海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚致病性鰻弧菌的分離鑒定及藥敏試驗

饒穎竹 梁靜真 陳蓉 楊廷寶

摘要：【目的】了解海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚弧菌病的病原，為生產(chǎn)中有效防治石斑魚弧菌病提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)方法進行患病斜帶石斑魚病原菌分離，人工感染試驗確定其致病性，以形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試結(jié)合16S rRNA和gyrB基因序列分析等方法進行菌株鑒定，并以K-B紙片擴散法進行藥敏試驗?！窘Y(jié)果】從廣東省湛江市某養(yǎng)殖場患病斜帶石斑魚中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（M1），經(jīng)人工感染試驗證實其對斜帶石斑魚具有較強的致病性。M1菌株的16S rRNA序列和gyrB基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的鰻弧菌具有較高相似性，其同源性均在95.7%以上。根據(jù)M1菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及分子特征，可鑒定其屬于弧菌屬的鰻弧菌（Vibrio anguillarum）。藥敏試驗結(jié)果顯示，M1菌株對慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、諾氟沙星和左氟沙星等7種藥物高度敏感，對阿洛西林、強力霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等14種藥物敏感?！窘Y(jié)論】引起廣東省湛江市某養(yǎng)殖場海水養(yǎng)殖患病斜帶石斑魚弧菌病的病原菌為弧菌屬鰻弧菌，生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、強力霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等抗菌藥物進行防治。

關(guān)鍵詞： 斜帶石斑魚；鰻弧菌；16S rRNA序列；gyrB基因；藥敏試驗

中圖分類號： S965.334.42 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1416-07

Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for effective prevention and control of grouper vibriosis， the pathogen was isolated and identified from diseased Epinephelus coioides， and its drug sensitivity was tested. 【Method】The pathogen was isolated by conventional method， and its pathogenicity was determined by artificial infection. Based on morphological observation， physiological-biochemical test， and sequences analysis of 16S rRNA and gyrB gene， the pathogen was identified. And its drug sensitivity was tested by Kirby-Bauer disc diffusion method. 【Result】One dominant bacterium strain was isolated from diseased E. coioides from fish farm in Zhanjiang， Guangdong， and named M1. It was pathogenic to E. coioides in artificial challenge test. The sequence analysis showed that， 16S rRNA and gyrB gene sequences of M1 shared high homology（more than 95.7%） with Vibrio anguillarum from GenBank database. Moreover， the strain M1 was identified as V. anguillarum based on its morphology， physiological-biochemical characteristics and molecular features， and it was highly sensitive to gentamicin， novobiocin， azithromycin， florfenicol， rifampicine， norfloxacin and levofloxacin， and moderately sensitive to 14 kinds of drugs， viz.， azlocillin， doxycycline， streptomycin， trimethoprim（TMP）， SMZ+TMP and so on. 【Conclusion】V. anguillarum is pathogen causing vibriosis of E. coioides cultured in a fish farm of Zhanjiang， Guangdong， and can be controlled by florfenicol， doxycycline， SMZ+TMP， TMP， etc.

Key words： Epinephelus coioides； Vibrio anguillarum； 16S rRNA sequence； gyrB gene； drug sensitivity test

