小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育—恢復近等基因系的構(gòu)建及其遺傳背景檢測

牛娜 馬守才 王軍衛(wèi) 宋瑜龍 張改生

摘要：【目的】構(gòu)建小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育—恢復近等基因系，為進一步探索小麥雄性不育機理及對不育及恢復基因的精細定位和圖位克隆提供參考。【方法】利用黏型小麥雄性不育系Ms（Kost）-5-1為母本與恢復系RK5451雜交獲得F1代，以Ms（Kost）-5-1為輪回親本與F1代及回交后代中的可育株連續(xù)回交6～7代構(gòu)建黏型小麥核質(zhì)互作雄性不育—恢復近等基因系；利用SSR標記、醇溶蛋白的A-PAGE與田間農(nóng)藝性狀相結(jié)合的方法對所構(gòu)建的近等基因系進行檢測?！窘Y(jié)果】定向快速獲得16個小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育—恢復近等基因系（N2～N17）。SSR分子標記及A-PAGE檢測結(jié)果表明，各近等基因系遺傳背景與恢復系RK5451的差異較明顯，而與不育系Ms（Kost）-5-1遺傳背景趨近相同，N4、N10、N11和N16保留了較好育性恢復性。農(nóng)藝性狀差異及聚類分析結(jié)果表明，各近等基因系僅在株高上呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）差異，大多數(shù)農(nóng)藝性狀具有較高的相似性，N2、N3、N10、N16與不育系Ms（Kost）-5-1農(nóng)藝性狀差異最小?！窘Y(jié)論】N10和N16為不育系Ms（Kost）-5-1較好的近等基因系，可用于進一步基因精細定位和圖位克隆。

關(guān)鍵詞： 小麥；雄性不育；近等基因系；恢復基因；分子標記

中圖分類號： S512.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1254-07

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to construct nucleo-cytoplasmic male sterility-restorer near-isogenic lines（NILs） of wheat with Ae. kotschyi cytoplasm， in order to provide reference for further researching mechanism of male sterile， mapping restorer gene and mapping-based cloning. 【Method】A male sterile line Ms（Kost）-5-1 was used as the recurrent parent to cross with restorer RK5451 and their F1， and backcross with fertile plants of their offspring for 6-7 generations to develop NILs of wheat with Ae. kotschyi cytoplasm. The SSR molecular markers， polyacrylamide gel electrophoresis（A-PAGE） methods combined with the agronomy traits were used to evaluate reliability of obtained NILs. 【Result】A total of 16 nucleo-cytoplasmic male sterility-restorer NILs（N2-N17） were obtained fast and accurately. The SSR molecular markers and A-PAGE showed that， the genetic background of all NILs were obviously different from restorer line RK5451， but extremely similar with sterile line Ms（Kost）-5-1. N4， N10， N11 and N16 retained ability to restore fertility. Furthermore， the agronomy traits difference and clustering analysis showed that， there were significant（P<0.05） or extremely significant difference（P<0.01） in plant height between every two NILs， and there was high genetic similarity in most of agronomic traits between every two NILs. However， the agronomic traits of N2， N3， N10 and N16 were the most different from sterile line Ms（Kost）-5-1. 【Conclusion】N10 and N16 are perfect NILs of restorer gene， and can be used to gene fine mapping and mapping-based cloning.

Key words： wheat； male sterile； near-isogenic line； restorer gene； molecular marker

