類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血小板參數(shù)變化可能與BTLA、Treg表達(dá)失衡有關(guān)

朱福兵 劉健 方利 談冰 章平衡

【摘 要】目的：觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者血小板參數(shù)和B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的變化，并初步探討其機(jī)制。方法：選取604例RA患者及60例健康者分別為RA組和正常對照組。采用全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定患者血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血小板比容（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板平均容積（MPW）；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血BTLA、Treg表達(dá)頻率；采用魏氏法測定紅細(xì)胞沉降率（ESR），全自動(dòng)生化儀測定免疫球蛋白（Ig）、超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）等炎癥指標(biāo)，并計(jì)算關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評分（DAS28）。結(jié)果：①604例RA患者血小板參數(shù)至少一項(xiàng)異常者367例（60.96%），2項(xiàng)同時(shí)異常者181例（29.97%），3項(xiàng)同時(shí)異常者55例（9.11%），4項(xiàng)全部異常者12例（1.99%）。②與正常對照組比較，RA患者ESR、hs-CRP、類風(fēng)濕因子（RF）、抗CCP抗體、DAS28、IgM、IgG明顯升高，外周血BTLA、Treg表達(dá)頻率顯著降低（P < 0.01或P < 0.05）；③與血小板參數(shù)正常組比較，血小板參數(shù)異常組病程、PLT、PCT、MPV、ESR、RF、hs-CRP、抗CCP抗體、IgG明顯升高，BTLA、Treg明顯降低（P < 0.01或P < 0.05）；④相關(guān)性分析顯示，RA患者PLT與DAS28、ESR、hs-CRP、抗CCP抗體、IgG、Treg呈正相關(guān)，與BTLA呈負(fù)相關(guān)；PCT與ESR、hs-CRP、RF、IgM呈正相關(guān)，與BTLA、Treg呈負(fù)相關(guān)；PDW與ESR、CCP呈正相關(guān)，與BTLA呈負(fù)相關(guān)；MPV與RF呈正相關(guān)，與BTLA、Treg呈負(fù)相關(guān)（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：RA患者普遍存在血小板參數(shù)的異常，且與疾病的活動(dòng)度顯著相關(guān)，伴有血小板參數(shù)升高的RA患者病情更重，疾病活動(dòng)度較高，其機(jī)制可能與BTLA或Treg表達(dá)減少，導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂，炎癥因子表達(dá)失衡，造成血液系統(tǒng)損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；血小板參數(shù)；BTLA；Treg

On the Probable Relationship between the Changes of Platelet Parameters and the Imbalanced Expressions of BTLA and Treg in Patients with Rheumatoid Arthritis

ZHU Fu-bing，LIU Jian，F(xiàn)ANG Li，TAN Bing，ZHANG Ping-heng

【ABSTRACT】Objective：To observe the probable relationship between the changes of platelet parameters and the imbalanced expressions of B，T lymphocyte attenuation factor（BTLA）and Treg in patients with rheumatoid arthritis（RA）and to explore the mechanism of them.Methods：Six hundred and four RA patients and sixty healthy people were selected as a RA group and a normal control group.The blood counting instrument was used to determine the blood platelet count（BPC），thrombocytocrit，platelet distribution width（PDW） and mean platelet volume（MPV）.The flow cytometry was used to detect the expression frequency of BTLA and Treg in outer peripheral blood.And the Westergren method was used to determine the erythrocyte sedimentation rate（ESR）.The immunoglobulin（Ig）and high-sensitivity C-reactive protein were measured by automatic biochemical analyzer，calculating activity score（DAS28）of joint diseases.Results：① Out of the 604 cases，367 cases were abnormal in at least 1 parameter（60.96%），181 cases were abnormal in both 2 parameters（29.97%），55 cases were abnormal in 3 parameters（9.11%），and 12 cases were abnormal in all the 4 cases（1.99%）.② Compared with the normal control group，the ESR，hs-CRP，rheumatoid factor（RF），anti CCP antibody and IgG in RA patients increased significantly，while the expression frequency of BTLA and Treg in outer peripheral blood decreased obviously（P < 0.01 or P < 0.05）.③ Compared with the normal control group，the course of disease，BPC，thrombocytocrit，MPV，ESR，RF，hs-CRP，anti CCP antibody and IgG of those with abnormal platelet parameters increased obviously，and their BTLA and Treg decreased significantly

