生物樣品中阿霉素的分析方法優(yōu)化研究

劉匡一　彭秘　李晗蕓　劉亞麗　蘇丹

摘 要 目的：運(yùn)用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)對(duì)阿霉素體內(nèi)血漿分析方法進(jìn)行優(yōu)化，為更好地對(duì)藥物進(jìn)行體內(nèi)血漿藥物定量分析奠定基礎(chǔ)。 方法：液相方面，考察不同的色譜柱，從中選擇響應(yīng)好的作為分析的色譜柱，同時(shí)，以高響應(yīng)為前提，選擇合適流動(dòng)相和梯度條件；對(duì)于質(zhì)譜，選擇母離子和子離子，優(yōu)化碰撞電壓、毛細(xì)管電壓等參數(shù)；進(jìn)樣前，對(duì)血漿樣品的前處理中提取條件方面進(jìn)行優(yōu)化，篩選出合適的萃取有機(jī)溶劑并選擇合適的內(nèi)標(biāo)。結(jié)果：該方法快速、靈敏、有效，適合阿霉素的體內(nèi)血漿藥物定量分析。

關(guān)鍵詞 阿霉素 分析方法 生物樣品

中圖分類號(hào)：R914.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2016.02.068

Abstract Objective： LC-MS （high performance liquid chromatography mass spectrometry） method was used to optimize the plasma analysis method in vivo， and to lay the foundation for the quantitative analysis of drugs in vivo. Methods： In Liquid phase. The effects of different chromatographic column， the selection response as a chromatographic column. At the same time， with high response as the premise， select the appropriate mobile phase and gradient conditions； parameters for mass spectrometry， select the parent ion and ion， optimization of impact voltage and capillary voltage is needed； sampling of the extraction conditions were optimized and screened a suitable organic solvent extraction and choose the appropriate internal standard. Results： This method is fast， sensitive and effective， and is suitable for the quantitative analysis of Adriamycin in vivo.

Key words adriamycin； analysis method； biological samples

阿霉素，又稱多柔比星，可抑制RNA 和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，①抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，對(duì)各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。是臨床常用的蒽環(huán)類抗惡性腫瘤的藥物，可廣泛用于肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等的化療。②

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high-performanceliq id chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是以高效液相色譜為分離手段，以質(zhì)譜為鑒定工具的一種分離分析技術(shù)。它將高效液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，在中藥研究中得到廣泛應(yīng)用。③④質(zhì)譜是強(qiáng)有力的結(jié)構(gòu)解析工具，能為結(jié)構(gòu)定性提供較多的信息，是理想的色譜檢測器，不僅特異，而且具有極高的檢測靈敏度。⑤串聯(lián)質(zhì)譜（MS /MS）在單極質(zhì)譜給出化合物相對(duì)分子量的信息后，對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多極裂解，進(jìn)而獲得豐富的化合物碎片信息，確認(rèn)目標(biāo)化合物，對(duì)目標(biāo)化合物定量等。⑥本文通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）數(shù)據(jù)采集方式對(duì)阿霉素母離子和子離子進(jìn)行掃描確認(rèn)，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，為血漿樣品的分析奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-MS ：安捷倫的1290 Infinity快速液相色譜 安捷倫6460三重四極桿MS / MS；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； BF-200 氮?dú)獯蹈蓛x（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

1.2 試劑

阿霉素鹽酸鹽（批號(hào)246-818-3）為標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sigma公司；長春新堿（批號(hào)3924631）為標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物，購自Sigma公司；甲酸為色譜純，購自Sigma-Aldrich公司；乙腈為色譜純，購自Fisher Scientific公司；丙酮為分析純，購自廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心；乙醚為分析純，購自上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；二氯甲烷為分析純，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；異丙醇為色譜純，購自Fisher Scientific公司。

2 色譜條件優(yōu)化

2.1 色譜柱的篩選

本研究對(duì)3個(gè)不同廠家不同型號(hào)的4根色譜柱（Phenomenex L na C18 4 m 50？.1mm；Waters C18 1.7 m 50？.1mm；Angilent Proshe C18 2.7 m 75？.1mm；Waters XSELECTTM CSHTM C18 5 m 50？.6mm）進(jìn)行了測試。

