新型納米載體PEI-Fe3O4在鼻咽癌細胞基因轉染中的應用*

鄧　雯， 吳維敏， 亓立峰， 趙厚育

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽　550004； 2.同濟大學醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 婦產科， 上?！?00000； 3.同濟大學醫(yī)學院 納米院， 上?！?00000； 4.貴州醫(yī)科大學附院 耳鼻喉科， 貴州 貴陽　550004)

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新型納米載體PEI-Fe3O4在鼻咽癌細胞基因轉染中的應用*

鄧雯1， 吳維敏2， 亓立峰3， 趙厚育4**

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽550004； 2.同濟大學醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 婦產科， 上海200000； 3.同濟大學醫(yī)學院 納米院， 上海200000； 4.貴州醫(yī)科大學附院 耳鼻喉科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 構建聚乙烯亞胺(PEI)修飾的四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒,觀察其表征，探討其作為基因載體的可行性。方法： 用PEI-Fe3O4磁性納米粒包被質粒轉染鼻咽癌CNEII細胞，轉染miRNA-HIF-1α干擾質粒和miRNA-NC對照質粒分別為H組、NC組，空白對照組設為C組；用電子顯微鏡觀察H組和NC組納米粒的大小及表征，用熒光顯微鏡觀察H組和NC組轉染效率，用Real Time RT-PCR及Western Blot方法檢測低氧誘導因子-1α(HIF-1α)mRNA及蛋白表達的抑制情況。結果： 成功構建PEI-Fe3O4磁性納米粒；H組和NC組的轉染率分別為(63.6±4.2)%、(65.8±6.1)%，差異無統計學意義(P>0.05)；H組HIF-1α mRNA及蛋白表達抑制率與NC組、C組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論： PEI-Fe3O4磁性納米粒是一種較為理想的基因轉染載體。

[關鍵詞]乙烯亞胺-四氧化三鐵； 磁性納米粒； 基因轉染； 鼻咽癌； 缺氧誘導因子- 1α； 信使RNA

聚乙烯亞胺(poly ethylene imine，PEI)是一種水溶性的陽離子聚合物，是一種常被用做藥物投遞系統的經典非病毒載體，其轉染效率已被證實比大多數陽離子聚合物高[1]。四氧化三鐵(Fe3O4)是較為經典的磁性納米材料，具超順磁性，粒徑小，經PEI修飾的Fe3O4水溶性磁流體，也被證實可應用于藥物投遞、靶向基因治療，及生物醫(yī)學領域的多種研究[2-3]。因此，PEI-Fe3O4在鼻咽癌細胞的研究中可能成為一種理想的基因轉染載體。本研究擬將包被了干擾質粒的PEI-Fe3O4磁性納米粒轉染到鼻咽癌CNEII細胞中，觀察轉染后的各項指標，為納米材料作為新型基因治療載體在鼻咽癌細胞中應用的可能性提供依據。

1實驗方法

1.1試劑及主要儀器

FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、PEI購于上海朗順化工有限公司，RP1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于invitrogen公司，低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)抗體、Tubulin抗體及相關二抗均購于美國ABcam公司，小RNA(microRNA,miRNA)干擾質粒購于上海吉瑪公司，PCR試劑盒購于invitrogen公司。恒溫水浴鍋，電子稱量器，機械攪拌器購于德國Memmert公司，電泳儀及垂直電泳槽購于美國BioRad公司，熒光顯微鏡購于OLYMPUS公司，高速離心機購于Eppendorf公司，RT-PCR儀購于美國Biorad公司。

1.2干擾質粒

本研究所用干擾質粒購于上海吉瑪公司，miRNA-HIF-1α干擾質粒的靶序列為5′-GCAGGTCATAGTTTTGGCCACTG-3′，NC對照質粒的靶序列為5′-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′。各質粒均帶有綠色熒光蛋白(EGFP)。

1.3細胞培養(yǎng)與分組

鼻咽癌細胞株CNEII由上海復旦大學亓立峰教授實驗室贈與。于含有10%胎牛血清的RP1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。細胞分為3組，未轉染的CNEII細胞設為空白對照組(C組)；利用合成的納米顆粒PEI-Fe3O4轉染miRNA-HIF-1α干擾質粒及NC對照質粒分別設為H組及NC組。在細胞生長良好的情況下，以約1×105密度接種于六孔板中，待細胞完全貼壁，細胞密度達40%時利用轉染介質轉染相應質粒進行干預處理。

