預(yù)知子三萜皂苷體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞溶血作用的研究

賀海波　秦文　曾建紅　張敏

摘要：為了研究預(yù)知子三萜皂苷（TSAF）抗脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞溶血作用，以昆明小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，采用分光光度法測(cè)定TSAF對(duì)自發(fā)性及CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導(dǎo)的小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的影響，測(cè)定TSAF對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血的影響。結(jié)果表明，TSAF可抑制肝自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)CCl₄、H₂O₂、Fe₂₊-VC誘導(dǎo)的肝過(guò)氧化損傷具有保護(hù)作用，能有效地抑制過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成，具有抑制H₂O₂誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的作用，抑制率與TSAF濃度呈良好的量效關(guān)系。TSAF具有較強(qiáng)的體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞溶血的作用，并呈一定的量效關(guān)系。

關(guān)鍵詞：預(yù)知子三萜皂苷；脂質(zhì)過(guò)氧化；丙二醛；紅細(xì)胞溶血；抗氧化活性

預(yù)知子為木通科植物木通、三葉木通或白木通的干燥近成熟果實(shí)，是中醫(yī)臨床防治肝癌行氣活血治法中的常用藥物。其果味甜可食，也可釀酒，種子可榨油。三萜皂苷類成分是預(yù)知子中的主要成分，具有抗癌、抗憂郁和改善腦卒中后神經(jīng)功能等廣泛的生物活性和功效，迄今為止未發(fā)現(xiàn)毒性報(bào)道，故其在新藥研究方面具有廣闊的前景。本試驗(yàn)對(duì)預(yù)知子三萜皂苷（Triterpenoid saponins of akebiae fructus，TSAF）類成分的體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用進(jìn)行研究，為后續(xù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性昆明種小鼠，體重（20±2）g，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證：SCXK桂2013-0002）。

1.2材料與試劑

丙二醛（Malondialdehvde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。三氯醋酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、自由基誘導(dǎo)劑CCl₄、H₂O₂和鐵離子一抗壞血酸（Fe²⁺-VC）等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3儀器與設(shè)備

HP70A冷凍超速離心機(jī)（Hitachi日立公司）：FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)（金壇市華控實(shí)驗(yàn)儀器廠）；D-1006-D2超純水機(jī)（上海必能信有限公司）；SGW-1全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海摩速科學(xué)器材有限公司）：DU800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司）。

1.4方法

1.4.1對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 小鼠禁食過(guò)夜后于次日頸椎脫臼處死，立即解剖取出肝臟，4℃生理鹽水沖洗血液，剔除脂肪和結(jié)締組織，濾紙吸干稱重后剪碎，在4℃生理鹽水中進(jìn)行研磨，制成10%肝組織勻漿。試驗(yàn)分為對(duì)照組和5個(gè)劑量的TSAF組，取6支離心管，先在各管中分別加入1.0mL肝組織勻漿，然后在5個(gè)劑量的rSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，對(duì)照組加入蒸餾水0.1 mL。每組平行3管，混勻，將各組離心管于37℃水浴恒溫振蕩反應(yīng)1.0 h，取出后流水冷卻，然后向各管分別加入1.0 mL的20%TCA和1.0 mL的0，67%TBA，混勻，置沸水浴中振蕩反應(yīng)15min，取出后流水冷卻，于3 500 r/min離心10 min，去除蛋白質(zhì)沉淀，取上清液，-20℃冰箱保存待測(cè)MDA含量，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定肝組織勻漿中MDA含量，并計(jì)算抑制率（%）。