0 引言

【研究意義】雄性不育廣泛存在于生物界，主要表現(xiàn)為雌蕊發(fā)育正常，而雄花敗育、無受精能力。自1951年首次報道小麥雄性不育以來，先后研究獲得提莫菲維（Triticum timopheevi）細胞質(zhì)的小麥提型雄性不育系和黏果山羊草（Aegilops kotschyi）細胞質(zhì)的小麥黏型雄性不育系（Kihara，1951；Wilson and Ross，1962）。由于小麥提型雄性不育系具有不良的細胞質(zhì)效應，如種子皺縮、發(fā)芽率低、穗易發(fā)芽等，且恢復源狹窄，群體優(yōu)勢較弱，不宜在生產(chǎn)中大面積推廣應用（Kaul， 1988）；而小麥黏型雄性不育系易保持、易恢復，且無不良細胞質(zhì)效應，具有良好應用前景（張改生等，1989， 1994，1996；牛娜等，2003）。因此，構(gòu)建高質(zhì)量的黏型雄性不育—恢復近等基因系（Near-isogonic line，NIL），開發(fā)其優(yōu)良恢復基因，培育強恢復系，對探索小麥雄性不育、育性恢復機制及分子標記輔助育種均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近等基因系是經(jīng)過連續(xù)回交獲得的除控制目標性狀基因不同而其他遺傳背景均相同的一系列遺傳材料（或品系）。近年來，隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已廣泛應用于近等基因系遺傳背景的檢測中（劉立科，2006；劉雅輝等，2008；徐美紅等，2008；龍衛(wèi)華等，2011；趙興華等，2011），并成功構(gòu)建了油菜、玉米、水稻、小麥、大豆等作物的近等基因系（王際鳳和陸作楣，2008；李希鋒和董娜，2012）。由于小麥雄性不育—恢復近等基因系的遺傳背景極其相似，僅在育性上存在差異而日益受到關(guān)注，但成功構(gòu)建近等基因系的報道較少。劉立科等（2006）構(gòu)建了D2型小麥雄性不育近等基因系，并利用SSR分子標記對其遺傳背景進行檢測。許蘭杰等（2009）構(gòu)建了黏型小麥雄性不育近等基因系，通過調(diào)查農(nóng)藝性狀對其進行評價。鄭宏遠（2014）構(gòu)建了以豫麥三號為遺傳背景的黏型雄性不育系，并利用SSR標記對其遺傳背景進行檢測?！颈狙芯壳腥朦c】RK5451是小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育系的一個優(yōu)良恢復系（恢復度>90%），為了進一步研究其恢復基因，須構(gòu)建其高質(zhì)量的近等基因系，并進行遺傳背景檢測。但目前成功構(gòu)建小麥雄性不育—恢復近等基因系的報道較少，且構(gòu)建后僅單獨利用農(nóng)藝性狀或分子標記進行評價，鮮見有農(nóng)藝性狀與分子標記及生化標記相結(jié)合對黏型小麥近等基因系的遺傳背景進行檢測的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用連續(xù)回交的方法，以小麥黏型雄性不育系Ms（Kost）-5-1為母本與恢復系RK5451雜交獲得F1代，再以Ms（Kost）-5-1為輪回親本與F1代及回交后代中的可育株連續(xù)回交6～7代，構(gòu)建除育性差異外其他農(nóng)藝性狀均相似的小麥黏型雄性不育—恢復近等基因系，最后利用SSR標記、醇溶蛋白的A-PAGE與田間農(nóng)藝性狀相結(jié)合的方法對構(gòu)建的近等基因系進行檢測，為小麥雄性不育機理的研究、不育基因與恢復基因的精細定位和圖位克隆打下重要基礎(chǔ)，并促進小麥雜種優(yōu)勢利用三系途徑的應用。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育系Ms（Kost）-5-1、高恢復力的恢復系RK5451（測交恢復度在90%以上）由西北農(nóng)林科技大學作物雜種優(yōu)勢研究與利用課題組保存提供。田間試驗在西北農(nóng)林科技大學試驗田和國家小麥改良中心溫室進行。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 近等基因系構(gòu)建 利用系譜法與輪回選擇相結(jié)合的方法（圖1），以小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育系Ms（Kost）-5-1為母本與恢復系RK5451雜交得到F1代，再以不育系Ms（Kost）-5-1為輪回親本與F1代回交?；亟缓蟠N植于試驗田，在花發(fā)育的三核期，分別取回交后代植株的成熟花粉粒，用18%蔗糖+9% PEG- 4000+2 g/L Ca（NO3）2·4H2O+60 mg/L H3BO3的培養(yǎng)基置于28 ℃下培養(yǎng)50 min，計算花粉的萌發(fā)率，鑒定其育性，篩選出萌發(fā)率大于50%的單株為父本，與不育系Ms（Kost）-5-1回交，定向回交6～7代，獲得小麥黏型核質(zhì)互作雄性不育—恢復近等基因系。

