3種戊唑醇劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性評(píng)價(jià)

王雅東 林慶勝 李祥英 夏曉明

摘要：【目的】評(píng)估不同戊唑醇劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性差異，篩選出環(huán)保劑型，減少化學(xué)農(nóng)藥使用過程對(duì)水生態(tài)環(huán)境的污染?！痉椒ā坎捎冒腱o態(tài)法測定430 g/L戊唑醇懸浮劑、60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑和25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性，并根據(jù)有毒化學(xué)物質(zhì)毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行毒性分級(jí)。【結(jié)果】430 g/L戊唑醇懸浮劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的半致死濃度（LC50）分別為7.89、7.87、7.84和7.81 a.i.mg/L，60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的LC50分別為6.20、5.68、5.32和5.28 a.i.mg/L，25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的LC50分別為3.29、3.18、3.12和3.10 a.i.mg/L。依據(jù)OECD對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)的毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，可確定3種戊唑醇劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性均為II級(jí)毒性，對(duì)斑馬魚的安全性排序?yàn)?30 g/L戊唑醇懸浮劑>60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑>25%戊唑醇水乳劑。【結(jié)論】不同戊唑醇劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性不同，其中以懸浮劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性最低，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用戊唑醇防控植物病害時(shí)應(yīng)盡量采用懸浮劑，以減少對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的污染。

關(guān)鍵詞： 斑馬魚；戊唑醇；劑型；急性毒性

中圖分類號(hào)： S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）08-1406-05

Abstract：【Objective】In order to screen out tebuconazole formulations that safe and friendly for environment， and reduce pollution of chemical pesticides to water ecosystem environment， the differences in acute toxicity of tebuconazole formulations to zebrafish were assessed. 【Method】The acute toxicity of three tebuconazole formulations viz.， 430 g/L tebuconazole suspension concentrate（SC）， 60 g/L tebuconazole flowable concentrate for seed coating（FS） and 25% tebuconazole emulsion in water（EW） to adult zebrafish were determined by semi-static test. The toxicities of three tebuconazole formulations were classified according to toxicity grade classification standard of toxic chemicals. 【Result】The results showed that， the 24， 48， 72 and 96 h median lethal concentrations（LC50） of 430 g/L tebuconazole SC for zebrafish were 7.89， 7.87， 7.84 and 7.81 a.i.mg/L， respectively. The 24， 48， 72 and 96 h LC50 values of 60 g/L tebuconazole FS were 6.20， 5.68， 5.32 and 5.28 a.i.mg/L， respectively， and the 24， 48， 72 and 96 h LC50 of 25% tebuconazole EW were 3.29， 3.18， 3.12 and 3.10 a.i.mg/L， respectively. According to toxicity grade classification standard of toxic chemicals of OEDC， the toxicities of three formulations of tebuconazole to adult zebrafish were acute II， and the securities of different formulations of tebuconazole to adult zebrafish was different， their order was 430 g/L tebuconazole SC>60 g/L tebuconazole FS>25% tebuconazole EW. 【Conclusion】There are some differences in acute toxicity of different tebuconazole formulations to zebrafish. Therefore， tebuconazole SC should be first choose to control plant disease in agriculture production because of its the least acute-toxicity to zebrafish， so as to reduce pollution to water ecosystem.