0 引言

【研究意義】斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）俗稱青斑，隸屬于鱸形目（Perciformes）鮨科（Serranidae）石斑魚亞科（Epinephelinae）石斑魚屬（Epinephelus），因具有生長快、適應(yīng)能力強、飼養(yǎng)成活率高、經(jīng)濟價值高等特點，現(xiàn)已成為重要的海水魚類養(yǎng)殖對象。近年來，隨著石斑魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖密度的增加，加上有毒有害物質(zhì)的侵襲及水體環(huán)境污染等因素的影響，各種石斑魚病害頻發(fā)（張永嘉，1990；貝維全等，2010；王大鵬等，2012），給其養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。在石斑魚養(yǎng)殖過程中，極易出現(xiàn)神經(jīng)壞死病毒病、白點病、魚虱病、爛鰓病和細菌性疾病，而弧菌是引起海水養(yǎng)殖石斑魚細菌性疾病的最主要病原菌之一（羅鳴等，2013），因此，加強弧菌病原研究對有效防治石斑魚弧菌病及提高其養(yǎng)殖效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中最常見的優(yōu)勢細菌類群，其中鰻弧菌（Vibrio anguillarum）又是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的條件性致病菌。鰻弧菌是一類革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于海水、沉積物和水生動物體內(nèi)，當(dāng)養(yǎng)殖環(huán)境條件不利或水產(chǎn)動物受傷時會誘發(fā)一系列病癥，造成大規(guī)模暴發(fā)（張新中等，2007）。肖慧等（1999）從山東發(fā)生爛鰓、爛尾病的鱸魚體內(nèi)分離鑒定出1株鰻弧菌，人工感染有較強的致病性；李清祿和陳強（2001）從福建海水養(yǎng)殖的患病大黃魚體內(nèi)分離獲得2株致病性鰻弧菌，并進行藥敏試驗和臨床治療試驗；莫照蘭等（2002）從山東患潰爛癥的養(yǎng)殖牙鲆體內(nèi)分離獲得1株致病性鰻弧菌，與弧菌屬的同源性高達94%～98%；陳吉祥等（2005）、張曉君等（2009）分別從山東沿?；疾〈罅怫殷w內(nèi)分離鑒定出多株鰻弧菌，并檢測了部分毒力基因和主要外膜蛋白基因；Mikkelsen等（2007）從挪威的大西洋鱈魚體上分離鑒定出不同血清型的致病性鰻弧菌；趙魯寧等（2015）收集了自1999年以來的山東、河北和江蘇等地海水養(yǎng)殖魚類的31株鰻弧菌，通過生理生化、16S rRNA基因序列、血清分型和抗生素敏感性研究，發(fā)現(xiàn)我國海水養(yǎng)殖魚類攜帶的鰻弧菌普遍存在多重耐藥性?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，石斑魚弧菌病暴發(fā)頻繁，嚴(yán)重制約了其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，但至今有關(guān)廣東省海水養(yǎng)殖石斑魚弧菌病的報道較少（劉葒和江育林，2002），尚未見針對石斑魚鰻弧菌分子鑒定、致病性和藥物敏感性的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對海水養(yǎng)殖患病斜帶石斑魚的病原菌進行分離和致病性研究，在常規(guī)微生物分類的基礎(chǔ)上采用16S rRNA和gyrB基因序列分析進行分子生物學(xué)鑒定及藥敏試驗，旨在了解斜帶石斑魚弧菌病的病原，為生產(chǎn)中有效防治石斑魚弧菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病斜帶石斑魚采自廣東省湛江市某養(yǎng)殖場；供人工感染試驗的斜帶石斑魚購自廣東省湛江市東海島某養(yǎng)殖場（80尾，體重25～35 g，體長10～15 cm），活動正常，體表無損和體色正常。硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基和弧菌科細菌生理生化鑒定試劑盒購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，藥物敏感紙片購自杭州微生物試劑有限公司，PCR試劑盒和DNA純化回收試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，16S rRNA基因和gyrB基因的擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 病原菌分離

無菌條件下從患病斜帶石斑魚肝臟、潰爛皮膚等部位取樣，接種在TCBS培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)20～24 h后挑取優(yōu)勢單菌落再次劃線接種在TCBS培養(yǎng)基上，以獲得純培養(yǎng)菌株（M1）。挑取單菌落移入LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后進行生理生化鑒定，同時挑取相同單菌落進行革蘭氏染色鑒定。最后將擴大培養(yǎng)的菌液加入滅菌甘油至終濃度為20%，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 人工感染試驗

將M1菌株接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)12 h后用無菌0.1 mol/L PBS（pH 7.0）振蕩清洗、離心，棄上清液，再用0.1 mol/L PBS重懸菌體，采用平板計數(shù)法測定菌濃度。菌液用0.1 mol/L PBS稀釋成107 CFU/mL。挑取80尾健康斜帶石斑魚，隨機均分為4組，其中2組為試驗組，每尾腹腔注射0.1 mL菌液，剩下2組為對照組，每尾注射相同劑量的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）。注射后每天觀察記錄斜帶石斑魚的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察10 d，對死亡魚及時解剖，并以相同方法對致病菌再次進行分離鑒定。以引起試驗魚發(fā)病死亡并能重新分離到感染菌株作為分離菌株致病與否的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1. 4 細菌鑒定

