臨床副溶血弧菌血清型及基因分型特征研究

印曉靜，徐　薇，韓東升

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇揚(yáng)州 225001)

?

·論著·

臨床副溶血弧菌血清型及基因分型特征研究

印曉靜，徐薇△，韓東升

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇揚(yáng)州 225001)

摘要:目的了解本地區(qū)腹瀉患者中副溶血弧菌(VP) 血清型及分子分型特征，為VP感染的防控提供科學(xué)參考。方法對2010～2014年收集到的62菌株進(jìn)行血清型分型；采用PCR檢測溶血素相關(guān)毒力基因(tdh和trh)；利用多位點序列分型(MLST)進(jìn)行分子分型。 結(jié)果62株菌株分屬7種不同的血清型，O3∶K6型居首，共46株，占74.19%，其次是O4∶K68(6株)。毒力相關(guān)基因檢測發(fā)現(xiàn)tdh陽性株占95.16% (59株)，而trh陽性者僅3株。分子分型確定7種STs，其中ST3型占85.50% (53株)，其他ST型散在分布。結(jié)論O3∶K6血清型VP是本地區(qū)最主要的分離株，大多攜帶tdh毒力基因，ST3型是優(yōu)勢流行型別。

關(guān)鍵詞:副溶血弧菌；毒力基因；血清型；基因分型

副溶血弧菌(VP) 是一種在世界沿海國家和地區(qū)流行較為廣泛的一種食源性致病菌，主要導(dǎo)致人類的急性腹瀉。VP感染威脅著公眾健康并為患者帶來了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，在美國，每年平均有34 664(18 260～58 027)例VP感染事件，病死率約0.9%[1]。在日本、中國臺灣和越南等地，大約一半的食源性暴發(fā)事件由VP引起[2-3]。我國的食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，VP感染暴發(fā)事件居微生物食源性疾病爆發(fā)的首位[4]。本研究收集了臨床腹瀉患者的糞便標(biāo)本，開展VP的血清型及基因分型特征研究，通過血清分型、毒力基因檢測及多位點序列分型(MLST)，探討臨床VP的流行特點，為防控VP感染提供參考依據(jù)。

1資料與方法

1.1菌株來源標(biāo)本來源于本地區(qū)2010～2014年的急性腹瀉患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：每日排便不少于3次，且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、黏液/膿液便或膿血便等)，病程不超過14 d。

1.2方法

1.2.1菌株的分離及鑒定標(biāo)本采集后直接接種于堿性蛋白胨水進(jìn)行增菌，VP的分離培養(yǎng)與鑒定按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[5]進(jìn)行。采用法國生物梅里埃公司產(chǎn)品VITEK2 Compact 微生物鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.2血清分型購買日本生研株式會社生產(chǎn)的VPO、K抗原分型診斷血清，用玻片凝集法進(jìn)行O、K血清型鑒定，具體操作步驟嚴(yán)格按照操作說明書。

1.2.3毒力基因檢測將分離鑒定的VP菌株，純培養(yǎng)后制備成菌懸液，煮沸法提取菌株DNA模板,毒力基因tdh和trh的引物序列及反應(yīng)條件參考以往報道[6]。

1.2.4MLST62株臨床來源的VP進(jìn)行MLST分析。實驗方法參照pubMLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：對VP的7個管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC和tnaA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測序結(jié)果與pubMLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得各管家基因位點的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型(ST)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2結(jié)果

2.1血清型分布62株VP分為7種不同的血清型，以O(shè)3∶K6為主，有46株，占74.19%，其次是O4∶K68(6株)，O1∶K56(3株)和OUT∶KUT(3株)；2株為O4∶KUT；O1∶KUT和O3∶KUT各1株，見表1。OUT指O血清型未能鑒定；KUT指K血清型未能鑒定。

2.2毒力相關(guān)基因分布 對62株VP進(jìn)行tdh和trh毒力基因擴(kuò)增59株(95.16%)分離菌攜帶tdh基因，而trh陽性株僅3株。具體組合基因型表現(xiàn)為：tdh(+)trh(-)菌株56株，tdh(+)trh(+)菌株3株,tdh(-)trh(-)菌株3株。見表1。

表1　　62株VP血清型及毒力相關(guān)基因分布情況(n)

2.3MLST62株VP分屬于7種STs，其中ST3共53株，占85.50%，ST8 3株，ST120 2株，其他4種ST型(ST69、ST527、ST332和ST417) 各1株。見表2。

表2　　62株VP MLST分析(n)

3討論

VP是我國東南沿海地區(qū)一個重要的食源性致病菌[7]。目前，VP共有約75種血清型與人類腹瀉有關(guān)。1996年2月以來，一種新的具有特種基因型別的O3∶K6血清型菌株在亞洲、美洲、非洲和歐洲的國家和地區(qū)發(fā)生大規(guī)模的洲際流行[8]。在我國，O3∶K6型菌株也是最主要的血清克隆群[7]。本研究共發(fā)現(xiàn)7種血清型，其中O3∶K6型是最重要的血清型，占74.19%；其次是O4∶K68 (6株) 和O1∶K56 (3株)，和世界許多國家流行的血清型基本一致。本研究中3株菌(OUT:KUT)未能鑒定出O和(或)K血清型，可能與菌株本身在宿主體內(nèi)容易發(fā)生血清抗原轉(zhuǎn)變有關(guān)，這些菌株需要進(jìn)一步的研究來明確其基因分型特征。