2.2 流動(dòng)相梯度條件的選擇

合適的流動(dòng)相及梯度條件時(shí)保證分析測定準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的前提，本實(shí)驗(yàn)分別考察水相，有機(jī)相及梯度對(duì)生物樣品中阿霉素測定的影響。

2.3 血漿樣品的前處理

考察沉淀蛋白法和液-液萃取法兩種類型的樣品前處理方法。對(duì)于萃取溶劑考察了二氯甲烷與異丙醇（4：1）、二氯甲烷、丙酮、乙醚。

在沉淀蛋白法中，取100 L空白血漿，加入高，中，低三種不同濃度的阿霉素（0.025 g/ml、0.5 g/ml、1 g/ml），同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)與乙腈， 振蕩渦旋（3min），離心（16000rpm，10min），取上清200 L進(jìn)樣，每個(gè)不同的濃度各平行三份。

對(duì)于液-液萃取法，取100 l空白血漿，加入高，中，低三種不同濃度（同上）的阿霉素，同時(shí)分別加入內(nèi)標(biāo)與萃取溶劑（二氯甲烷與異丙醇（4：1）、二氯甲烷、丙酮、乙醚）， 振蕩渦旋（3min），離心（16000rpm，10min），取上清200 L，進(jìn)樣，每個(gè)不同的濃度各平行三份。

2.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

為了以后更好地定量分析體內(nèi)血漿藥物濃度，選擇恰當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)應(yīng)不影響藥物的結(jié)構(gòu)，不與藥物發(fā)生反應(yīng)，出峰時(shí)間應(yīng)與藥物有明顯的區(qū)別。

3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究對(duì)血漿中阿霉素?cái)?shù)據(jù)的采集采用MRM方式，考察了阿霉素的母離子與子離子，并優(yōu)化了進(jìn)樣條件下質(zhì)譜的毛細(xì)管電壓與碰撞氣能。

4 結(jié)果

4.1 色譜柱選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Waters XSELECTTM CSHTM C18（5 m 50 ？4.6mm）柱最適合進(jìn)行分離，所獲得的色譜峰最佳，保留時(shí)間合適，且顯著避免了峰的拖尾。典型色譜圖如圖1。

4.2 流動(dòng)相選擇

4.2.1 水相及其pH 值對(duì)色譜行為的影響

流動(dòng)相pH 值對(duì)樣品的分離有較大影響，調(diào)低pH 值后，便得到尖銳的峰型。向流動(dòng)相中加入少量甲酸，可以使待測組分的離子化程度增加，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度增大；而且，流動(dòng)相酸性的增加，可以減少由于待測物分子結(jié)構(gòu)中堿性胺基側(cè)鏈與硅膠柱中未完全硅烷化的硅醇基相互作用所導(dǎo)致的色譜峰拖尾和峰展寬現(xiàn)象，使化合物快速被洗脫，從而縮短了每次的分析時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了生物樣品分析所要求的靈敏、快速和高通量測定。

4.2.2 流動(dòng)相梯度條件的選擇

為了使所檢測的色譜峰分離度好，出峰時(shí)間合理，采用梯度洗脫方法。阿霉素極性相對(duì)較小，適宜在乙腈比例較大的系統(tǒng)中分離，為了保證待測物與內(nèi)標(biāo)較好的峰型和適合的保留時(shí)間，同時(shí)避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了不同梯度比例的優(yōu)化，最終確定 0 min 到2.5min 范圍內(nèi)，水相比例由75%到10%，再回到75%，色譜柱平衡2.5min。在此梯度條件下阿霉素與內(nèi)標(biāo)可同時(shí)測定，峰型較好，符合測定要求同時(shí)又節(jié)了省分析時(shí)間。