（P < 0.01 or P < 0.05）.④ The correlation analysis showed that BPC of RA was positively correlated with DAS28，ESR，hs-CRP，anti CCP antibody，IgG，and Treg and negatively related with BTLA.Thrombocytocrit was positively correlated with ESR，hs-CRP，RF and IgM and negatively correlated with Treg and BTLA（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Platelet parameter abnormalities are common in patients with RA and obviously correlated with disease activity.Those with increasing platelet parameter will suffer a severe disease and a higher disease activity.Its mechanism may be related with the decreased expression of BTLA or Treg which leads to immune disorders，imbalanced inflammatory factor expression or damage to the blood system.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；platelet parameter；BTLA；Treg

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的以對稱性、侵蝕性多關(guān)節(jié)炎癥病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病。臨床研究顯示，當(dāng)RA病情處于活動(dòng)時(shí)，近70%的患者血小板持續(xù)反應(yīng)性增高，在病情緩解后，血小板可以降至正常水平。既往研究發(fā)現(xiàn)，RA患者普遍存在血小板參數(shù)表達(dá)異常，具體表現(xiàn)為血小板參數(shù)升高，血小板功能亢進(jìn)[1-3]。研究表明，RA的發(fā)生與免疫功能紊亂關(guān)系密切，其中，B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）在RA的發(fā)病中起重要調(diào)節(jié)作用[4]。而血小板也參與了人體內(nèi)的炎癥和免疫反應(yīng)[5]。本項(xiàng)大樣本、多中心的臨床研究同期在4個(gè)中心開展，主要對604例RA患者的血小板參數(shù)變化和免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評估，并與疾病活動(dòng)度作相關(guān)性分析，以尋求RA血小板參數(shù)表達(dá)異常的可能機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 所選604例RA患者來自4個(gè)臨床研究中心，分別為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科、蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科及皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院風(fēng)濕科。病例收集時(shí)間為2012年1月至2014年

9月，男91例，女513例；年齡19～70歲，平均（48.95±10.41）歲。另選取60例經(jīng)體檢和免疫學(xué)檢查排除自身免疫性疾病，身體健康、無明顯器質(zhì)性疾病者作為正常對照組，男11例，女49例；年齡26～67歲，平均（44.58±7.35）歲。2組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)2009年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的最新RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng)[6]，根據(jù)評分系統(tǒng)評分，總得分6分以上可診斷RA。RA的病情活動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)采用EULAR制定的改良疾病活動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)

（3變量），簡稱DAS28-3[7]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)[8] ①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～70歲；③同意參加本研究并簽署知情同意書，按要求完成問卷填寫，依從性好。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①4周內(nèi)肌肉注射或靜脈注射使用過糖皮質(zhì)激素，長期服用慢作用抗風(fēng)濕藥或激素，且在本研究前至少1個(gè)月內(nèi)未停用，或使用非甾體抗炎藥，且在本研究前至少1周內(nèi)未停用；②DAS28-3評分 > 5.1分（高活動(dòng)性）者；③重疊其他風(fēng)濕病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、嚴(yán)重的膝骨關(guān)節(jié)炎等者；④合并心血管、腦、肺、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病或近期有嚴(yán)重感染者；⑤妊娠、哺乳期婦女及精神病者；⑥白細(xì)胞 < 3.5×109·L-1、血小板 < 90×109·L-1、血紅蛋白 < 85 g·L-1的患者；⑦胃十二指腸潰瘍、胃炎活動(dòng)期或長期服用非甾體抗炎藥導(dǎo)致胃病者；⑧對試驗(yàn)藥物過敏者；⑨1個(gè)月內(nèi)參加過其他臨床試驗(yàn)者。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)方法 本試驗(yàn)采用大樣本、多中心的臨床研究方法。試驗(yàn)方案經(jīng)研究負(fù)責(zé)單位安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，受試者入選前均簽署知情同意書。