1.4PEI-Fe3O4納米載體的制備

取8 mmol水楊酸與10 mL水混合，用1 mol/L NaOH中和水楊酸，并調PH值為11。稱取FeCl20.254 g，FeCl30.65 g，分別溶于5 mL水。將FeCl2、FeCl3溶液加入到配置好的水楊酸溶液中，溶液變成黑色，在氮氣保護下，冷凝回流，機械攪拌，90 ℃條件下反應4 h。吸取PEI6.0 g，用10000透析袋透析2 d，每4～5 h換1次水，透析除去雜質。最后收得25000PEI 9.25 mmol/L。取PEI 10 mmol/L、Fe3O41 mmol/mL等體積渦旋混勻，即得。用電子顯微鏡觀察H組和NC組納米粒的大小及表征。

1.5轉染效率的檢測

在CNEII細胞生長良好的情況下，以約1×105密度接種于六孔板中，待細胞完全貼壁，細胞密度達40%時利用不同轉染介質轉染相應質粒進行干預處理。待轉染48 h后予熒光顯微鏡下觀察質粒所帶EGFP的表達情況，進行細胞計數，計算轉染效率。

1.6轉染后CNEII細胞HIF-1α蛋白表達抑制

Western Blot檢測轉染后CNEII細胞HIF-1α蛋白表達抑制情況。在轉染后72 h收集細胞，常規(guī)PBS洗滌后提取蛋白，12%及8%聚丙酰胺凝膠恒壓分離蛋白，常規(guī)轉膜及封閉后加入HIF-1α一抗(1∶2 000)、及Tubulin一抗(1∶5 000)4 ℃過夜孵育，經過常規(guī)TBST洗滌后加入相應二抗室溫孵育1 h，顯影、定影、洗滌后觀察結果，計算抑制率，抑制率=(對照組相對灰度值-干擾組相對灰度值)/對照組相對灰度值×100%。

1.7轉染后CNEII細胞HIF-1α蛋白表達抑制

Real Time RT-PCR檢測轉染后CNEII細胞HIF-1α蛋白表達抑制情況。在轉染后48～72 h收集細胞，提取總RNA，HIF-1α基因上游引物序列為5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′，下游引物序列為5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′。以β-actin作為對照。RT-PCR反應條件為：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 10 s; 60 ℃ 10 s; 70 ℃ 10 s，共40個循環(huán)；70 ℃ 10 min。實時熒光定量檢測mRNA表達，計算抑制率，抑制率=(對照組2-ΔΔCT值-干擾組2-ΔΔCT值)/對照組2-ΔΔCT值×100%。

1.8統計學方法

2結果

2.1納米載體形態(tài)

電鏡下觀察不同放大倍數PEI-Fe3O4磁性納米尺寸在100 nm，粒子似球形，分散性好，見圖1。

2.2納米載體轉染效率

NC組、H組的轉染率分別為(65.8±6.1)%、(63.6±4.2)%，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖1　PEI-Fe3O4磁性納米粒(×300 000)Fig.1　Electron microscope pictures of PEI-Fe3O4 nanoparticles

注：A為轉染NC對照質粒，B為轉染HIF-1α干擾質粒圖2　CNEII細胞轉染NC或HIF-1α后的光鏡及熒光圖片的轉染情況(40×)Fig.2　Light and fluorescent microscope pictures of group CNEII cell transfection NC or HIF-1α

2.3轉染后HIF-1α蛋白表達

H組蛋白表達抑制率為69.4%，與NC組、C組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

(1)與C組比較，P<0.05；(2)與NC組比較，P<0.05圖3　CNEII細胞轉染miRNA-HIF-1α質粒后蛋白的表達Fig.3　Expression of protein levels of CNEII cells after transfected with miRNA-HIF-1α plasmid

2.4轉染后HIF-1α mRNA表達

H組HIF-1αmRNA表達抑制率為63.0%，與C組及NC組比較,差異具有統計學意義(P>0.05)，見圖4。

(1)與C組比較，P<0.05；(2)與NC組比較，P<0.05圖4　CNEII細胞系轉染miRNA-HIF1α質粒后目的基因mRNA表達Fig.4　Expression of HIF-1α mRNA levels of CNEII cells after transfected with plasmids

3討論

基因治療是治療癌癥及其他病癥的常用研究手段，而要將外源性基因導入到靶細胞中則必須要有載體的幫助，經典的載體包括病毒載體和非病毒載體，病毒作為載體有其獨特的優(yōu)勢，其在靶細胞內表達穩(wěn)定，轉染率高，但其免疫原性、細胞毒性反應可對靶細胞造成進一步傷害。有報道稱病毒載體有潛在的致基因突變的作用，這使病毒載體在臨床中的應用被限制[4]。通常非病毒載體主要是指脂質體(Lipofectamine)，相比于病毒載體而言，其具有方便獲取、無毒的特點，是一種方便快速的轉染載體，在體外研究時可發(fā)揮快速準確的作用，但是其對細胞具有毒性作用，限制了其在體內研究甚至臨床試驗中的廣泛應用[5]。

