小麥屬物種ω-醇溶蛋白序列的克隆與分析

李增林，吳丹丹，李洪雨，陳 剛，劉小娟，甯順腙，劉登才，張連全

(四川農業(yè)大學小麥研究所，四川成都 611130)

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小麥屬物種ω-醇溶蛋白序列的克隆與分析

李增林，吳丹丹，李洪雨，陳 剛，劉小娟，甯順腙，劉登才，張連全

(四川農業(yè)大學小麥研究所，四川成都 611130)

摘要：為了挖掘ω-醇溶蛋白在小麥品質育種中的潛力，利用2對引物采用基因組PCR方法分別從阿拉拉特小麥(Triticum timopheevi Zhuk. var. araraticum)、栽培二粒小麥 (Triticum turgidum ssp. dicoccon)、提莫菲維小麥(Triticum timopheevi)、 栽培一粒小麥(Triticum monococcum ssp. monococcum)和野生一粒小麥(Triticum monococcum var. boeoticum)5個小麥屬物種中克隆出ω-醇溶蛋白序列，并對其進行序列分析。結果表明，本研究共克隆到6條新的ω-醇溶蛋白序列，歸屬于ARH、ATN和TRQ三種類型。這些新的ω-醇溶蛋白序列的長度為927～1 095 bp。在這6個序列中，除KR082150擁有兩個甲硫氨酸(Met)外，其余的均缺少含硫氨基酸。進化分析表明，本研究獲得的6條ω-醇溶蛋白序列聚在了2個主要的分支，其中N端第一個氨基酸為丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一個大的分支中，而TRQ類型的則聚在了另一個分支中。

關鍵詞：小麥屬物種；ω-醇溶蛋白；基因克??；系統(tǒng)進化

小麥胚乳貯藏蛋白主要由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成，其中，麥醇溶蛋白約占小麥胚乳貯藏蛋白總量的50%～60%[1-3]，主要決定面團的粘性和延展性[4-6]。根據醇溶蛋白在酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率和分子結構的不同，可分為α-/β-、γ-和ω-三大類[5,7-8]。根據成熟蛋白N端的前三個氨基酸可將ω-醇溶蛋白分為ARQ/E、KEL、SRL和TRQ等類型[9-11]。但ω-醇溶蛋白的基本結構比較保守，包括含19個氨基酸殘基的信號肽區(qū)域、含12個氨基酸殘基的N-末端、含90%～96%的氨基酸的中央重復區(qū)、含9～12個氨基酸殘基的C-末端4個區(qū)域[9,11]。ω-醇溶蛋白的主要特征是含有大量的谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)殘基(總共占到氨基酸殘基數的80%)，但是明顯缺乏含硫氨基酸，即半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)[12-13]。研究表明，醇溶蛋白不僅與小麥的加工品質密切相關，也是遺傳性疾病-乳糜瀉(Celiac diease,CD)的主要外在刺激蛋白[14-18]。其中，在ω-醇溶蛋白中發(fā)現3種(Gli-ωt: PQQPFPQQ; Gli-1: PFPQPQQPF; Gli-2: PQPQQPFPW)可誘發(fā)CD發(fā)生的T-細胞免疫肽段[16-18]。盡管了解和運用ω-醇溶蛋白具有非常重要的意義，但目前通過PCR克隆得到的ω-醇溶蛋白數量仍然非常有限[9-10,19-22]。鑒于此，本研究擬以小麥屬物種阿拉拉特小麥(TriticumtimopheeviZhuk. var.araraticum,AAGG,2n=4x=28)、栽培二粒小麥(Triticumturgidumssp.dicoccon,AABB,2n=4x=28)、提莫菲維小麥(Triticumtimopheevi,AAGG,2n=4x=28)、栽培一粒小麥(Triticummonococcumssp.monococcum,AA,2n=2x=14)和野生一粒小麥(Triticummonococcumvar.boeoticum,AA,2n=2x=14)為材料，采用基因組PCR法進行ω-醇溶蛋白序列克隆，并對其進行序列分析，以期豐富ω-醇溶蛋白的遺傳信息，為ω-醇溶蛋白的結構與功能研究提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共計5份，包括阿拉拉特小麥(PI352265)、栽培二粒小麥(PI352365)、提莫菲維小麥(PI221421)、栽培一粒小麥(PI352479)和野生一粒小麥(G52)，除G52由四川農業(yè)大學小麥研究所提供外，其他均由美國種質資源信息庫(NPGS)惠贈。