2.2 評定方法 主要觀察指標(biāo)：采用法國HORIBA ABXSAS公司ABX120全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定患者血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血小板比容（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板平均容積（MPW）。疾病活動(dòng)度評估：魏氏法測定紅細(xì)胞沉降率（ESR），全自動(dòng)生化儀測定免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM），超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、類風(fēng)濕因子（RF）、抗CCP抗體滴度等炎癥指標(biāo)并計(jì)算DAS28。免疫功能評估：采用美國Beckman Coulter公司流式細(xì)胞儀檢測外周血Treg、BTLA表達(dá)頻率。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)變量的數(shù)字特征，采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)對人口學(xué)資料（性別、年齡、身高、體質(zhì)量）、RA患者血小板參數(shù)指標(biāo)及相關(guān)指標(biāo)評價(jià)。計(jì)量資料以表示，采用Peaeson或Spearman方法進(jìn)行相關(guān)性分析；所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 RA患者血小板參數(shù)異常率 604例RA患者血小板參數(shù)至少1項(xiàng)異常者367例（60.96%），

2項(xiàng)同時(shí)異常者181例（29.97%），3項(xiàng)同時(shí)異常者55例（9.11%），4項(xiàng)全部異常者12例（1.99%）。

3.2 2組血小板參數(shù)指標(biāo)比較 與正常對照組比較，RA患者血小板參數(shù)指標(biāo)PLT、PCT明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。

見表1。

3.3 2組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化 RA患者ESR、hs-CRP、

RF、抗CCP抗體、DAS28、IgM、IgG明顯升高，外周血BTLA、Treg表達(dá)頻率顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。見表2。

3.4 血小板參數(shù)異常組與血小板參數(shù)正常組比較與血小板參數(shù)正常組比較，血小板參數(shù)異常組病程、PLT、PCT、MPV、ESR、RF、CRP、抗CCP抗體、IgG明顯升高，BTLA、Treg明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；而2組性別、年齡、PDW、DAS28、IgA、IgM比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3.5 RA患者血小板參數(shù)與疾病活動(dòng)度及BTLA、Treg的相關(guān)性分析 RA患者PLT與DAS28、ESR、hs-CRP、抗CCP抗體、IgG、Treg呈正相關(guān)，與BTLA呈負(fù)相關(guān)。PCT與ESR、hs-CRP、RF、IgM呈正相關(guān)，與BTLA、Treg呈負(fù)相關(guān)；PDW與ESR、抗CCP抗體呈正相關(guān)，與BTLA呈負(fù)相關(guān)。MPV與RF呈正相關(guān)，與BTLA、Treg呈負(fù)相關(guān)