1. 2. 2 近等基因系及親本材料的育性恢復性檢測 在小麥揚花期對不育系Ms（Kost）-5-1、恢復系RK5451及各近等基因系隨機選取5株主莖穗套袋，于成熟期調(diào)查其自交結(jié)實率。

1. 2. 3 DNA提取與SSR分子標記檢測 利用CTAB法提取近等基因系株系及親本材料的基因組DNA，從GrainGenes網(wǎng)站（http：//wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/grain-

genes/browse.cgi？class=marker）選取180對SSR引物，對2個親本材料進行擴增，計算多態(tài)性比率。挑選出在親本間均有多態(tài)性并位于1B染色體上的33對引物（表1）進行SSR擴增，擴增程序參照許蘭杰等（2009），擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，對電泳結(jié)果進行統(tǒng)計分析。與不育系Ms（Kost）-5-1有相同條帶的記為0，兼有不育系Ms（Kost）-5-1與恢復系RK5451記為1，遺傳相似系數(shù)（GS）的計算參照申時全等（2004）的方法，計算公式為：

GS=■

式中，Ni為與不育系Ms（Kost）-5-1相同的條帶數(shù)，Nj為與恢復系RK5451相同的條帶數(shù)，Nij為2個材料共顯性的條帶數(shù)，利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，并根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果進行聚類分析。

1. 2. 4 近等基因系醇溶蛋白的A-PAGE分析 取單粒種子在研缽中磨成粉末狀，裝入離心管，加提取液（0.05%甲基綠，25% 2-氯乙醇）。凝膠溶液含：10% Acr，0.5% Bis，6%尿素，0.005%硫酸亞鐵，0.1%Vc，0.1% Gly，2%醋酸；采用改進的ISTA聚丙烯酰胺凝膠電泳（pH 3.2）標準程序進行分析（馬守才等，2007）。

1. 2. 5 近等基因系的農(nóng)藝性狀調(diào)查 根據(jù)回交后代材料（BC6F1）的田間性狀變異和育性基因情況，以不育系Ms（Kost）-5-1為對照，選取其中的近等基因系材料（編號N2～N17）進行調(diào)查。每個近等基因系株系均勻隨機選取5株，測量其育性恢復性及其他農(nóng)藝性狀，包括小穗數(shù)、株高、穗長、穗脖長、旗葉長、旗葉寬、倒二葉長、倒一節(jié)長等，并進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 近等基因系構(gòu)建及其親本材料的育性恢復性分析

將不育系Ms（Kost）-5-1與恢復系雄性RK5451經(jīng)大田雜交和溫室加代回交，成功獲得16個雄性不育—恢復近等基因系（編號N2～N17）。由表2可知，各近等基因系已完全獲得恢復系RK5451的恢復基因，在黏果山羊草背景下，各近等基因系具有較高的恢復力，但其恢復度仍存在一定程度的變異，最低的恢復度為70.9%，最高的為92.0%。各近等基因系除了育性與不育系Ms（Kost）-5-1截然不同外，其他遺傳背景均相似，仍需進一步檢測分析。

2. 2 近等基因系遺傳背景的SSR檢測與評價

選取180對SSR引物對2個親本材料進行擴增，其中75對引物能擴增出2個親本材料間多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達41.7%。用這75對引物對2個親本材料及近等基因系進行擴增，發(fā)現(xiàn)其中50對引物擴增產(chǎn)物在各近等基因系與恢復系RK5451間存在明顯差異，但在各近等基因系材料與不育系Ms（Kost）-5-1間無明顯差異（圖2所示部分引物檢測結(jié)果），表明構(gòu)建的近等基因系其遺傳背景與不育系已趨于一致。另外，在親本間有多態(tài)性的75對引物中33對定位于1B染色體上，其余引物分布在其他染色體上，平均每條染色體上分布至少2對引物。由于育性恢復基因已被定位于1B染色體上，因此檢測結(jié)果更能體現(xiàn)除育性等位基因差異外，1B染色體遺傳背景的一致性。由表3可知，16個雄性不育—恢復近等基因系材料和不育系Ms（Kost）-5-1遺傳相似度均高于78.0%，而與恢復系RK5451的遺傳相似度均低于21.0%，表明通過與不育系Ms（Kost）-5-1多代回交，各近等基因系的遺傳背景基本上與不育系趨于一致，而與恢復系PK5451的差別較明顯。