1. 4. 1 形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化測試 挑取M1單菌落接種于TCBS培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察TCBS培養(yǎng)基上菌落的生長特征，經(jīng)革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)、大小，表型特征鑒定參照Schiewe等（1981）的方法。采用弧菌科細菌生理生化鑒定試劑盒對純化的M1菌株進行生理生化特性鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果判定弧菌種類。

1. 4. 2 16S rRNA和gyrB基因序列測定與分析 將M1菌株接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后取10 μL菌液95 ℃滅活5 min，菌液上清液可直接作為PCR模板。16S rRNA序列的PCR擴增引物為27F（正向引物）：5'-AGAGTTTGATC（A/C）TGGCTCA

G-3'和1492R（反向引物）：5'-TACGG（C/T）TACCTTG

TTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系50.0 μL，即5.0 μL 10×PCR緩沖液，5.0 μL的2.5 mmol/L dNTPs，4.0 μL的5 μmol/L引物，1.25 U Taq DNA聚合酶，5.0 μL PCR模板，去離子水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

gyrB基因序列的PCR擴增引物為UP-1（正向引物）：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA（C/T）GC（A/T/G/C）GG（A/T/G/C）GG（A/T/G/C）AA（A/G）TT（C/

T）GA-3'和UP-2r（反向引物）：5'-AGCAGGGTACGGA

TGTGCGAGCC（A/G）TC（A/T/G/C）AC（A/G）TC（A/

T/G/C）GC（A/G）TC（A/T/G/C）GTCAT-3'。除引物不同外，PCR反應(yīng)體系及其擴增程序與16S rRNA序列的擴增一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確定特異條帶后，進行膠回收純化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比較，再采用ClustalX進行多序列比對，序列一致性由DNASTAR的MegAlign進行計算，采用MEGA 3.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 5 藥敏試驗

按常規(guī)的K-B紙片擴散法進行病原菌的藥敏試驗，再根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

1. 1 M1菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

M1菌株在TCBS培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)18～24 h，其菌落呈黃色，直徑約2.0 mm。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，M1菌體半透明、桿狀、略顯弧形、可運動，菌體革蘭氏染色呈陰性。常規(guī)生理生化特性測試結(jié)果表明，M1菌株的氧化酶反應(yīng)、葡萄糖磷酸鹽胨水反應(yīng)（V-P）、蛋白胨水（吲哚）試驗和精氨酸雙水解酶試驗呈陽性，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露醇，對弧菌抑制劑O/129（150 μg/mL）敏感。在無鹽培養(yǎng)基（無鹽胨水）上不生長，在3%～6% NaCl胨水培養(yǎng)基上生長，葡萄糖產(chǎn)氣、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶等反應(yīng)呈陰性（表1）。上述生理生化特性與鰻弧菌的特征特性基本一致，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰鑒定細菌學(xué)手冊》和弧菌生理生化鑒定試劑盒說明，初步判定M1菌株為鰻弧菌（V. anguillarum）。

2. 2 人工感染試驗結(jié)果

腹腔注射M1菌株的活菌液3～5 d后，試驗組斜帶石斑魚病情加重，陸續(xù)死亡，8 d后試驗組的斜帶石斑魚累計死亡率達100%，而對照組斜帶石斑魚未表現(xiàn)出任何病癥。人工感染發(fā)病的斜帶石斑魚主要表現(xiàn)為無力、身體不平衡、體表潰爛、腹水、肝臟腫大糜爛，與自然發(fā)病斜帶石斑魚的臨床癥狀相似。從人工感染死亡斜帶石斑魚可再次分離獲得與M1菌株形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因序列均一致的菌株，表明所分離獲得的M1菌株即為斜帶石斑魚的致病菌。

