基于微流控芯片的CAFs影響胃癌細(xì)胞耐藥及GRP—78表達(dá)相關(guān)性

帥智峰　韓翠翠　張曉杰

【摘要】 目的：利用微流控芯片平臺(tái)探索腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）影響人胃癌SGC7901細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥及其與GRP78表達(dá)的相關(guān)性，從而為臨床工作提供以CAFs和GRP78為靶點(diǎn)來(lái)改善腫瘤耐藥的新思路。方法：本實(shí)驗(yàn)自主設(shè)計(jì)了一個(gè)可用于藥敏檢測(cè)及蛋白半定量的三維聯(lián)合共培養(yǎng)微流控芯片體系，通過(guò)灌注細(xì)胞懸液-凝膠混合物于三維培養(yǎng)池內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系的三維培養(yǎng)。應(yīng)用凋亡染色方法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組（對(duì)照組）、SGC7901細(xì)胞+NFs共培養(yǎng)組、SGC7901細(xì)胞+CAFs共培養(yǎng)組中SGC7901細(xì)胞對(duì)不同濃度的化療藥物順鉑的藥物敏感情況。應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組SGC7901細(xì)胞GRP78表達(dá)。結(jié)果：SGC7901細(xì)胞+CAFs共培養(yǎng)組與單培養(yǎng)組相比，SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性較SGC7901細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低（P<0.05），SGC7901細(xì)胞+CAFs共培養(yǎng)組SGC7901細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高（P<0.05）。結(jié)論：CAFs可以誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥；CAFs可能通過(guò)上調(diào)人胃癌SGC7901細(xì)胞中GRP78的表達(dá)而導(dǎo)致耐藥。

【關(guān)鍵詞】 微流控芯片； 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞； 胃癌； 耐藥

The Relevance of CAFs Influencing the Drug Resistant of Gastric Cancer Cells and the GRP-78 Expression Based on Microfluidic Chip/SHUAI Zhi-feng，HAN Cui-cui，ZHANG Xiao-jie.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：005-008

【Abstract】 Objective：The platform of microfluidic chip is used to explore the relevance of cancer-associated fibroblasts（CAFs） influencing the resisitence of human gastric cancer SGC7901 cells to chemotherapy drugs and the expression of GRP-78，to provide the new idea that CAFs and GRP78 as targets improve tumor drug resistance for clinical work.Method：A microfluidic chip system of three-dimensional co-culture was designed independently which could be used for drug sensitive detection and protein semi-quantitative in this experiment.Three-dimensional culture of gastric cancer cell line was achieved by perfusing cell suspension-gel mixture.Apoptosis staining was applied to detect the sensitivity of SGC7901 cells to chemotherapeutic drugs cisplatin with different concentrations in separate culture group of SGC7901 cells（the control group），co-culture group of SGC7901 cells and NFs，co-culture group of SGC7901 cells and CAFs.The expressions of GRP78 in the control group and experimental group were detected by immunofluorescent assay.Result：Compared with the control group，the sensitivity of human gastric cancer SGC7901 cells to cisplatin in the co-culture group of SGC7901 cells and CAFs was obviously lower than that in the control group（P<0.05）.Compared with the control group，the GRP78 expressions of SGC7901 cells in the co-culture group of SGC7901 cells and CAFs was distinctly higher（P<0.05）.Conclusion：CAFs can induce the drug resistance of SGC7901 cells to cisplatin； CAFs may lead to drug resistance by up-regulating the GRP78 expression in human gastric cancer SGC7901 cells.

【Key words】 Microfluidic chip； Cancer-associated fibroblasts； Gastric cancer； Drug resistance

First-authors address：Basic Medical College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.002

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-2]，嚴(yán)重影響人們的生命和健康。化療是治療進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性胃癌的主要方法，但現(xiàn)應(yīng)用5-FU、順鉑和紫杉醇為基礎(chǔ)的各種聯(lián)合化療方案的總體有效率只有20%～40%，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受性常常導(dǎo)致化療失敗[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中均起到了重要作用，并可能與腫瘤的耐藥性相關(guān)[5-6]。微流控芯片是一種在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操縱為主要特征的科學(xué)技術(shù)，由于芯片中流體通道直徑與細(xì)胞生長(zhǎng)所需空間相適宜，通過(guò)連續(xù)動(dòng)態(tài)供養(yǎng)、多種細(xì)胞的三維共培養(yǎng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境更加類(lèi)似于其在體內(nèi)的真實(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)[7]。因此，本研究擬通過(guò)微流控芯片平臺(tái)進(jìn)行CAFs、NFs和胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)，來(lái)探索CAFs影響胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥及其與GRP78表達(dá)的相關(guān)性，從而為臨床工作提供以CAFs和GRP78為靶點(diǎn)來(lái)改善腫瘤耐藥的新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞，為齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院提供。

1.1.2 新鮮組織獲取 人新鮮胃癌組織來(lái)源于本院附屬醫(yī)院腫瘤外科，人包皮新鮮組織來(lái)源于本院附屬醫(yī)院泌尿外科，均由術(shù)中獲取，獲取前經(jīng)患者或家屬知情同意和本單位倫理委員會(huì)許可。