1.2 ω-醇溶蛋白序列的克隆

用DNA提取試劑盒 Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN公司)提取室內培養(yǎng)一周左右的植株葉片DNA。引物F1/R1(F1:5′-TCAAGG TGTGTAGTGTAAAG-3′; R1:5′-ATTTGTCC TGGTTGCTAGGAA-3′)和F2/R2(F2:5′-GC TAGGG/CAA/GT/CTAAACCCTAA/GC-3′; R2: 5′ - TCATTGGCCACCGATGCT/CTG/ATT-3′)分別依據李 敏等[23]和莊倩倩等[22]文獻報道的序列所設計。PCR擴增體系：模板DNA 100 ng，10×LA PCR buffer 5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 5 μL,上下游引物各(20 μmol·L-1)1.5 μL，2.5 U的高保真LATaq酶(TaKaRa公司)0.5 μL，加ddH2O補足50 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后選擇合適的片段進行回收，并與pMD19-T載體 (TaKaRa公司)連接。將連接產物轉入大腸桿菌DH10感受態(tài)細胞中，然后通過菌液PCR鑒定陽性克隆。最后隨機挑取5個陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.3序列分析

用DNAMAN軟件(Version 6.0.3,Lynnon Biosoft,Canada)將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列。用Clustal X 2.0軟件對核苷酸及氨基酸序列進行比對。用NCBI提供的在線BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 工具對核苷酸及氨基酸序列的同源序列進行搜索。用Mega 6.0軟件(鄰接法)構建系統(tǒng)進化樹。

2結果與分析

2.1小麥屬物種中ω-醇溶蛋白序列的克隆

利用引物F1/R1和F2/R2對5個小麥屬物種的總DNA進行PCR擴增，得到6條大小約1 000 bp的目的條帶(圖1)。將目的條帶回收純化后連接到pMD19-T載體，通過菌液PCR鑒定出陽性克隆后進行了測序。測序獲得6個不同的序列(F1/R1的PCR產物5個，F2/R2的PCR產物1個)。NCBI在線BLAST表明，6個新序列與已知的ω-醇溶蛋白基因序列相似度大于86%。將這6個新序列提交至Genbank，得到序列登錄號為KR082149～KR082154。通過ORF Finder分析發(fā)現，這6個新序列均不含有內含子，但是都存在至少4個終止密碼子，推測這些序列全部為假基因。

M：DL1000；1～5：引物組合F1/R1的PCR產物，依次來源于PI352265、PI352365、PI221421、G52和PI352479；6：引物組合F2/R2的PCR產物，來源于PI352265

M: DL1000; 1-5: PCR products amplified with the primer pair F1/R1,which are respectively from PI352265,PI352365,PI221421,G52 and PI352479; 6: PCR product amplified with the primer pair F2/R2,which is from PI352265

圖1PCR擴增產物的電泳分析

Fig.1PCR amplification products

separated by 1.5% agarose gel

2.2氨基酸序列分析

將本研究推導得到的6個氨基酸序列進行了比對分析，發(fā)現其與已發(fā)表的ω-醇溶蛋白擁有相同的保守結構，即含有由19個氨基酸組成的信號肽、由12個氨基酸組成的N端區(qū)、由90%～96%的氨基酸組成的中央重復區(qū)和由9～11個氨基酸組成的C端區(qū)(圖2)。 氨基酸序列的前三個氨基酸決定ω-醇溶蛋白的類型[9-10]，本研究推導得到的6個ω-醇溶蛋白序列包含ARH、ATN和TRQ三種類型(圖2)。與之前的報道[12-13]一致，本研究獲得的序列在中央重復區(qū)富含谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)，但是明顯缺乏含硫氨基酸，即缺乏半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)，本研究所得6個新序列中僅KR082150含有兩個甲硫氨酸。

