利用RAPD、ISSR分子標(biāo)記分析野牡丹屬親緣關(guān)系

陳振東 鄭濤 林秀香 林藝華 鄭少緣 蘇金強

摘 要 采用ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對9個種44份野牡丹屬種質(zhì)資源進行了親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明：11條ISSR引物共擴增出91條譜帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性條帶的比率為98.9%；16 條RAPD引物共擴增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為89.38%。2種分子標(biāo)記相比較，ISSR分子標(biāo)記檢測出的多態(tài)性比率更高。44份野牡丹屬種質(zhì)明顯聚為2組，種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)在0.61～0.88，平均相似系數(shù)0.75?；诓煌锏臈l帶組合構(gòu)建了供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的ISSR和RAPD指紋圖譜，采用這2種指紋圖譜可對供試的所有野牡丹屬種質(zhì)資源進行鑒定。

關(guān)鍵詞 野牡丹屬；種質(zhì)；分子標(biāo)記；親緣關(guān)系；指紋圖譜

中圖分類號 S682.39 文獻標(biāo)識碼 A

野牡丹科（Melastomaceae）植物全世界約240個屬，共3 000余種[1]。野牡丹屬（Melastoma）屬于野牡丹科，大約有100個種，分布中心處于東南亞一帶，中國有9個種和1個變種，主要分布帶處于長江以南各個省區(qū)[2]。野牡丹屬植物花色有白色系、粉色系、紫色系，其花期長、花量大，株型從地被、灌木到小喬木均有分布，園林運用上可做到周年有花（花期：地菍、印度白花野牡丹四季開花，展毛野牡丹3～4月，紫毛、多花、細葉野牡丹、毛菍5～6月份，野牡丹、毛菍7～8月），具備良好的觀賞性狀；此外，該屬植物的藥用價值近來也有深入研究[3-4]，發(fā)展前景廣泛。目前，絕大多數(shù)的野牡丹屬植物仍未被人工開發(fā)利用，已在野牡丹屬種質(zhì)資源的收集及評價[5-9]、栽培技術(shù)[10]、脫毒育苗[11-13]、傳粉特性[14-15]以及種子發(fā)育[16]等方面進行了研究。

目前，針對野牡丹屬的分類研究主要集中于宏觀形態(tài)學(xué)[16]、細胞遺傳學(xué)[17]、孢粉學(xué)[18]、細胞學(xué)[19]、表型多樣性[20-21]等方面，利用分子標(biāo)記對野牡丹種質(zhì)資源的遺傳性進行研究還比較少。鄭濤等[22]利用ISSR分子標(biāo)記對福建省33份野牡丹屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行研究，聚類分析表明，34份材料可劃分為3個類群5個亞類，主坐標(biāo)散點分析可分為4個類群，這與根據(jù)形態(tài)學(xué)劃分的結(jié)果基本一致。野牡丹屬因為分布范圍廣、自然雜交類型豐富，一些野生種質(zhì)的分類尚未十分明確，給人工雜交親本選擇帶來了不少困擾。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上擴大了取樣范圍，以中國的44份野牡丹屬種質(zhì)為研究對象， 利用ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，再次從分子水平上探討野牡丹屬內(nèi)的親緣關(guān)系，為有效利用分子標(biāo)記評價野牡丹屬種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，同時，利用篩選出的通用引物構(gòu)建44份野牡丹屬野生種質(zhì)資源的RAPD、ISSR指紋圖譜，為野牡丹屬野生種質(zhì)資源快速鑒定及后期人工選育種親本選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料為野牡丹屬野生種質(zhì)資源共9個種44份材料，來源于福建、廣東、廣西、海南、云南5個省份。采集新鮮葉片凍于液氮，保存在-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用前期試驗確定的改良CTAB法提取野牡丹基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法定量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立：DNA模板（30 ng/μL）0.7 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.6 μL，引物（10 μmol/L）0.8 μL，Taq酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O定容20 μL。反應(yīng)程序：反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；53 ℃退火40 s；72 ℃延伸2 min。