Key words： zebrafish； tebuconazole； formulation； acute toxicity

0 引言

【研究意義】三唑類殺菌劑為有機(jī)雜環(huán)類化合物，具有高效、廣譜、低殘留、持效期長、內(nèi)吸性強(qiáng)等特點(diǎn)，兼具保護(hù)、治療、鏟除和熏蒸作用，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病蟲害防治。戊唑醇是20世紀(jì)80年代開發(fā)的一種三唑類內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)白粉菌屬、柄銹菌屬、喙孢屬、核腔菌屬和殼針孢屬引起的病害具有顯著防治效果，目前主要用于防治小麥、花生、蔬菜、香蕉、蘋果、梨等作物上的真菌病害（李富根等，2001；王新茹等，2008；華乃震，2013；孔祥英等，2014；李洪等，2014）。戊唑醇是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常用的殺菌劑品種之一，也是我國使用量最大的殺菌劑，但大量使用也會(huì)給生態(tài)環(huán)境造成一定的影響和壓力。因此，有必要進(jìn)一步明確不同劑型戊唑醇的急性毒性，以減少不必要的污染和浪費(fèi)，也為制定科學(xué)合理的用藥方案提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】戊唑醇作為一種化學(xué)農(nóng)藥，對(duì)哺乳動(dòng)物和非靶標(biāo)生物均有一定的毒性作用。已有研究表明，戊唑醇對(duì)哺乳動(dòng)物有一定的蓄積毒性作用，可引起小白鼠等物種的潛在慢性中毒（楊秀鴻等，2010）。對(duì)于非靶標(biāo)昆蟲而言，戊唑醇對(duì)家蠶的急性毒性等級(jí)為低毒性，在桑園周圍農(nóng)業(yè)環(huán)境使用存在中等風(fēng)險(xiǎn)（池艷艷等，2014），但對(duì)玉米螟和赤眼蜂具有高風(fēng)險(xiǎn)性（宋光林等，2014）。戊唑醇對(duì)水生生物的毒性因物種的不同而存在一定差異，如對(duì)小球藻的急性毒性為低毒（張金洋等，2013），對(duì)花翅搖蚊的急性毒性則為中毒（趙燕等，2012），對(duì)斑馬魚的急性毒性等級(jí)亦為中毒，尤其對(duì)斑馬魚胚胎具有明顯的致死、致畸、抑制發(fā)育等不良影響（周炳等，2008；Oscar et al.，2011；李俊等，2013）。除急性毒性外，低劑量的戊唑醇還會(huì)影響斑馬魚的甲狀腺激素水平及其基因轉(zhuǎn)錄水平（Yu et al.，2013），且通過卵黃蛋白原、三酸甘油酯、膽固醇、葡萄糖、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶等綜合破壞斑馬魚的生理行為（Sancho et al.，2010）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】相同成分化學(xué)農(nóng)藥不同劑型對(duì)生態(tài)環(huán)境的毒性受助溶劑、消解動(dòng)態(tài)及環(huán)境行為等因素的影響。目前，生產(chǎn)中常用的戊唑醇主要有懸浮劑、懸浮種衣劑和水乳劑等劑型，但有關(guān)不同劑型對(duì)水生生物的毒性評(píng)估鮮見研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用半靜態(tài)法測試430 g/L戊唑醇懸浮劑、60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑和25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性，評(píng)估3種常用劑型對(duì)斑馬魚的毒性差異，以期篩選出環(huán)保劑型，減少化學(xué)農(nóng)藥使用過程對(duì)水生態(tài)環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

430 g/L戊唑醇懸浮劑、60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑和25%戊唑醇水乳劑均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境毒理研究中心提供。斑馬魚（Brachydonio rerio）購自廣州楊氏水族館，體長2.00±0.10 cm，在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)7 d以上，每天光照12～16 h，死亡率保持在5%以下，馴養(yǎng)期間每天喂食1～2次，測試前24 h停止喂食，試驗(yàn)期間不喂食。挑選體長均勻一致、健康活潑的斑馬魚用于急性毒性試驗(yàn)。

