CD4+/CD8+比例和LAG3+細(xì)胞

何興楨 楊安 李曦

x[摘要] 目的 研究胃癌患者外周血CD4/CD8比例以及胃癌組織淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG-3）陽(yáng)性細(xì)胞/CCR類趨化因子受體3（CCR3）陽(yáng)性細(xì)胞比例在胃癌發(fā)病機(jī)制中的意義。 方法 選取2013年1月～2014年12月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院診斷的胃癌患者（胃癌組）20例及健康者（正常組）20名，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析外周血中CD4/CD8比值，采用免疫熒光法檢測(cè)和分析LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比值。 結(jié)果 胃癌組患者外周血中CD4+/CD8+比值為（1.68±0.87），正常組外周血中CD4+/CD8+比值為（1.80±0.52），與正常組比較，胃癌組有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。胃癌組患者LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比值為（1.47±0.54），正常組LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞為（2.27±0.58），與正常組比較，胃癌組有下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 胃癌患者存在明顯的LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例失衡，一定程度上顯示胃癌患者存在著Th1/Th2比例失衡及免疫失衡，可能是胃癌發(fā)病的重要因素之一，為胃癌的免疫治療、臨床診斷提供新的方向。

[關(guān)鍵詞] CD4+/CD8+；LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞；胃癌；發(fā)病機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（b）-0104-04

[Abstract] Objective To investigate the significance of CD4/CD8 in peripheral blood and lymphocyte activation gene-3 （LAG3+） cells/ chemokine receptor 3 （CCR3+） cells in the pathogenesis of patients with gastric cancer. Methods Twenty patients with gastric cancer （gastric cancer group） and 20 healthy controls （normal group） diagnosed in Shenzhen Hospital of Peking University from January 2013 to December 2014 were chosen， the CD4/CD8 in peripheral blood was detected and analyzed by flow cytometry. LAG3+ cells/CCR3+ cells was detected and analyzed by analyzed linked immunosorbent assay. Results The CD4+/CD8+ in peripheral blood of gastric cancer group was （1.68±0.87）， which of normal group was （1.80±0.52）， compared with normal group， gastric cancer group was lower， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. LAG3+ cells/CCR3+ cells of gastric cancer group was （1.47±0.54）， which of normal group was （2.27±0.58）， compared with normal group， gastric cancer group was lower， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The patients with gastric cancer have a significant imbalance of LAG3+ cells/CCR3+ cells， to some extent， which shows that there is a proportion of Th1/Th2 and immune imbalance in patients with gastric cancer. And it may be one of the most important factors in the pathogenesis of gastric cancer， which provides a new direction for immune therapy and clinical diagnosis of gastric cancer.