PAPD-PCR反應(yīng)體系的建立：DNA模板（20 ng/uL）1.5 μL，10×Taq Green Buffer（含Mg2+）2 μL，引物（10 μmol/L）0.7 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O定容20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，45個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 引物篩選 從116條ISSR、100條RAPD隨機引物中分別篩選出11條、16條多態(tài)性好、條帶清晰的引物供PCR反應(yīng)（表2、表3）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2種分子標(biāo)記方法通過PCR反應(yīng)擴增出的條帶圖片，對同一引物所擴增出遷移率相同的條帶計為1個位點，有條帶的位置計為“1”，無條帶位置計為“0”，所得數(shù)據(jù)輸入Excel 2003工作表建成原始“0/1”數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS聚類分析軟件進行聚類分析。針對所有供試品種，對11條ISSR引物和16條RAPD引物擴增出的條帶進行比對，選出鑒別能力較強的引物，然后對由這些引物經(jīng)PCR反應(yīng)跑出的電泳條帶進行形象化處理，同一位點上記為“1”的電泳條帶用黑色方塊表示，記為“0”的條帶用白色方塊表示，據(jù)此構(gòu)建出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR分子標(biāo)記結(jié)果與分析

本研究以前期試驗篩選出的11條ISSR隨機引物對供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源進行DNA多態(tài)性檢測[16]，總共擴增出91條清晰度好，重復(fù)性高的譜帶，其中多態(tài)性譜帶有90 條，多態(tài)性條帶比例為98.9%（表2）。擴增結(jié)果表明，擴增位點最多的引物為UBC857 、UBC811和CW32506，位點數(shù)均為12個。其中引物UBC857對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴增圖譜見圖1。

2.2 RAPD標(biāo)記結(jié)果與分析

16條RAPD引物共擴增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為89.38%。擴增產(chǎn)物大小集中在2 00～2 000 bp。擴增位點最多的引物是S1、S19、S43，位點數(shù)均為9。其中引物S19對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴增圖譜見圖2。

2.3 44份野牡丹屬種質(zhì)親緣關(guān)系分析

綜合44份野牡丹屬種質(zhì)ISSR和RAPD擴增條帶數(shù)做聚類分析，聚類結(jié)果見圖3。可將供試野牡丹屬種質(zhì)資源分為2大類群。3號毛菍與其他各地的地菍聚為Ⅰ類；其他36份野牡丹屬種質(zhì)聚類Ⅱ類。Ⅱ類野牡丹屬種質(zhì)較多，可細分為3組，1組為1號、2號、4號、5號、6號、7號、8號、10號、9號、12號、11號、18號、13號、19號、21號、20號、33號；2組為30號、31號、32號、34號、35號、36號、37號、38號、39號、40號、41號、43號、44號、；3組為14號、27號、28號、29號福建多花野牡丹與42號云南普洱的多花野牡丹。44份野牡丹屬種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)在0.61～0.88，平均相似系數(shù)為0.75，表明44份野牡丹屬種質(zhì)之間的親緣關(guān)系較近。

2.4 44份野牡丹屬種質(zhì)指紋圖譜的建立

由于ISSR引物的多態(tài)性，同一引物擴增出的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的條帶有明顯差異。比對結(jié)果表明：利用引物UBC811可以鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851可以鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可以鑒別出供試的44份野牡丹種質(zhì)資源。

從篩選16條ARAPD引物中選擇多態(tài)性好、鑒別效率高的核心引物S19和S43，建立44份野牡丹屬種質(zhì)資源的指紋圖譜（圖5）。利用引物S19可以鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物S43可以鑒別出29份野牡丹種質(zhì)資源，而采用引物S19和S43組合可以鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。由圖5可知，利用2條RAPD核心引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源的指紋圖譜，每個品種都有唯一的指紋圖譜。