1. 2 試驗(yàn)方法

參考中華人民共和國環(huán)保部頒發(fā)的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》和OECD試驗(yàn)準(zhǔn)則，采用半靜態(tài)法測定各劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)劑型設(shè)置7個(gè)試驗(yàn)濃度（表1）。每處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾斑馬魚，每24 h更換藥液1次。試驗(yàn)開始后6 h內(nèi)觀察并記錄試驗(yàn)魚的中毒情況及死亡數(shù)量，其后則在24、48、72、96 h觀察記錄斑馬魚的中毒癥狀及死亡數(shù)量。用玻璃板輕觸斑馬魚尾部無反應(yīng)運(yùn)動(dòng)即判斷其死亡，并及時(shí)撈出已死亡的斑馬魚。每天測定并記錄試驗(yàn)藥液溫度、pH及溶解氧。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0進(jìn)行處理，計(jì)算供試藥劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的半致死濃度（LC50）和95%置信限。致死量標(biāo)準(zhǔn)差S=log-1（1/b），其中，S為致死量標(biāo)準(zhǔn)差，b為毒理回歸方程斜率（竇豐滿等，2002）；并根據(jù)有毒化學(xué)物質(zhì)毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行毒性分級(jí)（OECD，2001）。

在毒理回歸方程中，b是計(jì)算LC50的中間量，而非定值，因而不能用于表示劑量死亡曲線的坡度和急性毒性作用，1/b也不能作為試驗(yàn)精密度指數(shù)。但S作為化學(xué)品毒性指標(biāo)可用于度量劑量死亡曲線的坡度，急性毒性作用帶及試驗(yàn)精密度指數(shù)實(shí)際上也是度量最小致死量的個(gè)體差異，因此可用S表示。S值大表示坡度小，反之表示坡度大。若處理間的LC50相近但S不同，其毒性仍有差別（竇豐滿等，2002）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 斑馬魚在3種戊唑醇劑型中的中毒癥狀

斑馬魚受到戊唑醇作用后均表現(xiàn)出興奮癥狀，低濃度處理下其腮部淤血，腹部微紅；高濃度處理時(shí)，隨處理時(shí)間的延長，斑馬魚開始游動(dòng)失衡，行動(dòng)遲緩，腮部淤血，腹部微紅，魚鰭微張，最后死亡。死亡斑馬魚的魚體發(fā)白，身體彎曲，如圖1所示。

2. 2 戊唑醇懸浮劑對(duì)斑馬魚的急性毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

430 g/L戊唑醇懸浮劑半靜態(tài)測定結(jié)果顯示，其對(duì)斑馬魚的LC50和S均較穩(wěn)定，如表2所示。其中，24、48、72和96 h的LC50分別為7.89、7.87、7.84和7.81 a.i.mg/L，S分別為1.16、1.17、1.17和1.16。由于時(shí)間限制，430 g/L戊唑醇懸浮劑對(duì)斑馬魚的急性毒性隨時(shí)間延長而增強(qiáng)的趨勢不明顯。依據(jù)OECD對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，可確定430 g/L戊唑醇懸浮劑對(duì)斑馬魚的急性毒性為II級(jí)毒性。

2. 3 戊唑醇懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚的急性毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚的急性毒性結(jié)果如表3所示，24、48、72和96 h的LC50分別為6.20、5.68、5.32和5.28 a.i.mg/L，各處理間的LC50無顯著差異（P>0.05，下同），其對(duì)應(yīng)的S分別為1.18、1.18、1.17和1.18。各處理間的LC50和S均相近，說明各處理間的毒性差異不明顯。但LC50隨時(shí)間的延長有降低趨勢，說明該劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性會(huì)隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，但在96 h內(nèi)毒性增加不顯著。依據(jù)OECD對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，可確定60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚的急性毒性為II級(jí)毒性。

2. 4 戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性發(fā)展趨勢與430 g/L戊唑醇懸浮劑和60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑一致，隨時(shí)間的延長而呈增強(qiáng)趨勢，但急性毒性較高。由表4可以看出，24、48、72和96 h的LC50分別為3.29、3.18、3.12和3.10 a.i.mg/L，對(duì)應(yīng)的S為1.23、1.30、1.29和1.30。其中，處理24 h的S最小，即其毒性曲線坡度最大，引起死亡所需的濃度變化較小。依據(jù)OECD對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，可確定25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性為II級(jí)毒性。