（P < 0.01或P < 0.05）。見表4。

4 討 論

RA是一種常見的慢性自身免疫性疾病，RA患者血液學(xué)檢查提示有血小板計(jì)數(shù)增高，可能與其活化的滑膜細(xì)胞產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子以及致炎細(xì)胞因子受體表達(dá)明顯增加有關(guān)[9]。以往對于血小板的研究多局限在凝血、止血功能上，近年來有研究表明，血小板與風(fēng)濕免疫疾病密切相關(guān)，是一種具有一系列效應(yīng)反應(yīng)的免疫細(xì)胞，可能參與了RA的炎癥反應(yīng)[10-11]。PDW是血小板體積大小變異參數(shù)，MPV是血小板體積大小參數(shù)，兩者都是反映血小板活化的指標(biāo)，與血液循環(huán)中血小板的生成、壽命、超微結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)密切相關(guān)[12]。劉健等[13]觀察4種風(fēng)濕病患者血小板參數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)RA患者PLT、PCT、PDW較正常組明顯升高，并與疾病活動(dòng)度密切相關(guān)。成之巍等[14-15]亦證實(shí)上述觀點(diǎn)，認(rèn)為血小板參數(shù)與RA活動(dòng)性指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo)呈正相關(guān)。本項(xiàng)大樣本對604例RA患者血小板參數(shù)與疾病的臨床表現(xiàn)、病情活動(dòng)度及生活質(zhì)量等進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中血小板參數(shù)異常率為60.96%，且血小板參數(shù)與RA患者疾病活動(dòng)期的指標(biāo)呈明顯相關(guān)性，一定程度上反映了RA患者關(guān)節(jié)滑膜侵蝕性炎癥的活動(dòng)程度。

此外，筆者還發(fā)現(xiàn)，RA患者血小板參數(shù)異常與BTLA以及Treg變化相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RA患者血小板參數(shù)變化與疾病活動(dòng)度以及BTLA、Treg細(xì)胞表達(dá)的關(guān)系，筆者依據(jù)血小板參數(shù)的變化將604例RA患者分為血小板參數(shù)異常組和血小板參數(shù)正常組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，伴有血小板參數(shù)異常的RA患者病情較重，疾病活動(dòng)度較高，而BTLA、Treg細(xì)胞表達(dá)量降低，提示RA外周血BTLA、Treg降低會(huì)直接或間接導(dǎo)致血小板參數(shù)異常。

BTLA參與了T細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)，其在Th1介導(dǎo)的RA病程中可能起到重要作用[16]，可特異性表達(dá)于T、B細(xì)胞，能負(fù)性調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的活化增殖和Treg的表達(dá)，而Treg具有免疫無能和免疫抑制功能，可通過細(xì)胞接觸依賴方式抑制T細(xì)胞活化，維持自身免疫耐受[17-18]，BTLA、Treg協(xié)同調(diào)控作用，從而抑制炎性分子的

釋放[19-20]，減少炎性介質(zhì)對RA血液系統(tǒng)損傷。當(dāng)RA患者BTLA、Treg表達(dá)處于失衡時(shí)，BTLA或（和）Treg表達(dá)減少或缺陷時(shí)，機(jī)體T細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)超應(yīng)答現(xiàn)象，促使T、B細(xì)胞過度異?；罨瑢?dǎo)致炎癥因子失衡，造成血液系統(tǒng)的損害，從而出現(xiàn)血小板異常。

綜上所述，RA患者普遍存在血小板參數(shù)異常，且與疾病活動(dòng)度，免疫功能紊亂程度相關(guān)，伴有血小板參數(shù)升高的RA患者病情更重，疾病活動(dòng)度較高，其機(jī)制可能與BTLA或Treg表達(dá)減少，導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂，炎癥因子表達(dá)失衡，造成血液系統(tǒng)損傷有關(guān)。本研究認(rèn)為，血小板參數(shù)對評估RA疾病活動(dòng)及預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義，可與ESR、RF、CRP等一起作為RA患者疾病活動(dòng)期的指標(biāo)，同時(shí)也為RA患者療效觀察提供了新的監(jiān)測指標(biāo)，且臨床上檢測血小板參數(shù)的技術(shù)比較成熟，費(fèi)用較低，便于在臨床上廣泛推行。因此在RA治療方案的選擇和療效評定上，不僅要注重RA疾病本身的發(fā)生、發(fā)展，也要注重血小板參數(shù)的轉(zhuǎn)歸，在多種治療RA的方法中兼顧對血小板參數(shù)的綜合治療，以提高近期和遠(yuǎn)期療效，改善生活治療及滿意度。

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收稿日期：2016-04-12；修回日期：2016-06-13