2. 3 基因序列分析結(jié)果及其系統(tǒng)發(fā)育進化樹

以引物27F和1492R擴增的16S rRNA序列長度為1509 bp（圖1），GenBank登錄號JX966409。從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中選取21株弧菌菌株的16S rRNA序列進行比對分析，結(jié)果表明，M1菌株的16S rRNA序列與鰻弧菌（AB680389）16S rRNA序列的一致性最高，為99.8%（表2）。由16S rRNA序列構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）可知，M1菌株與鰻弧菌AB680389和NR042509、標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19264）、奧德弧菌（V. ordalii，AY530930）聚為一支，對應(yīng)的16S rRNA序列一致性依次為99.8%、99.7%、97.8%和99.1%；M1菌株與其他弧菌的16S rRNA序列一致性在94.2%～99.1%（表2）。

由引物UP-1和UP-2r擴增的gyrB基因序列長度為1259 bp（圖1），GenBank登錄號JX966408。BLAST分析結(jié)果顯示，與該基因序列同源性較高的100個序列均為弧菌屬細菌的gyrB基因序列。選取19個弧菌菌株的gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果表明，M1菌株與鰻弧菌AB373054和JQ698507聚為一支（圖3），對應(yīng)的gyrB基因序列一致性分別為99.2%和98.7%（表2）。此外，M1菌株與鰻弧菌AB373055、AB373056和AB373057的gyrB基因序列一致性均為98.3%，與鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19264）的序列一致性為95.7%，與奧德弧菌（AB298237）的序列一致性為98.5%，與其他弧菌的gyrB基因序列一致性在79.9%～83.6%（表2）。

綜合M1菌株的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因序列分析結(jié)果，將其鑒定為弧菌屬的鰻弧菌（V. anguillarum）。

2. 4 藥敏試驗結(jié)果

由表3可以看出，M1菌株對慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、諾氟沙星和左氟沙星等7種抗菌藥物高度敏感，對阿洛西林、哌拉西林、壯觀霉素、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢咪唑、頭孢拉定、多黏霉素B、強力霉素、甲氧芐啶、鏈霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明等14種藥物敏感，對青霉素、苯唑霉素、氨芐青霉素、羅紅霉素、克林霉素、阿莫西林、甲硝唑、頭孢呋辛和桿菌肽等9種藥物不敏感（耐藥）。

3 討論

弧菌是海水養(yǎng)殖環(huán)境中最常見的優(yōu)勢細菌類群，其中鰻弧菌是危害魚類的主要條件性致病菌（羅鳴等，2013），在某種應(yīng)激因素刺激使魚體抵抗力下降的情況下極易造成感染發(fā)病，可引起世界范圍內(nèi)的多種海水和淡水養(yǎng)殖魚類發(fā)生弧菌?。∕ikkelsen et al.，2007），也是我國鱸魚、牙鲆、大菱鲆和大黃魚等海水養(yǎng)殖魚類的主要病原菌（李清祿和陳強，2001；莫照蘭等，2002；陳吉祥等，2005），給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害。石斑魚是廣東沿海地區(qū)最重要的養(yǎng)殖魚類之一，由于養(yǎng)殖方式多樣、養(yǎng)殖密度高，鰻弧菌病也是石斑魚養(yǎng)殖過程中需重點防治的疾?。_鳴等，2013）。本研究從廣東省湛江市患病斜帶石斑魚中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（M1），經(jīng)人工感染試驗，證實M1菌株對斜帶石斑魚表現(xiàn)出較強的致病性，人工感染后3～5 d發(fā)生死亡，臨床癥狀以肝臟腫脹糜爛、發(fā)黑為特征，與鱸魚（肖慧等，1999）和大菱鲆（陳吉祥等，2005）等感染鰻弧菌的癥狀類似。