抑制率（IR）=[（對(duì)照組MDA-提取物組MDA）/對(duì)照組MDA]×100%

1.4.2對(duì)CCl₄誘導(dǎo)小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 按“1.4.1”方法制備10%肝組織勻漿。試驗(yàn)分為對(duì)照組（肝組織勻漿、蒸餾水和CCl4）和5個(gè)劑量的TSAF組（肝組織勻漿、各劑量的TSAF和CCl₄），取6支離心管，先在各管中分別加入1.0 mL肝組織勻漿，然后在5個(gè)劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL TSAF 0.1 mL，對(duì)照組加入蒸餾水0.1 mL。每組平行3管，混勻，將各組離心管于37℃水浴恒溫振蕩反應(yīng)30 min，取出后流水冷卻，然后向各管分別加入20 μL CCl₄，混勻，繼續(xù)水浴恒溫振蕩反應(yīng)30 min，取出后流水冷卻，以下步驟與“1.4.1”相同。

1.4.3對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 按“1.4.1”方法制備10%肝組織勻漿。試驗(yàn)分為對(duì)照組（肝組織勻漿、蒸餾水和H₂O₂）和5個(gè)劑量的TSAF組（肝組織勻漿、各劑量的TSAF和H₂O₂）。取6支離心管，先在各管中分別加入1.0 mL肝組織勻漿，然后在5個(gè)劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，對(duì)照組加入蒸餾水0.1 mL。每組平行3管，混勻，將各組離心管于37℃水浴恒溫振蕩反應(yīng)30 min，取出后流水冷卻，然后向各管分別加入1.0 mL的0.1 mol/L H₂O₂，混勻，水浴恒溫振蕩反應(yīng)30 min，取出后流水冷卻，以下步驟與“1.4.1”相同。

1.4.4對(duì)Fe²⁺-VC誘導(dǎo)小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的影響按“1.4.1”方法制備10%肝組織勻漿。試驗(yàn)分為對(duì)照組（肝組織勻漿、蒸餾水、FeSO₄·7H₂O和VC）和5個(gè)劑量的TSAF組（肝組織勻漿、各劑量的TSAF、FeSO₄·7H₂O和VC）。取6支離心管，先在各管中分別加入1.0mL肝組織勻漿，然后在5個(gè)劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1mL，對(duì)照組加入蒸餾水0.1 mL。再向各管中分別加入50 μL FeSO₄·7H₂O（終濃度為2.0 mmol/L）和50 μLVC（終濃度為1.0 mmol/L）。每組平行3管，混勻，以下步驟與“1.4.1”相同。

1.4.5對(duì)紅細(xì)胞溶血的影響 小鼠眼眶采血1～2 mL，加入肝素鈉抗凝劑后，于3 500r/min離心10min，分取紅細(xì)胞沉淀后，用生理鹽水洗滌3次，制成終濃度為0.5%小鼠紅細(xì)胞懸浮液。試驗(yàn)分為對(duì)照組（紅細(xì)胞懸浮液、蒸餾水）和5個(gè)劑量的TSAF組（紅細(xì)胞懸浮液、各劑量的TSAF）。取6支離心管，先在各管中分別加入1.0 mL紅細(xì)胞懸浮液，然后在5個(gè)劑量的TSAF組中分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，對(duì)照組加入蒸餾水0.1 mL。接著在5個(gè)劑量的TSAF組中再加入0.05 mL 100mmol L H₂O₂，對(duì)照組加蒸餾水補(bǔ)足體積。每組平行5管，混勻，將各組離心管于37℃水浴1 h，用生理鹽水稀釋5倍，于3 000 r/min離心10min，分取上清液，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于540 nm處測(cè)定吸光度值（A_540nm），計(jì)算溶血抑制率。

溶血抑制率=[（對(duì)照組A-提取物組A）/對(duì)照組A]×100%

1.4.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s）。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較用X²檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果與分析

2.1對(duì)肝自發(fā)性和CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

由表1可知，與對(duì)照組比較，自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化、CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化試驗(yàn)中5個(gè)劑量TSAF組小鼠肝組織中MDA含量與對(duì)照組相比均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01）。隨著TSAF濃度的增加，MDA含量逐漸下降，且其抑制率隨濃度的增加而呈上升的趨勢(shì)。表明TSAF不僅對(duì)小鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成有抑制作用，而且對(duì)CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成也表現(xiàn)有相同的抑制作用，其抑制作用與TSAF濃度存在一定的量效關(guān)系。