盡管ω-醇溶蛋白序列比較保守，我們對克隆獲得的6條和已發(fā)表的3條ω-醇溶蛋白序列相互比對，結果發(fā)現，ω-醇溶蛋白序列的N端和C端之間均有部分差異。首先N端的前三個氨基酸變異較普遍，其大多是由堿基突變造成的，如編碼第一個氨基酸處的核苷酸G突變成A就會導致氨基酸丙氨酸(Ala)被蘇氨酸(Thr)取代(圖2)。而N端后半部分的序列相對比較保守，只有KR082150和JN092580兩條序列與其他相比差異較大，而這兩條序列恰好都是TRQ類型的ω-醇溶蛋白(圖2)。相比N端，ω-醇溶蛋白C端差異更大，不同的序列有自己專屬的C端，本研究所克隆的KR082150的C端類型在之前尚未見報道。此外，ω-醇溶蛋白C端的氨基酸數目也不盡相同，圖2展示了四種，C端的氨基酸數目分別為9、10、11和12，而我們克隆獲得的ω-醇溶蛋白序列有三種，C端的氨基酸數目分別為9、10和11。

2.3系統(tǒng)進化分析

為了研究ω-醇溶蛋白序列的進化關系，將本研究獲得的序列與NCBI數據庫目前已知的其中6個典型的ω-醇溶蛋白序列構建了系統(tǒng)進化樹，結果(圖3)發(fā)現，這些ω-醇溶蛋白序列分成了2個主要的分支。N端第一個氨基酸為丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一個大的分支中，包括ARH、ATN、ARE和ARQ四種類型，其中ATN類型的位于ARH類型之間，并且ARE類型的AF280605較ARQ類型的FJ561452距ARH類型更遠。另一個分支包括TRQ和SRL兩種類型，其中TRQ類型的KR082150和JN092581聚在了一個亞分支下，較SRL類的AB181301更近。由此可知，ω-醇溶蛋白的類型可能與進化相關，ω-醇溶蛋白以丙氨酸(Ala)開頭的可能來源相同，TRQ類型的較其他更為保守。

實線框表示序列存在較大差異；“---”表示本文不做分析的中央重復區(qū)序列；“·”表示此處沒有堿基

The variation in sequence marked with solid box；“---” represented the repetive domain sequence and not analyzed in this study;“·” represented no base here

圖2ω-醇溶蛋白的多序列比對

Fig.2Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of ω-gliadins

圖3　ω-醇溶蛋白的進化分析

3討 論

醇溶蛋白作為小麥籽粒貯藏蛋白中最豐富的組分之一，與麥谷蛋白一起對小麥的加工品質有重要影響[13]。目前，除了Hsia和Anderson[16]采用篩選λ基因組文庫法得到了少量ω-醇溶蛋白序列外，利用PCR技術獲得的ω-醇溶蛋白序列非常少[9-10,19-24]。因此對于新的更多的ω-醇溶蛋白序列的鑒定顯得尤為重要。在本研究中，我們從5個小麥屬物種中克隆出了ARH、ATN 和TRQ三種類型的6條新的ω-醇溶蛋白序列。由于其編碼區(qū)內均沒有發(fā)現內含子，并且都存在至少4個終止密碼子，所以這6條ω-醇溶蛋白序列被推斷為假基因。分析其終止密碼子的數目可以發(fā)現，二倍體的栽培一粒小麥和野生一粒小麥ω-醇溶蛋白氨基酸序列中的終止密碼子數目(8～9個)要顯著多于四倍體小麥(4～6個)。由于沒有前人確定性的結論，結合分析結果，我們推測，終止密碼子的出現可能會因染色體的組成而異,其具體規(guī)律有待進一步的研究。

眾所周知，ω-醇溶蛋白明顯缺乏含硫氨基酸[12-13]，正是基于這種原因，ω-醇溶蛋白無法利用分子間二硫鍵參與形成更大的分子，所以對面包的品質貢獻很小[5,13,22]。并且目前也有諸多報道指出，ω-醇溶蛋白的不合理缺失可能對小麥的品質有著較大的負面效應[25-27]。因此，為了提高小麥面粉的品質，增加ω-醇溶蛋白中的含硫氨基酸明顯比敲除ω-醇溶蛋白基因更有益處。本研究中獲得的ω-醇溶蛋白序列中KR082150擁有了兩個甲硫氨酸，因此，我們可以利用其序列設計引物擴增含硫氨基酸的ω-醇溶蛋白，一方面可以搜集更多的含硫ω-醇溶蛋白進行研究，另一方面還可以將更多的含硫ω-醇溶蛋白轉入普通小麥替換貧硫ω-醇溶蛋白。