有關(guān)弧菌的鑒定，過去多采用以形態(tài)學(xué)和生理生化特征為主的表型鑒定方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代細菌分類鑒定已從傳統(tǒng)的表型分類轉(zhuǎn)向基因型分類（Clarridge，2004）。小亞單位核糖體RNA的16S rRNA約1500 bp，由可變區(qū)和保守區(qū)交替組成，是細菌分類鑒定中最常用的指標(biāo)工具（Janda and Abbott，2007），但16S rRNA適用于描述較遠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對于一些親緣關(guān)系密切的細菌，還需用其他基因序列進行輔助分析（侯曉麗和陳智，2005）。gyrB基因是編碼細菌DNA促旋酶（Gyrase）的亞單位，屬于單拷貝的看家基因，平均堿基替換率比16S rRNA的速率快，且不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，普遍存在于各種細菌中，滿足作為系統(tǒng)發(fā)育分析靶基因的要求，能克服16S rRNA難以準(zhǔn)確區(qū)分細菌近緣種的困難（La Duc et al.，2004）。本研究在進行細菌形態(tài)特征和生理生化特性等常規(guī)細菌檢測的基礎(chǔ)上，進行16S rRNA和gyrB基因分子水平鑒定，結(jié)果表明，M1菌株的16S rRNA序列與鰻弧菌AB680389和NR042509、鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19264）、奧德弧菌（AY530930）聚為一個類群，但與雙氮養(yǎng)弧菌（V. diazotrophicus）、河口弧菌（V. aestuarianus）和創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）的序列一致性也較高，均在97.0%以上，即采用16S rRNA序列難以將M1菌株鑒定到種；M1菌株的gyrB基因序列除了與鰻弧菌和奧德弧菌的序列一致性達95.7%～99.2%外，與其他弧菌的序列一致性均在90.0%以下，說明在鰻弧菌鑒別方面gyrB基因比16S rRNA序列更具優(yōu)越性。

由于操作方便、見效快和療效好，使用抗菌藥物仍是控制水生養(yǎng)殖動物疾病的主要手段（張新中等，2007；王玉堂和呂永輝，2011）。肖慧等（1999）研究認為，痢特靈、呋喃妥因、氯霉素、復(fù)方新諾明、美洛西林、新生霉素、利福平和新霉素等10種藥物對鱸魚的鰻弧菌有顯著抑制作用，可有效降低鰻弧菌引發(fā)的鱸魚苗爛鰓、爛尾病。張昕和蔡俊鵬（2003）研究表明，鰻弧菌對氯霉素、慶大霉素敏感，對卡那霉素、頭孢婁新、青霉素、四環(huán)素、紅霉素和鏈霉素已表現(xiàn)出耐藥性。公衍軍等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病鱸魚中分離獲得的鰻弧菌對青霉素、氨芐青霉素、強力霉素、磺胺嘧啶等常用抗菌藥已產(chǎn)生耐藥性，但對新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素敏感。趙魯寧等（2015）用ATB藥敏檢測系統(tǒng)檢測了31株海水養(yǎng)殖魚類鰻弧菌的耐藥性，結(jié)果顯示，鰻弧菌對β-內(nèi)酰胺類（阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、青霉素）、林可酰胺類（克林霉素）、硝咪唑類（甲硝唑）和夫西地酸的耐藥率為100%。本研究中的藥敏試驗結(jié)果表明，鰻弧菌M1菌株對氨基糖苷類的慶大霉素和新生霉素、大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素、酰胺類的氟苯尼考、利福霉素類的利福平及氟喹諾酮類的諾氟沙星和左氟沙星等7種抗菌藥物高度敏感，對β-內(nèi)酰胺類的青霉素、苯唑霉素、氨芐青霉素、阿莫西林，林可酰胺類的克林霉素，硝咪唑類的甲硝唑，糖肽類的桿菌肽等7種藥物具有耐藥性，與公衍軍等（2006）、趙魯寧等（2015）報道的試驗研究結(jié)果基本一致。目前，我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物國標(biāo)獸藥抗菌藥物有14個品種（郭秀平等，2014；中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2015），包括本研究中斜帶石斑魚鰻弧菌菌株對之高度敏感的氟苯尼考粉（水產(chǎn)用）及敏感的鹽酸多西環(huán)素粉（強力霉素，水產(chǎn)用）、復(fù)方磺胺甲噁唑粉（復(fù)方新諾明，水產(chǎn)用）和復(fù)方磺胺嘧啶粉（甲氧芐啶，水產(chǎn)用）。因此，在生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、強力霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等抗菌藥物控制廣東省湛江地區(qū)海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚的鰻弧菌病。

4 結(jié)論

引起廣東省湛江市某養(yǎng)殖場海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚弧菌病的病原菌為弧菌屬鰻弧菌，生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、強力霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等抗菌藥物進行防治。

參考文獻：

貝維全，古榮鋒，賈志軍. 2010. 石斑魚新型網(wǎng)箱健康養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 河北漁業(yè)，（9）：10-11.

