐冠，等.重用千斤拔治療脾腎氣虛型痛風(fēng)性腎病60例[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2015，22（4）：407-407.

[10] 管燕紅，曾君，張麗霞.千斤拔制劑研究概況及在傣醫(yī)中的應(yīng)用[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2008（10）：39-40.

[11] 黃艷菲，丁玲，李艷丹，等.三種千斤拔的化學(xué)成分預(yù)分析和薄層鑒定[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，37（4）：604-606.

[12] 姜建萍，陳明偉，張翰，等.大葉千斤拔水分、灰分及其浸出物的含量測(cè)定[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，18（1）：51-52.

[13] 黃建猷，盧文杰，譚曉，等.壯藥大葉千斤拔化學(xué)成分的研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，21（5）：48-49.

[14] 孫琳，李占林，韓國(guó)華，等.千斤拔化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2009，19（5）：364-367.

[15] 李寶強(qiáng)，宋啟示.大葉千斤拔根的化學(xué)成分[J].中草藥，2009，40（2）：179-182.

[16] 牛迎鳳，張忠廉，李海濤，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化大葉千斤拔中染料木素提取工藝[J].中藥材，2013，36（10）： 1689-1693.

[17] 蔡錦源，周小雷，熊建文，等.均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用優(yōu)選大葉千斤拔的微波輔助提取工藝研究[J].應(yīng)用化工， 2016，45（3）：402-405.

[18] Dixon RA，F(xiàn)erreira D. Genistein [J]. Phytochemistry，2002， 60（3）：205-211.

[19] 張瀚，袁經(jīng)權(quán)，周小雷，等.大葉千斤拔現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2013，27（3）：81-84.

[20] 陳元，楊世丁.千斤拔的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2001（6）：363.

[21] 容小翔.千斤拔療效佳[J].農(nóng)村新技術(shù)，1996（3）：64.

[22] 孟慶榮.千斤拔壯腰健腎[J].醫(yī)藥與保健，1998（3）：52.

（收稿日期：2016-06-20 本文編輯：趙魯楓）