3 討論與結(jié)論

3.1 分子標(biāo)記用于野牡丹種質(zhì)的遺傳變異研究

采用ISSR分子標(biāo)記研究44份野牡丹種質(zhì)的遺傳變異情況，10條ISSR引物共擴增出91條帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性比率98.9%；采用RAPD分子標(biāo)記對44份野牡丹種質(zhì)的遺傳變異進行研究，16條PAPD引物共擴增出113條帶，其中多態(tài)性條帶101條，多態(tài)性比率89.38%?？梢?，2種分子標(biāo)記均可檢測出野牡丹種質(zhì)資源間較為豐富的遺傳變異；但比較起來，ISSR分子標(biāo)記檢測出的多態(tài)性比率比RAPD分子標(biāo)記檢測出的高。采用ISSR分子標(biāo)記研究野牡丹屬種質(zhì)間的遺傳變異，其多態(tài)性位點的百分率為98.9%，高于新疆紅花（Canluumts tinctorius）[21]品種間的93.77%、菊花（Dendranthema×grandi flora）[22]品種間的92.5%和君子蘭[23]（Clivia）品種間的81.95%；采用RAPD標(biāo)記研究野牡丹種質(zhì)的遺傳變異，其多態(tài)性位點的百分率僅為89.38%，接近于亞麻（Linum usitatissimum）[24]品種間的90.49%，高于石蒜（Lycoris Herb.）[25]品種間的70%，低于紅花（Canluumts tinctorius）[21]品種間92.31%。2種分子標(biāo)記遺傳相似性分析結(jié)果表明，野牡丹屬種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)0.61～0.88之間，表明44份野牡丹屬種質(zhì)資源之間親緣關(guān)系較近。

3.2 野牡丹屬種質(zhì)的遺傳變異分析

與之前的研究結(jié)果[22]對比，本研究擴大了取樣范圍，從外觀形態(tài)上判斷，增加了《福建植物志》以外的3個種（紫毛、印度、大野牡丹）進行比較分析，得到較為全面的分析數(shù)據(jù)。本研究2種分子標(biāo)記方法都將地菍單獨聚為一類，這與先前的研究結(jié)果[22]相同，表明地菍與其它種間的親緣關(guān)系相對較遠，在自然雜交過程中的參與度較低；4號印度白花野牡丹是印度野牡丹（Melastoma malabathricum，粉色花）的變異種，研究結(jié)果將其與5號廣州多花野牡丹聚在一起，說明二者在親緣關(guān)系上非常接近。研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，通過形態(tài)學(xué)觀測很難準(zhǔn)確的將野牡丹屬中的幾個種進行區(qū)分，甚至發(fā)生錯誤分類，例如，44號大野牡丹葉片、花瓣顯著大于其他樣品，形態(tài)特征與大野牡丹類似，通過形態(tài)學(xué)分類很容易將其歸為大野牡丹類，而標(biāo)記結(jié)果則表明其應(yīng)為多花野牡丹類群；32號云南版納的多花野牡丹應(yīng)為野牡丹類群；37號云南版納的野牡丹，與38、39親緣關(guān)系最近，兼有野牡丹、展毛野牡丹的特征，因此將其歸為展毛野牡丹更為準(zhǔn)確。另外，野牡丹屬親緣關(guān)系遠近不但與種的類別有關(guān)也與地域分布存在一定關(guān)系，相同來源地的野牡丹屬植物因種間差異可能親緣關(guān)系較遠，如10號與12、/13號，而不同來源地的植物因種間差異較小可能被聚為一類，如30、/31號，這也說明多花野牡丹種內(nèi)存在比較明顯的基因分離現(xiàn)象，遺傳背景比較復(fù)雜。從本研究的樣品分析來看，地菍具有較強的遺傳穩(wěn)定性，其余野牡丹屬種間、不同來源地的同種植物存在明顯的基因交叉，再次證明了前期研究得到的野牡丹屬植物“遺傳背景復(fù)雜、自然雜交類型豐富、親緣關(guān)系總體較近”的結(jié)論。

本研究分別篩選出2條特異引物建了供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的ISSR和RAPD指紋圖譜，采用這2種指紋圖譜可對供試的所有野牡丹屬種質(zhì)行鑒定，為利用分子標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確地鑒定野牡丹屬資源奠定基礎(chǔ)。

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