Bei W Q，Gu R F，Jia Z J. 2010. A healthy cultivation technique for Epinephelus awoara in novel net cage[J]. Hebei Fishe-

ries，（9）：10-11.

陳吉祥，李彩鳳，顏顯輝，李筠，池政豪，薛學(xué)溫，王印庚. 2005. 大菱鲆病原鰻弧菌生物學(xué)及分子特征研究[J]. 高技術(shù)通訊，15（6）：92-96.

Chen J X，Li C F，Yan X H，Li Y，Chi Z H，Xue X W，Wang Y G. 2005. Biological and molecular characteristics of five pathogenic Vibrio anguillarum strains isolated from diseased turbot（Scophthalmus maximus）[J]. High Technology Letters，15（6）：92-96.

公衍軍，陳吉祥，杜萌，李愛娟，李筠，張曉華. 2006. 不同類型抗菌素對致病性鰻弧菌外膜蛋白表達的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，13（5）：794-799.

Gong Y J，Chen J X，Du M，Li A J，Li Y，Zhang X H. 2006. Effects of several antibiotics on expression of outer membrane proteins of Vibrio anguillarum W1[J]. Journal of Fishery Sciences of China，13（5）：794-799.

郭秀平，鄧國成，楊小靜. 2014. 我國現(xiàn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖動物使用國標(biāo)獸藥的種類[J]. 海洋與漁業(yè)，（3）：57-59.

Guo X P，Deng G C，Yang X J. 2014. Kinds of current national standard of veterinary drugs for aquaculture animal[J]. Ocean and Fishery，（3）：57-59.

侯曉麗，陳智. 2005. 分類及鑒別細菌的新靶標(biāo)——gyrB基因[J]. 國外醫(yī)院·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊，32（1）：38-41.

Hou X L，Chen Z. 2005. New target for classification and identification of bacteria——gyrB gene[J]. Foreign Medical Scie-

nces Epidemiology Lemology，32（1）：38-41.

李清祿，陳強. 2001. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚細菌性病原鑒定與感染治療研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，7（5）：489-493.

Li Q L，Chen Q. 2001. Identification of bacterial pathogen and treatment after infection of Pseudosciaena crocae in marine cage culture[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology，7（5）：489-493.

劉葒，江育林. 2002. 中國南部養(yǎng)殖石斑魚“腫脹病”的研究（英文）[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，21（3）：273-277.

Liu H，Jiang Y L. 2002. Studies on the“Swelling Disease” in cultured groupers（Epinephelus spp.） in South of China[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，21（3）：273-277.

羅鳴，陳傅曉，劉龍龍，李衛(wèi)東，曾關(guān)瓊，譚圍，李向民. 2013. 我國石斑魚養(yǎng)殖疾病的研究進展[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，32（9）：549-554.

Luo M，Chen F X，Liu L L，Li W D，Zeng G Q，Tan W，Li X M. 2013. Progress in disease research of grouper aquaculture in China[J]. Fisheries Science，32（9）：549-554.

莫照蘭，茅云翔，陳師勇，張培軍. 2002. 一株牙鲆皮膚潰爛癥病原菌的鑒定[J]. 微生物學(xué)報，42（3）：263-269.

Mo Z L，Mao Y X，Chen S Y，Zhang P J. 2002. Classification for one pathogenic Vibrio anguillarum strain isolated from skin- ulcer flounder[J]. Acta Microbiologica Sinica，42（3）：263-269.

王大鵬，曹占旺，謝達祥，甘西. 2012. 石斑魚的研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，43（7）：1058-1065.

Wang D P，Cao Z W，Xie D X，Gan X. 2012. Research progress in Epinephelus industry[J]. Journal of Southern Agriculture，43（7）：1058-1065.

王玉堂，呂永輝. 2011. 第一批正式轉(zhuǎn)為國家標(biāo)準(zhǔn)的漁藥 第一部分：抗微生物藥（連載一）[J]. 中國水產(chǎn)，（9）：44-47.