tdh被認(rèn)為是VP的最主要的毒力因子，本研究中分離到的絕大多數(shù)VP菌株表現(xiàn)為tdh陽性和trh陰性，只有3株同時攜帶tdh和trh基因，這說明了tdh是本地區(qū)VP最主要的致病因子。同時，還發(fā)現(xiàn)3株菌均未攜帶tdh和trh基因，這種現(xiàn)象在其他研究結(jié)果中也有報道[9]，所以推測，VP致病性除了與tdh和trh有關(guān)外，這些表現(xiàn)為兩者均陰性的菌株還可能存在的其他獨立致病因子。但是，不能排除患者的體內(nèi)同時存在的其他致病性微生物的混合感染，而這些其他微生物才是真正致病的元兇，在被檢出的情況下，這些本不致病的VP菌株誤被當(dāng)成了致病菌。所以，臨床標(biāo)本中檢測到的tdh陰性和trh陰性的菌株到底是不是真正的致病菌以及其的致病性強(qiáng)度還有待進(jìn)一步分析。

隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，多種細(xì)菌分型技術(shù)如血清學(xué)分型、噬菌體分型及脈沖場凝膠電泳(PFGE)等被廣泛應(yīng)用于副溶血性弧菌的分型研究，在VP的疾病預(yù)防和暴發(fā)的防控中起著非常重要的作用。MLST是一種較新的分子分型方法，以細(xì)菌基因組中管家基因的序列分析為基礎(chǔ)，具有較高的分辨率和識別度，能更好地理解菌株間的遺傳親緣關(guān)系以及基因水平轉(zhuǎn)移對細(xì)菌進(jìn)化的重要性。本研究對62株VP進(jìn)行了MLST分析，共分出7種STs，其中ST3共53株，占85.50%，是優(yōu)勢型別，但同時又存在著多種亞型。

綜上所述，本研究通過開展本地區(qū)急性腹瀉人群中VP的研究，獲得了VP血清型構(gòu)成情況；同時通過開展毒力相關(guān)基因檢測及MLST分子分型研究，為VP的致病機(jī)制及分子流行病學(xué)研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)支持，為更好地做到VP感染性腹瀉的防控和預(yù)警提供了重要的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Scallan E,Hoekstra RM,Angulo FJ,et al.Foodborne illness acquired in the United States——major pathogens[J].Emerg Infect Dis,2011,17(1):7-15.

[2]Chowdhury A,Ishibashi M,Thiem VD,et al.Emergence and serovar transition of Vibrio parahaemolyticus pandemic strains isolated during a diarrhea outbreak in Vietnam between 1997 and 1999[J].Microbiol Immunol,2004,48(4):319-327.

[3]Bhuiyan NA,Ansaruzzaman M,Kamruzzaman M,et al.Prevalence of the pandemic genotype of Vibrio parahaemolyticus in Dhaka,Bangladesh,and significance of its distribution across different serotypes[J].J Clin Microbiol,2002,40(1):284-286.

[4]沈志英，高文潔，王恒輝，等．2001～2009年細(xì)菌性食物中毒病原菌檢測結(jié)果分析[J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38(1)：30-31．

[5]葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜．全國臨床檢驗操作規(guī)程[M]．3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006．

[6]Bej AK,Patterson DP,Brasher CW,et al.Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl,tdh and trh[J].J Microbiol Methods,1999,36(3):215-225.

[7]Li Y,Xie X,Shi X,et al.Vibrio parahaemolyticus,Southern Coastal Region of China,2007-2012[J].Emerg Infect Dis,2014,20(4):685-688.

[8]Matsumoto C,Okuda J,Ishibashi M,et al.Pandemic spread of an O3∶K6 clone of Vibrio parahaemolyticus and emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS sequence analyses[J].J Clin Microbiol,2000,38(2):578-585.

[9]Okuda J,Ishibashi M,Hayakawa E,et al.Emergence of a unique O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus in Calcutta,India,and isolation of strains from the same clonal group from Southeast Asian travelers arriving in Japan[J].J Clin Microbiol,1997,35(12):3150-3155.

Serotyping and genotyping study of clinical Vibrio parahaemolyticus*

YinXiaojing,XuWei△,HanDongsheng

(DepartmentofLaboratoryMedicine,NorthernJiangsuPeople′sHosptial，Yangzhou,Jiangsu225001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the distribution and molecular characteristics of Vibrio parahaemolyticus(VP) in patients with acute diarrhea,and provide a scientific basis for the prevention and control of VP infection.MethodsFrom 2010 to 2014，62 VP isolates were collected from patients with acute diarrhea,for serotyping and virulence gene (tdh and tdh) detection of VP.Molecular characteristics analysis was carried out by using multi-locus sequence typing (MLST).Results7 different serotypes were found from the 62 isolates.O3∶K6 was the most common serotype of VP,accounting for 74.19% (46 isolates),followed by O4∶K68 (6 isolates).Tdh gene was the mainly virulence gene,with a percentage of 95.16% (59 isolates),only three isolates were trh positive.7 STs were found through MLST analysis of 62 VP isolates,among which,ST3 was the most important type,accounted for 85.50% (53 isolates).ConclusionO3∶K6 serotype VP was the most prevalent type.Tdh gene is the most important virulence gene of WP.ST3 was the the dominant epidemic type.

Key words:vibrio parahaemolyticus;serotyping;virulence;genotyping

(收稿日期：2016-01-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.005

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1028-02

作者簡介：印曉靜，女，主管檢驗技師，主要從事臨床檢驗方面的研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:842371507@qq.com。