聚類分析結(jié)果見圖3，當歐氏距離為7.0時，供試材料被聚為五大類，第I類包括2個系，平均的遺傳相似系數(shù)分別為84.9%；第II類包括5個系，其平均遺傳相似系數(shù)為87.8%；第Ⅲ類包括4個系，平均遺傳系數(shù)為90.8%；第Ⅳ類包括3個系，并與不育系Ms（Kost）-5-1歸為一類，其平均遺傳相似系數(shù)為94.3%；第V類包括2個系，其平均遺傳系數(shù)最小為79.9%。綜合分析發(fā)現(xiàn)N5、N6及N17與不育系Ms（Kost）-5-1具有較好的近等性，其遺傳相似系數(shù)分別為0.9500、0.9400和0.9345，其次是第Ⅲ類N4、N10、N11和N16，雖然不與不育系Ms（Kost）-5-1聚為一類，但與其遺傳相似系數(shù)均超過90.0%。上述結(jié)果與表1中育性恢復性相比較發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與育性恢復性的高低也具有很強的對應性，第I類育性恢復性主要集中在75.0%～80.0%，第II類主要集中在80.0%～85.0%，第Ⅲ類主要集中在85.0%～90.0%，第Ⅳ類主要集中在90.0%～95.0%，最低的是第V類育性恢復性集中在70.0%～75.0%。

綜合分析SSR分子標記擴增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第Ⅲ類（包括N4、N10、N11和N16）不僅與不育系Ms（Kost）-5-1具有較高的遺傳相似性，與其他類別相比，還具有最高的育性恢復性，表明這一類近等基因系在保留了較好育性恢復性的基礎(chǔ)上，遺傳基礎(chǔ)又與輪回親本不育系Ms（Kost）-5-1相似性極高，是較理想的近等基因系候選系。

2. 3 近等基因系醇溶蛋白譜帶間的比較

基于SSR分析，以中國春兩個重復（CS1、CS2）為對照，對第Ⅲ類群（N4、N10、N11和N16）及不育系Ms（Kost）-5-1、恢復系RK5451，進行醇溶蛋白A-PAGE分析，各設(shè)2個重復，共14個材料，電泳圖譜結(jié)果如圖4所示，每個材料均可分離出16～18條譜帶，其中9條（約占50%）為14個供試材料的共有譜帶，其他為供試材料的多態(tài)性譜帶。經(jīng)供試材料的譜帶差異分析，發(fā)現(xiàn)共有5種帶型，其中不育系Ms（Kost）-5-1和4個近等基因系帶型基本一致，表明這4個供試近等基因系醇溶蛋白編碼的基因位點與不育系一致，已達到純合。

2. 4 各近等基因系與不育系Ms（Kost）-5-1農(nóng)藝性狀的差異及聚類分析

對近等基因系與不育系Ms（Kost）-5-1的農(nóng)藝性狀進行t 檢驗。由表4可知，各近等基因系與不育系Ms（Kost）-5-1相比，全部材料均在株高上呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01，下同）差異；N13在旗葉寬上呈極顯著差異；N12、N15、N16和N17在穗脖長上呈極顯著差異，N9、N13和N14在穗長上呈極顯著差異。而其他性狀如旗葉長、倒二葉長、倒一節(jié)長及小穗數(shù)等性狀上與不育系Ms（Kost）-5-1并無顯著差異（P>0.05）。

利用SPSS 19.0對構(gòu)建的16個近等基因系和不育系Ms（Kost）-5-1農(nóng)藝性狀進行聚類分析，結(jié)果見圖5。在歐氏距離12.0處，將17個材料聚為五大類，其中第Ⅳ組包括N2、N3、N10、N16等4個近等基因系和不育系Ms（Kost）-5-1，其旗葉寬、旗葉長、倒二葉長、穗脖長、倒一節(jié)長、穗長、小穗數(shù)等農(nóng)藝性狀與不育系Ms（Kost）-5-1基本一致，僅在株高上存在差異，表明16個近等基因系材料與輪回親本的遺傳背景非常相近。