Wang Y T，Lü Y H. 2011. The first official to national standards of fishery drugs Part 1：Antimicrobial drugs（Serial 1）[J]. China Fisheries，（9）：44-47.

肖慧，李軍，王祥紅，紀(jì)偉尚，徐懷恕. 1999. 鱸魚苗爛鰓、爛尾病病原菌的研究[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），29（1）：87-93.

Xiao H，Li J，Wang X H，Ji W S，Xu H S. 1999. Studies on pathogens of rotted gill and rotted caudal fins of seaperch （Lateolabrax japonicus） fry[J]. Journal of Ocean University of Qingdao（Natural Science Edition），29（1）：87-93.

張曉君，閻斌倫，秦國民，秦蕾，徐靜. 2009. 魚類4種病原弧菌耐藥性及主要外膜蛋白OmpK基因檢測[J]. 海洋湖沼通報，（3）：98-104.

Zang X J，Yan B L，Qin G M，Qin L，Xu J. 2009. Detection of drug resistance and outer embrance protein OmpK gene of 4 pathogenic Vibrio sp. from fish[J]. Transactions of Oceanology and Limnology，（3）：98-104.

張昕，蔡俊鵬. 2003. 四種海洋致病弧菌對抗生素敏感性的測定[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），31（9）：66-69.

Zhang X，Cai J P. 2003. Determination of the antibiotic susceptibilities of four marine pathogenic Vibrios[J]. Journal of South China University of Technology（Natural Science Edition），31（9）：66-69.

張新中，張世秀，李海平，謝珍玉，周永燦. 2007. 海水養(yǎng)殖動物致病性（Pathogenicity）鰻弧菌（Vibroan guillarum）的研究綜述[J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息，22（1）：16-19.

Zhang X Z，Zhang S X，Li H P，Xie Z Y，Zhou Y C. 2007. Review on research of Vibrio anguillarum-pathogenicity to aquatic animals in mariculture[J]. Modern Fisheries Information，22（1）：16-19.

張永嘉. 1990. 湛江茂名海區(qū)飼養(yǎng)石斑魚的魚病調(diào)查[J]. 海洋科學(xué)，（4）：53-57.

Zhang Y J. 1990. Fish diseases of farmed grouper（Epinephelus spp.） in the Zhanjiang and Maoming areas[J]. Marine Scie-

nces，（4）：53-57.

趙魯寧，李貴陽，李杰，李晨，張樂萃，莫照蘭. 2015. 海水養(yǎng)殖魚類鰻弧菌（Vibrio anguillarum）臨床分離株的血清型和抗生素耐藥譜[J]. 海洋與湖沼，46（5）：1109-1118.

Zhao L N，Li G Y，Li J，Li C，Zhang L C，Mo Z L. 2015. Serotyping and antibiotics sensitivity of Vibrio anguillarum strains isolated from marine farmed fish[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，46（5）：1109-1118.

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 2015. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告 第2292號[EB/OL]. http：//www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201509/ t20150907_4819267.htm.

Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China. 2015. Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China Announcement No. 2292[EB/OL]. http：//www.moa.gov.cn/govpublic/ SYJ/201509/t20150907_4819267.htm.

Clarridge J E. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases[J]. Clinical Microbiology Reviews，17（4）：840-862.

La Duc M T，Satomi M，Agata N，Venkateswaran K. 2004. gyrB as a phylogenetic discriminator for members of the Bacillus anthracis-cereus-thuringiensis group[J]. Journal of Microbiologycal Methods，56（3）：383-394.

Janda M J，Abbott S L. 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory：pluses，perils，and pitfalls[J]. Journal of Clinical Microbiology，45（9）：2761-2764.

Mikkelsen H，Lund V，Martinsen L C，Gravningen K，Schr■der M B. 2007. Variability among Vibrio anguillarum O2 isolates from atlantic cod（Gadusmorhua L.）：Characterisation and vaccination studies[J]. Aquaculture，266（1-4）：16-25.

Schiewe H M，Trust J T，Crosaw H J. 1981. Vibrio ordalii sp. nov.：A causative agent of Vibriosis in fish[J]. Current Microbiology，6（6）：343-348.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）