由進化樹分析可知，ω-醇溶蛋白分成了2個主要的分支：以丙氨酸(Ala)開頭的ω-醇溶蛋白聚在了一個大的分支中，包括ATN 、ARH、ARE和ARQ四種類型；另一個分支包括TRQ和SRL兩種類型。因此，ω-醇溶蛋白的類型在進化中可能發(fā)揮著重要的作用，ω-醇溶蛋白以丙氨酸(Ala)開頭的可能來源相同，這為下一步研究ω-醇溶蛋白的進化提供了研究方向。

參考文獻：

[1]Lawrence G J,Shepherd K W.Variation in glutenin protein subunits of wheat [J].AustralianJournalofBiologicalSciences,1980,33(2):221-234.

[2]Payne P I,Holt L M,Jackson E A,etal.Wheat storage proteins: their genetics and their potential for manipulation by plant breeding [J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyofLondonB:BiologicalSciences,1984,304(1120):359-371.

[3]Shewry P R,Halford N G.Cereal seed storage proteins: structures,properties and role in grain utilization [J].JournalofExperimentalBotany,2002, 53(370):947-958.

[4]Ma W,Appels R,Bekes F,etal.Genetic characterzation of dough rheological properties in a wheat doubled haploid population: additive genetic effects and epistatic interactions [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2005,111(3):410-422.

[5]Wieser H.Chemistry of gluten proteins [J].FoodMicrobiology,2007,24(2):115-119.

[6]李玉閣,邢冉冉,李鎖平.栽培一粒小麥α-醇溶蛋白新基因的克隆與序列分析 [J].麥類作物學報,2012,32(3):387-392.

Li Y G,Xing R R,Li S P.Cloning and sequence analysis of new α-gliadin genes fromTriticummonococcum[J].JournalofTriticeaeCrops,2012,32(3):387-392.

[7]Gu Y Q,Crossman C,Kong X,etal.Genomic organization of the complex α-gliadin gene loci in wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2004,109(3):648-657.

[8]Chen F,Xu C,Chen M,etal.A new α-gliadin gene family for wheat breeding: somatic introgression line II-12 derived fromTriticumaestivumandAgropyronelongatum[J].MolecularBreeding,2008,22(4):675-685.

[9]Hsia C C,Anderson O D.Isolation and characterization of wheat ω-gliadin genes [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2001,103(1):37-44.

[10]Chen F,Yang L,Zhao F,etal.Molecular cloning and variation of ω-gliadin genes from a somatic hybrid introgression line II-12 and parents (Triticumaestivumcv.Jinan 177 andAgropyronelongatum) [J].JournalofGenetics,2011,90(1):137.

[11]Chen X,Chen G Y,Li W.Molecular cloning,sequencing and N-terminal amino acids sequence analysing of ω-gliadin fromT.turgidumsp.paleocolchicum[J].InternationalJournalofPlantBreedingandGenetics,2010,4(4):228-237.

[12]Tatham A S,Shewry P R.The S-poor prolamins of wheat,barley and rye [J].JournalofCerealScience,1995,22(1):1-16.

[13]陳凡國,夏光敏.一個小麥ω-醇溶蛋白基因同源序列的分離與序列分析 [J].遺傳,2005,27(6):941-947.

Chen F G,Xia G M.Isolation and sequence analysis of a ω-gliadin homologous gene from wheat [J].Hereditas,2005,27(6):941-947.

[14]Vader W,Stepniak D,Kooy Y,etal.The HLA-DQ2 gene dose effect in celiac disease is directly related to the magnitude and breadth of gluten-specific T cell responses [J].PNAS,2003,100(21):12390-12395.

[15]van Herpen T W J M,Goryunova S V,van der Schoot J,etal.Alpha-gliadin genes from the A,B,and D genomes of wheat contain different sets of celiac disease epitopes [J].BMCGenomics,2006,7(1):1-13.

[16]李 黎,劉凌云,李鎖平,等.普通小麥品種豫麥34和鄭豐5號ω-醇溶蛋白基因的克隆與序列分析 [J].麥類作物學報,2014,4(9):1178-1184.

Li L,Liu L Y,Li S P,etal.Cloning and sequence analysis of new ω-gliadin genes from common wheat(TriticumaestivumL.) cultivars Yumai 34 and Zhengfeng 5 [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,4(9):1178-1184.