雖然430 g/L戊唑醇懸浮劑、60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑和25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性均為II級(jí)毒性，但通過對(duì)其LC50進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)430 g/L戊唑醇懸浮劑的LC50最高，60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑次之，25%戊唑醇水乳劑的最低，即這3種藥劑對(duì)斑馬魚的安全性排序?yàn)?30 g/L戊唑醇懸浮劑>60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑>25%戊唑醇水乳劑。

3 討論

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，農(nóng)藥的性質(zhì)、劑型、實(shí)際使用量、降解行為及環(huán)境條件狀況等均會(huì)影響農(nóng)藥對(duì)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的安全性（李祥英等，2014），但我國目前尚缺乏較完善的農(nóng)藥環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。斑馬魚是農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中測試農(nóng)藥急性毒性試驗(yàn)的重要生物材料，也是表征農(nóng)藥對(duì)水環(huán)境中非靶標(biāo)生物影響的模式生物（Andreu-Sánchez et al.，2011；Sipes et al.，2011）。農(nóng)藥對(duì)斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)在一定程度上可為農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)管理和科學(xué)用藥提供重要的參考依據(jù)，陳愛梅等（2013）、李俊等（2013）和李祥英等（2014）分別研究報(bào)道了戊唑醇原藥對(duì)斑馬魚的急性毒性，雖然急性毒性結(jié)果有所差異，但均將戊唑醇對(duì)斑馬魚的急性毒性劃分為中等毒性。

受填充材料、有效成分含量等因素的影響，相同化學(xué)農(nóng)藥不同劑型間對(duì)環(huán)境生物的急性毒性存在顯著差異。如吡蟲啉懸浮劑對(duì)蚯蚓的急性毒性等級(jí)為高毒，濕拌種劑、懸浮種衣劑和可濕性粉劑對(duì)蚯蚓的急性毒性等級(jí)則為中毒（陳愛梅等，2013）；毒死蜱微囊懸浮劑對(duì)魚類、鳥類、家蠶和蜜蜂4種環(huán)境生物的安全性明顯高于乳油制劑（季靜等，2010）。因此，評(píng)價(jià)不同農(nóng)藥劑型對(duì)環(huán)境生物的安全性對(duì)研發(fā)低毒農(nóng)藥劑型、合理使用農(nóng)藥、減少農(nóng)藥對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的污染、保護(hù)生態(tài)多樣性均具有重要意義。依據(jù)OECD對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)毒性等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究將430 g/L戊唑醇懸浮劑、60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑和25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急性毒性等級(jí)均鑒定為II級(jí)毒性，等同于國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)中的中等毒性，與李俊等（2013）、李祥英等（2014）研究戊唑醇原藥對(duì)斑馬魚的急性等級(jí)相同。本研究結(jié)果表明，430 g/L戊唑醇懸浮劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的LC50分別為7.89、7.87、7.84和7.81 a.i.mg/L，60 g/L戊唑醇懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的LC50分別為6.20、5.68、5.32和5.28 a.i.mg/L，25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚24、48、72和96 h的LC50分別為3.29、3.18、3.12和3.10 a.i.mg/L，其中25%戊唑醇水乳劑對(duì)斑馬魚的急生毒性是430 g/L戊唑醇懸浮劑的2倍左右。一般來說，不同劑型間的毒性差異主要來源于有機(jī)溶劑作用或有機(jī)溶劑與原藥的協(xié)同作用。農(nóng)藥懸浮劑在制作過程中避免使用任何溶劑，而水乳劑在加工過程中需加入一定量的溶劑，故懸浮劑較水乳劑相比更安全環(huán)保（華乃震和華純，2013a，2013b）。因此，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)防控靶標(biāo)和對(duì)象選擇合理的戊唑醇劑型或產(chǎn)品，盡可能選擇懸浮劑，并嚴(yán)格控制使用劑量和使用方式，以減少對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的污染。

4 結(jié)論

不同戊唑醇劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性不同，其中以懸浮劑型對(duì)斑馬魚的急性毒性最低，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用戊唑醇防控植物病害時(shí)應(yīng)盡量采用懸浮劑，以減少對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的污染。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）