2.2對(duì)紅細(xì)胞溶血的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，5個(gè)劑量TSAF組吸光度值均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01）。隨著TSAF濃度的增大，吸光度逐漸減小，抑制率逐漸加強(qiáng)，最高溶血抑制率達(dá)到91.27%，表明TSAF具有很好的抑制紅細(xì)胞溶血的作用，說(shuō)明TSAF對(duì)紅細(xì)胞溶血的抑制作用與其濃度存在一定的量效關(guān)系，

3.討論

機(jī)體在正常狀態(tài)下，不僅有氧自由基產(chǎn)生系統(tǒng)，而且還有清除自由基的抗氧化系統(tǒng)，一方面通過(guò)正常的組織代謝產(chǎn)生自由基，另一方面依靠自身的自由基清除系統(tǒng)使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。而當(dāng)機(jī)體在病理情況下，自由基的產(chǎn)生和清除失衡，自由基產(chǎn)生的數(shù)量會(huì)急劇增加，過(guò)多高活性的自由基在體內(nèi)存在時(shí)，可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一系列的損害作用。脂質(zhì)過(guò)氧化是體內(nèi)氧自由基能攻擊生物膜中多聚不飽和脂肪酸而引起的一系列有害氧化反應(yīng)，它大部分由肝細(xì)胞產(chǎn)生，其分解也主要在肝臟。當(dāng)自由基在體內(nèi)的產(chǎn)生增加時(shí)，可以產(chǎn)生一系列脂質(zhì)過(guò)氧化物，MDA是由自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化物的最終產(chǎn)物。MDA含量越高，提示細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度就越高，細(xì)胞膜損傷也就越嚴(yán)重。MDA可導(dǎo)致人體細(xì)胞氧化損害、老化、癌變等，它與腫瘤、心血管疾病、衰老、炎癥、自身免疫等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。MDA含量可間接反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，它是目前評(píng)價(jià)氧自由基損傷的最常用方法。

CCl₄是一種典型致肝臟損傷的化學(xué)性毒物，CCl₄經(jīng)肝氧化酶系統(tǒng)作用后，生成過(guò)氧化三氯甲基自由基（·OOCCl₃）和三氯甲基游離基（·CCl₃）等自由基，它們通過(guò)攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子而引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使MDA含量增加。Fe²⁺是一種常見(jiàn)的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)促進(jìn)劑，F(xiàn)e²⁺也可促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，使MDA的生成量增加。H₂O₂是活性氧家族中的一員，在H₂O₂氧化劑的作用下，可以產(chǎn)生更強(qiáng)活性的·OH，并誘發(fā)多聚不飽和脂肪酸氧化，MDA增加，生物膜的功能和結(jié)構(gòu)受到破壞。本研究結(jié)果表明，TSAF可明顯抑制小鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成，并且TSAF以劑量依賴方式抑制體系MDA的產(chǎn)生，TSAF的這種抑制作用不但表現(xiàn)在肝自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化，而且還表現(xiàn)在由CCl₄、H₂O₂和Fe²⁺-VC等氧化劑誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，表明TSAF具有良好的抗氧化作用。H₂O₂能單獨(dú)與紅細(xì)胞作用使紅細(xì)胞溶血及膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化。紅細(xì)胞在體外與H₂O₂反應(yīng)后也可產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物MDA，損傷紅細(xì)胞膜，使之容易產(chǎn)生溶血。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示，TSAF對(duì)紅細(xì)胞溶血有明顯的抑制作用，隨濃度增加抑制效果逐漸增強(qiáng)，提示TSAF對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血有明顯的抵抗作用?？傊?，TSAF在體外具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞溶血的作用，這為進(jìn)一步開發(fā)預(yù)知子藥用和食用價(jià)值提供了理論依據(jù)。