與SSR分子標記聚類分析結(jié)果比較，不育系Ms（Kost）-5-1均被聚類到第Ⅳ組，然而其他近等基因系材料聚類結(jié)果完全不同。綜合分析發(fā)現(xiàn)，在所有近等基因系中，基于SSR分子標記所劃分的第Ⅲ類（包括N4、N10、N11和N16），是除第Ⅳ類外與不育系Ms（Kost）-5-1遺傳距離最近的一組，在農(nóng)藝性狀聚類分析中，N10和N16又同時與不育系Ms（Kost）-5-1聚為一類，表明N10和N16的遺傳背景與不育系Ms（Kost）-5-1較一致。

3 討論

小麥雄性不育系及育性恢復近等基因系的構(gòu)建對小麥雄性不育機理及育性恢復機制的探索具有重要意義。目前，有關(guān)小麥雄性不育恢復基因的研究主要集中在育性恢復基因定位，但對恢復基因進行微細定位和圖位克隆尚存在一定難度，其原因是一定程度上受限于材料，而小麥雄性不育及恢復基因近等基因系的構(gòu)建正好可解決材料問題。雖然小麥不同性狀的近等基因系已成功構(gòu)建（李希鋒和董娜，2012），但針對小麥核質(zhì)互作雄性不育系育性恢復系而言，成功構(gòu)建近等基因系的報道較少。劉立科等（2006）以D2型細胞質(zhì)雄性不育系MsD2-CA8057為受體，采用多代回交及定株（系）跟蹤選擇，成功培育成了D2型細胞質(zhì)雄性不育系恢復基因的近等基因系。本研究以不育系Ms（Kost）-5-1為母本，以高恢復力恢復系RK5451為父本，采用特定回交程序能快速定向構(gòu)建近等基因系。由于黏型小麥雄性不育系的恢復基因遺傳屬于配子體遺傳（劉保申等，2000；詹克慧等，2006），因此，在構(gòu)建近等基因系時應以不育系作為輪回親本，與雜交及回交后代中的可育株進行連續(xù)回交可保證恢復基因不被丟失。

在近等基因系構(gòu)建后，為保證所構(gòu)建近等基因系的質(zhì)量，應對其遺傳背景進行檢測，評價其質(zhì)量的好壞。目前，對近等基因系的檢測主要從兩方面進行：一方面是利用形態(tài)標記對近等基因系的質(zhì)量進行評價，另一方面是利用生化標記或分子標記對其檢測。許蘭杰等（2009）以17個小麥黏型不育系恢復基因的近等基因系和輪回親本不育系豫麥3號為材料，通過調(diào)查農(nóng)藝性狀，對小麥黏型不育系恢復基因近等基因系的農(nóng)藝性狀進行差異比較和聚類分析，獲得了黏型不育系的近等基因系。劉立科等（2006）利用SSR分子標記技術(shù)對構(gòu)建的D2型小麥雄性不育近等基因系的近等性進行檢測。本研究采用SSR分子標記與農(nóng)藝性狀相結(jié)合的手段檢測近等基因系的遺傳背景。SSR分子標記結(jié)果表明，第Ⅲ類（N4、N10、N11和N16）在保留了較好育性恢復性的基礎(chǔ)上，遺傳基礎(chǔ)又與輪回親本不育系Ms（Kost）-5-1相似性極高，是較理想的近等基因系候選系。農(nóng)藝性狀差異及聚類分析結(jié)果表明，第Ⅳ組包括N2、N3、N10、N16與不育系Ms（Kost）-5-1農(nóng)藝性狀差異最小。由于SSR分子標記結(jié)果與形態(tài)學標記存在一定差異，因此，綜合形態(tài)分析和SSR分子標記才可獲得較可靠的結(jié)果。綜合分析認為N10和N16是最理想的近等基因系，可為恢復基因的精細定位和功能分析及基因克隆等研究工作打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用特定回交程序構(gòu)建黏型小麥核質(zhì)互作雄性不育—恢復近等基因系，利用SSR標記、A-PAGE醇溶蛋白分析與田間農(nóng)藝性狀相結(jié)合的方法對其遺傳背景進行檢測，發(fā)現(xiàn)N10和N16兩個近等基因系為不育系Ms（Kost）-5-1的較好的近等基因系，可用于進一步基因精細定位和圖位克隆。

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（責任編輯 陳 燕）