納米材料作為一種新型的生物材料，近年來已被廣泛應用到醫(yī)學、生物、化學等領域，其低毒性、無免疫原性等特點在醫(yī)學領域有著令人矚目的潛能，被應用于基因治療、藥物投遞系統、增加靈敏性檢測等領域的研究[6-8]。在胰腺癌細胞、肝癌細胞等癌細胞系中，納米顆粒已被證實可以作為RNA干擾的載體成功影響細胞系的生物學效應[9-11]。有報道稱納米材料作為載體負載小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)轉染到活細胞時，相比于lipofectamine，在敲除相同基因的目的下，能更好的保護siRNA不被降解，同時具有更好的細胞膜穿透性[12-13]。

常用的納米載體包括殼聚糖、白蛋白等。磁性納米粒在磁場中具有良好的響應性及導向性，不僅在藥物投遞等傳統方法中發(fā)揮作用，也使其在核磁成像的診斷中發(fā)揮作用[14]。磁性納米粒不僅可用于轉染等基因治療，其亦可包裹化療藥物，通過納米粒表面配體的設計，使其更好的靶向性導入腫瘤細胞，實現放化療治療的一體化。本實驗曾使用多種納米材料，如殼聚糖等作為轉染介質，因其轉染率低而改為PEI-Fe3O4磁性納米粒，考慮一是因為細胞類型，各種納米載體對其親和力不同，二是因PEI可以包裹DNA穿過細胞膜而進入細胞，加之Fe3O4毒性較小，故最終選用PEI-Fe3O4磁性納米粒。本實驗中所使用的PEI-Fe3O4磁性納米粒采用傳統方法合成，其穩(wěn)定性好，分散性佳，具超順磁性。作為載體在鼻咽癌細胞中能有較高的轉染率，Real Time RT-PCR及Western Blot檢測結果表明，包被miRNA-HIF-1α質粒的PEI-Fe3O4磁性納米粒能有效抑制HIF-1αmRNA及蛋白的表達。

本研究首次在鼻咽癌細胞中應用PEI-Fe3O4磁性納米粒作為載體轉染干擾質粒，并在體外證實了其能有效轉染鼻咽癌細胞，雖然目前尚缺乏體內實驗的研究，其效率及后續(xù)生物學作用仍有待于后續(xù)體內實驗進一步探索，但PEI-Fe3O4磁性納米粒作為載體，其無免疫原性、細胞毒性等的特點無疑將成為體內實驗中的閃光點。

4參考文獻

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(2016-01-03收稿，2016-04-08修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Application of PEI-Fe3O4Nanoparticles as Novel Carrier in Gene Transfection in Nasopharyngeal Carcinoma

DENG Wen1, WU Weimin2, QI Lifeng3, ZHAO Houyu4

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China； 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，TongjiHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofTongjiUniversity,Shanghai200000，China； 3.InstituteofBiomedicalEngineeringandNanoScience，MedicalCollegeofTongjiUniversity,Shanghai200000，China； 4.DepartmentofOtorhinolaryngology，theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To construct PEI-Fe3O4 nanoparticles and observe its characteristics, and to investigate the feasibility of PEI-Fe3O4 nanoparticles as carrier in transfection. Methods: Plasmids coated with PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticels were transfected into CNEII cells, cells transfected with miRNA-HIF-1α plasmid as group H while cells transfected with miRNA-NC plasmid as NC group, and CNEII cells without transfection served as C group. Observing size and morphology of PEI-Fe3O4 nanoparticles with scanning electronic microscope. Using fluorescence microscope to measure efficiency of transfection. Proteins were detected by western blot and mRNAs were detected by RT-PCR. Results: PEI-Fe3O4 was successfully constructed. The transfection efficiency of group H and group NC was (63.6±4.2)% and (65.8±6.1)%,difference was not statistically significant(P>0.05). The difference of suppression ratio of protein and mRNA of HIF-1α was significant compared to group C and group NC(P<0.05). Conclusion: PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles can be used as an ideal carrier of gene transfection.

[Key words]PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles； gene transfection； nasopharyngeal carcinoma； hypoxia inducible factor-1α； message RNA

[中圖分類號]R34-33; R739.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0382-05

*[基金項目]國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(NO.81260353)

**通信作者 E-mail:zhaohouyujia@163.com

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1755.008.html