[Key words] CD4+/CD8+； LAG3+ cells/CCR3+ cells； Gastric cancer； Pathogenesis

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年全世界因胃癌死亡的人數(shù)高達(dá)70萬(wàn)名[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能的抑制和免疫狀態(tài)的異常密切相關(guān)[2]。T細(xì)胞亞群是在腫瘤免疫中具有重要作用的一類淋巴細(xì)胞，按其表面不同的分化抗原可分為CD4+T細(xì)胞（Th）和CD8+T（Ts/Tc）細(xì)胞兩大亞群。CD4+T細(xì)胞按其產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同又可以分為Th1和Th2兩大亞型，其在機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中具有重要作用。其中Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。正常狀態(tài)下，T細(xì)胞及其亞群數(shù)目處在平衡狀態(tài)，免疫功能穩(wěn)定。CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子，加強(qiáng)CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，具有輔助細(xì)胞和體液免疫的作用。CD8+T細(xì)胞是一類細(xì)胞毒性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞，是一類效應(yīng)細(xì)胞，兩者平衡從而維持機(jī)體正常免疫應(yīng)答狀態(tài)[3]。LAG3在一定程度上作為Th1細(xì)胞的特異性標(biāo)志，選擇性表達(dá)于人類Th1細(xì)胞[4]，CCR3選擇性表達(dá)于人類Th2細(xì)胞上[5]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌患者外周血中CD4+/CD8+比例，通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)胃癌患者LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞的比例，探討CD4+/CD8+比例和LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞在胃癌患者發(fā)病機(jī)制中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2014年12月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）門診或住院行內(nèi)鏡檢查，內(nèi)鏡下診斷胃癌并且最終經(jīng)過(guò)病理診斷明確的20例患者（胃癌組）作為研究對(duì)象；同時(shí)選擇內(nèi)鏡下表現(xiàn)正常且沒(méi)有糜爛、潰瘍或萎縮等其他表現(xiàn)（活檢最終符合病理診斷）的20名健康者（正常組）作為對(duì)照。胃癌組平均年齡（47.7±12.5）歲，其中男10例，平均年齡（52.2±14.0）歲，女10例，平均年齡（43.2±9.4）歲；正常組平均年齡（38.6±9.6）歲，其中男10名，平均年齡（41.0±9.4）歲，女10名，平均年齡（36.2±9.8）歲。提取患者血清5 mL備檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者CD4/CD8細(xì)胞比例 取患者外周血2 mL加入DETA抗凝管（或其他抗凝劑）中。分設(shè)試驗(yàn)管3支，試驗(yàn)管依次加10 μL熒光標(biāo)記CD3/4/8/45，CD3-FITC/CD19-PE抗體10 μL+CD45-PC5抗體5 μL、CD3-FITC/16+56-PE抗體10 μL+CD45-PC5抗體5 μL。每管加入100 μL新鮮抗凝全血，充分混勻后在室溫暗處?kù)o置15～30 min。標(biāo)本與抗體的比例：標(biāo)本檢測(cè)前應(yīng)先計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)，使反應(yīng)體系中白細(xì)胞總數(shù)不超過(guò)5×105個(gè)細(xì)胞。若超過(guò)5×105個(gè)細(xì)胞，用PBS稀釋后反應(yīng)。取出試管：加500 μL OptilyseC，室溫避光10 min，加500 μL PBS，室溫避光10 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，0.5 mL PBS懸浮細(xì)胞，24 h內(nèi)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：以CD45/SS雙參數(shù)方案設(shè)門淋巴細(xì)胞群，選擇CD3/4/8/45四色方案和CD3/CD16+56/CD45三色方案。標(biāo)本上機(jī)后計(jì)數(shù)5000個(gè)淋巴細(xì)胞，測(cè)試完后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。主要儀器及試劑如下：美國(guó)BeckmanCoulter公司NAVIOS型流式細(xì)胞儀。儀器序列號(hào)：AV40310，直接熒光標(biāo)記單克隆抗體CD3/4/8/45、CD3/CD19、CD3/CD16+56、CD45-PC5購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司.

1.2.2 免疫熒光法檢測(cè)LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例 由我院病理科獲得患者胃癌組織切片，行二甲苯脫蠟2次，每次10 min。依次經(jīng)100%、95%、85%、75%、50%乙醇和純水各1次，每次5 min。PBS洗5 min。PBS洗3次，每次5 min。10%正常山羊血清封閉30 min。一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5 min。熒光標(biāo)記二抗室溫濕盒避光孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。DAPI室溫濕盒避光孵育5 min。PBS洗1次，5 min，去離子水洗2次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片；鏡檢，拍照。一抗Anti-CCR3生產(chǎn)商：Abcam；Anti-LAG3生產(chǎn)商：Abcam；二抗Goatanti-MsIgG生產(chǎn)商：LifeTech；Goatanti-RbIgG生產(chǎn)商：LifeTech；熒光顯微鏡生產(chǎn)商：Leica。對(duì)LAG3+、CCR3+細(xì)胞計(jì)數(shù)并進(jìn)行分析。對(duì)每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（200倍）對(duì)CCR3陽(yáng)性細(xì)胞和LAG陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，5個(gè)高倍視野的平均值為該切片的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每張切片由兩名觀察者進(jìn)行判斷和讀片，并取平均值。最終計(jì)算LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組外周血中CD4+/CD8+比值為（1.68±0.87），正常組外周血中CD4+/CD8+比值（1.80±0.52）。與正常組比較，胃癌組有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖1）。而免疫熒光法檢測(cè)提示胃癌組患者LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例為（1.47±0.54），正常組LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例為（2.27±0.58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（圖2，封三），提示胃癌患者中存在著明顯的LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例失衡。

3 討論

胃癌在全球惡性腫瘤的發(fā)病率中排名第四，致死率排名第二[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與機(jī)體免疫功能異常密切相關(guān)[7-8]。腫瘤發(fā)生時(shí)常伴有機(jī)體免疫低下或者免疫抑制。胃癌作為一種常見(jiàn)腫瘤，它的發(fā)生和機(jī)體抗腫瘤免疫功能異常密切相關(guān)。