4.3 提取條件選擇

通過對(duì)各萃取溶劑所得峰形與提取效率的比較，最終選擇萃取劑為二氯甲烷：異丙醇（4：1）。各溶劑的提取效率見表1。

表1 各提取溶劑下阿霉素的峰面積響應(yīng)值

4.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)該與待測組分理化性質(zhì)比較接近，在待測物的色譜條件、樣品處理過程中都能保持與待測物的一致性。在提取的過程中，內(nèi)標(biāo)應(yīng)該能追蹤待測組分，以補(bǔ)償待測組分提取回收率改變所發(fā)生的變化。根據(jù)以上內(nèi)標(biāo)選擇原則，本實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)標(biāo)物，選擇了與阿霉素相似，具有一分子伯胺基的長春新堿，其提取條件、衍生過程及衍生物的色譜保留行為均與阿霉素十分相近，從而有效保證了定量分析方法的精密與準(zhǔn)確。

4.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究采用的離子源為ESI，正離子模式，數(shù)據(jù)采集采用MRM 方式。阿霉素和內(nèi)標(biāo)的分子結(jié)構(gòu)中均含有堿性基團(tuán)，經(jīng)考察后發(fā)現(xiàn)正離子方式檢測相對(duì)于負(fù)離子方式檢測能夠得到更好的質(zhì)譜響應(yīng)，因此選用了正離子方式檢測。

（下轉(zhuǎn)第190頁）（上接第146頁）

（1）母離子和子離子的選擇。阿霉素分子結(jié)構(gòu)中因?yàn)楹幸粋€(gè)氨基，氨基易得一氫離子生成氨根正離子，所以母離子為（m/z 544.2）在選擇阿霉素離子時(shí)，由于碳雜鍵容易斷裂，斷裂生成的離子（m/z 360.9）穩(wěn)定且信號(hào)強(qiáng)。

（2）毛細(xì)管電壓的選擇。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)阿霉素對(duì)照品在毛細(xì)管電壓大小約125v 時(shí)的電離效果較好，電壓減小會(huì)影響化合物的電離效果，降低響應(yīng)信號(hào)。

（3）碰撞氣能的選擇。碰撞氣是母離子裂解產(chǎn)生子離子的一個(gè)重要條件，當(dāng)碰撞氣流速大小設(shè)定在30v 時(shí)，信號(hào)響應(yīng)比較穩(wěn)定。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)完成了對(duì)血漿中阿霉素分析方法優(yōu)化的研究，確定了Waters XSELECTTM CSHTM C18（5 m 50？.6mm）色譜柱，內(nèi)標(biāo)長春新堿、合適的濃度梯度和準(zhǔn)確的質(zhì)譜參數(shù)，在選擇提取溶劑方面，篩選了四種有機(jī)溶劑，確定了萃取劑為二氯甲烷：異丙醇 4：1的溶液，并再一次在此基礎(chǔ)上優(yōu)化生物樣品復(fù)溶方法，使色譜峰的峰型更好，響應(yīng)更高。通過以上實(shí)驗(yàn)，最終確定了最優(yōu)的色譜，質(zhì)譜條件，解決了峰展寬和拖尾的問題，并能夠滿足快速、靈敏、高通量的阿霉素血漿生物樣品分析測試要求。

通訊作者：劉亞麗，蘇丹

注釋

① Cutts S M， Phillips D R. Use of oligonucletides to define the site of interstand cross-links induced by Adriamycin[J]. Nucleic acids research，1995.23（13）：2450-2456.

② Young R C， Ozols R F， Myers C E. The anthracycline antineoplastic drugs[J].New England Journal of Medicine，1981.305（3）：139-153.

③ 劉麗芳.藥品標(biāo)準(zhǔn)中 HPLC 法色譜條件的優(yōu)化與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的重要性[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005.6（1）：3-6.，

④ 邵清松，胡潤淮.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007.35（3）：44-47.

⑤ 龐煥，文允鎰.質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究進(jìn)展及其在藥物分析中的最新應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，2004.36（7）：433-435.

⑥ 李忠紅，王玉，倪坤儀.LCMSn在藥物分析中的應(yīng)用[J].藥物分析雜志，2004.24（3）：341-344.