[17]Ensari A,Marsh M N,Moriarty K J,etal.Studies in vivo of w-gliadins in gluten sensitivity (coeliac sprue disease) [J].ClinicalScience,1998,95:419-424.

[18]Tye-Din J A,Stewart J A,Dromey J A,etal.Comprehensive,quantitative mapping of T cell epitopes in gluten in celiac disease [J].ScienceTranslationalMedicine,2010,2(41):41-51.

[19]Masoudi-Nejad A,Nasuda S,Kawabe A,etal.Molecular cloning,sequencing,and chromosome mapping of a 1A-encoded ω-type prolamin sequence from wheat [J].Genome,2002,45(4):661-669.

[20]Matsuo H,Kohno K,Morita E.Molecular cloning,recombinant expression and IgE-binding epitope of ω-5 gliadin,a major allergen in wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis [J].FebsJournal,2005,272(17):4431-4438.

[21]Hassani M E,Shariflou M R,Gianibelli M C,etal.Characterization of a ω-gliadin gene inTriticumtauschii[J].JournalofCerealScience,2008,47:59-67.

[22]Zhuang Q,Zhang Z,Chen F,etal.Comparative and evolutionary analysis of new variants of ω-gliadin genes from three A-genome diploid wheats [J].JournalofAppliedGenetics,2012,53(2):125-131.

[23]李 敏,高 翔,陳其皎,等.小麥品種陜253 ω-醇溶蛋白基因的克隆及序列分析 [J].農業(yè)生物技術學報,2010,18(5):853-860.

Li M,Gao X,Chen Q J,etal.Cloning and sequence analysis of ω-gliadin genes from wheat variety Shaan 253 [J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2010,18(5):853-860.

[24]Waga J,Skoczowski A.Development and characteristics of ω-gliadin-free wheat genotypes [J].Euphytica,2014,195(1):105-116.

[25]Branlard G,Dardevet M.Diversity of grain proteins and bread wheat quality: I.Correlation between gliadin bands and flour quality characteristics [J].JournalofCerealScience,1985,3(4):329-343.

[26]Wang A,Gao L,Li X,etal.Characterization of two 1D-encoded ω-gliadin subunits closely related to dough strength and pan bread-making quality in common wheat (TriticumaestivumL.) [J].JournalofCerealScience,2008,47(3):528-535.

[27]Wrigley C W,Robinson P J,Williams W T.Associations between individual gliadin proteins and quality,agronomic and morphological attributes of wheat cultivars [J].CropandPastureScience,1982,33(3):409-418.

Cloning and Analysis of Novel ω-gliadin Sequences fromTriticumSpecies

LI Zenglin,WU Dandan,LI Hongyu,CHEN Gang,LIU Xiaojuan,NING Shunzong,LIU Dengcai,ZHANG Lianquan

(Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

Abstract:In order to exploit the potential value of ω-gliadin in wheat quality breeding,two pairs of primers were used to amplify the ω-gliadins from T. timopheevi Zhuk. var. araraticum,T.turgidum ssp. dicoccon,T. timopheevi,T.monococcum ssp. monococcum and T.monococcum var. boeoticum. Six novel ω-gliadin sequences were isolated,which belonged to three types:ARH,ATN and TRQ.The lengths of 6 sequences varied from 927 to 1 095 bp. Only KR082150 has two methionines,and the others have no cysteines and methionines.Phylogenetic analysis indicated that ω-gliadin sequences obtained in this study were mainly divided into 2 branches.The ARH and ATN types of ω-gliadin sequences were clustered together in one branch,while TRQ type of ω-gliadin sequence was clustered in the other branch.

Key words:Triticum species; ω-gliadin; Gene cloning; Phylogenetic analysis

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)03-0268-05

通訊作者：張連全(E-mail: zhanglianquan1977@126.com)

基金項目：國家自然科學基金項目(31271723，31201210); 四川省杰出青年基金項目(2011JQ0016); 四川省教育廳項目(14ZA0012)

收稿日期：2015-11-04修回日期：2015-12-19

網絡出版時間：2016-03-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160301.1338.004.html

第一作者E-mail: qlizenglinq@163.com(李增林); wudandan90@163.com(吳丹丹,與第一作者同等貢獻)