T細(xì)胞是對(duì)抗腫瘤免疫具有重要意義的效應(yīng)細(xì)胞，其數(shù)量和功能異常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫監(jiān)控。在正常情況下，機(jī)體T細(xì)胞及其亞群的數(shù)目相對(duì)穩(wěn)定，免疫功能穩(wěn)定。有研究表明，反映惡性腫瘤患者機(jī)體免疫功能紊亂的敏感性指標(biāo)是CD4+/CD8+細(xì)胞比值[9]。比值異常增高，提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能“過(guò)度活躍”，機(jī)體發(fā)生自身免疫反應(yīng)的概率增加；比值降低，提示機(jī)體處于“免疫抑制”狀態(tài)。臨床有研究結(jié)果顯示，胃癌患者外周血CD4/CD8細(xì)胞比值比正常人低下，說(shuō)明胃癌患者存在不同程度的T細(xì)胞免疫功能異常[10-11]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組外周血中CD4+/CD8+比值較正常組下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）?？赡芘c本研究樣本量小、胃癌患者沒(méi)有具體分期、技術(shù)方案相對(duì)簡(jiǎn)單有關(guān)，可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本容量來(lái)證實(shí)CD4+/CD8+比例是否下降，胃癌患者是否處于免疫抑制狀態(tài)。

LAG3是免疫球蛋白超家族中的一員。有研究證實(shí)其主要在CD4+T中的Th1細(xì)胞上表達(dá)，在大部分Th2細(xì)胞上不表達(dá)，提示可作為Th1、Th2細(xì)胞的區(qū)分標(biāo)志[5]。但也有研究認(rèn)為L(zhǎng)AG3不能作為Th1細(xì)胞的特異性指標(biāo)[12]。本研究檢測(cè)出胃癌組及正常組LAG3+細(xì)胞并計(jì)數(shù)。雖然LAG3+細(xì)胞計(jì)數(shù)不完全等同于Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)，但其主要在Th1細(xì)胞上表達(dá)，一定程度上反映了Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)。CCR3是G蛋白偶聯(lián)受體中的一種，其主要在Th2淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)[13]。雖然CCR3在Th2細(xì)胞上選擇性表達(dá)，但是又可以與多種受體結(jié)合[14]，所以檢測(cè)出來(lái)的CCR3+細(xì)胞計(jì)數(shù)只能在一定程度上反映了Th2陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。由于目前缺乏Th1和Th2細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，只能通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，間接檢測(cè)出Th1/Th2的比值。本研究通過(guò)得出LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比例，間接反映Th1/Th2的比值。有待將來(lái)進(jìn)一步研究加深對(duì)T細(xì)胞體內(nèi)分化及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從而準(zhǔn)確檢測(cè)出Th1/Th2比值，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確分析，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌的免疫診斷和治療。

LAG3在多種免疫類型中表達(dá)，主要在活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞上選擇性表達(dá)，其在部分活化的B細(xì)胞、腫瘤組織活化浸潤(rùn)的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞也有表達(dá)[15]。多項(xiàng)研究表明，LAG3能激活CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[16-17]，表明腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與機(jī)體的免疫狀態(tài)異常有關(guān)。CCR3主要在Th2淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞等各種免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)[13]，其在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、腎癌等多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，具體機(jī)制不詳，可能與機(jī)體免疫異常有關(guān)，有待未來(lái)的研究進(jìn)一步證實(shí)。

Th1、Th2是CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)重要亞群，機(jī)體正常狀態(tài)下Th1/Th2比值保持動(dòng)態(tài)平衡[18]。在腫瘤等各種疾病狀態(tài)下，比值會(huì)發(fā)生改變、偏移甚至逆轉(zhuǎn)。有研究提示[19-20]，消化道腫瘤患者Th1、Th2之間的平衡向Th2漂移，呈現(xiàn)免疫功能抑制狀態(tài)，且腫瘤分化程度越低，失衡愈加明顯。本研究用免疫熒光法檢測(cè)LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比值時(shí)使用一抗Anti-LAG3、Anti-CCR3，通過(guò)得出LAG3陽(yáng)性細(xì)胞/CCR3陽(yáng)性細(xì)胞比例失衡，一定程度上顯示胃癌患者中存在著明顯的Th1/Th2比例失衡，表明胃癌患者機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)制受損，這與眾多國(guó)內(nèi)外研究類似[21-23]。同時(shí)從側(cè)面反映出胃癌患者的免疫紊亂可能與Th1/Th2相關(guān)的趨化因子受體的異常表達(dá)有關(guān)，是胃癌的發(fā)病機(jī)制之一，那么阻礙其相關(guān)受體的作用途徑，可以為胃癌的早期診斷提供新的線索，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。探討LAG3+細(xì)胞/CCR3+細(xì)胞比值變化與胃癌發(fā)生的關(guān)系，深度剖析胃癌發(fā)生的免疫機(jī)制，從而為胃癌的免疫治療、臨床診斷提供新的方向。

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（收稿日期：2015-12-12 本文編輯：張瑜杰）