1.1.3 主要試劑 優(yōu)質(zhì)胎牛血清、碘化丙碇（PI）染色劑、羊抗人GRP78抗體、鼠抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體SMA和鼠抗人β-actin抗體均購(gòu)自Sigma公司；FITC標(biāo)記熒光二抗、辣根酶IgG抗體、蛋白提取劑試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自碧云天公司；基底膜提取物（BME）購(gòu)自R&D Systems公司；RPMI1640和IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)自hyclone公司；順鉑購(gòu)自Aladdin公司。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片的構(gòu)建與處理 本課題組設(shè)計(jì)了微流控芯片CAD圖形，并交于大連海事大學(xué)基于標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)制作SU-8負(fù)膠模板。此設(shè)計(jì)用于藥敏檢測(cè)及蛋白半定量的三維聯(lián)合共培養(yǎng)微流控芯片體系，通過(guò)灌注細(xì)胞懸液-凝膠混合物于三維培養(yǎng)池內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系的三維培養(yǎng)；通過(guò)中部連接通道上的二維培養(yǎng)單元來(lái)實(shí)現(xiàn)成CAFs、NFs與胃癌細(xì)胞的非接觸式共培養(yǎng)；并通過(guò)微型注射泵持續(xù)注入實(shí)現(xiàn)流動(dòng)實(shí)時(shí)營(yíng)養(yǎng)物供給，使細(xì)胞所處的環(huán)境更加接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，以便模擬人體內(nèi)腫瘤的真實(shí)狀況。主要方法：于模板上制作PDMS基片，等離子清洗活化PDMS基片和玻璃載玻片，使之相互鍵合，完成芯片制備過(guò)程。使用前，向芯片的進(jìn)液孔注入無(wú)水乙醇并使之充滿整個(gè)通道，然后用蒸餾水沖洗乙醇，操作3次，將芯片于高壓蒸汽鍋內(nèi)高壓滅菌，烘箱中烘干，紫外消毒后使用。微流控芯片及局部結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分單培養(yǎng)組（對(duì)照組）和共培養(yǎng)組（實(shí)驗(yàn)組）。對(duì)照組為單培養(yǎng)組（胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞），共培養(yǎng)組分為SGC7901細(xì)胞+CAFs共培養(yǎng)組、SGC7901細(xì)胞+NFs共培養(yǎng)組。

1.2.3 藥敏檢測(cè) 三組芯片中各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，通過(guò)MS26微量泵經(jīng)芯片藥物入口將順鉑泵入芯片，將芯片置于孵箱內(nèi)誘導(dǎo)48 h。PBS注入芯片，沖洗細(xì)胞后向芯片中注入PI染液，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 耐藥相關(guān)蛋白表達(dá) 三組芯片中各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，免疫熒光檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑藥物敏感性的檢測(cè) 為了驗(yàn)證CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的影響，筆者把各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用順鉑作用48 h，PI染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。SGC7901細(xì)胞+CAFs共培養(yǎng)組與單培養(yǎng)組相比，SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性較SGC7901細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低（P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.2 GRP78蛋白表達(dá)的檢測(cè) 為了驗(yàn)證CAFs和SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)SGC7901細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)的影響，以及探討GRP78的表達(dá)與CAFs引起的腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的相關(guān)性，用芯片平臺(tái)免疫熒光法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平。SGC7901細(xì)胞+CAFs共培養(yǎng)組SGC7901細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高（P<0.05），見(jiàn)圖3。

3 討論

胃癌的發(fā)病率占消化系統(tǒng)腫瘤的第一位，是我國(guó)死亡率最高的惡性腫瘤之一。早期胃癌主要通過(guò)手術(shù)治療，而晚期和轉(zhuǎn)移性胃癌主要依靠化療，但胃癌的耐藥現(xiàn)象往往導(dǎo)致胃癌化療失敗，因此探討胃癌耐藥機(jī)制成為一項(xiàng)重要的研究課題[7-8]。

以往的大量體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，許多化療藥物均能顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡，但這一結(jié)果在內(nèi)體研究時(shí)往往效果并不明顯，因?yàn)轶w內(nèi)腫瘤微環(huán)境要遠(yuǎn)比體外單一的實(shí)驗(yàn)環(huán)境復(fù)雜得多，尤其是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）可能參與了胃癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程[9]。

本課題組構(gòu)建了微流控芯片細(xì)胞三維共培養(yǎng)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的非接觸共培養(yǎng)，探討CAFs對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性的影響。微流控芯片技術(shù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)室具有微型化、高通量、集成化的優(yōu)勢(shì)，能實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。利用微流控芯片將腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，芯片通道與細(xì)胞大小相適應(yīng)，模擬了細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)所需的空間；利用微量泵給細(xì)胞提供流動(dòng)培養(yǎng)基，并帶走代謝廢物，更加真實(shí)地模擬腫瘤在體內(nèi)的生存狀態(tài)，構(gòu)建了體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，是進(jìn)行腫瘤相關(guān)研究的理想模式。

腫瘤間質(zhì)相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）與創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的成纖維細(xì)胞不同，不再向正常表型轉(zhuǎn)化，而保持持續(xù)活化的特征，并通過(guò)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子促進(jìn)臨近腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)。CAFs和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用表現(xiàn)在許多方面，它還可能與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，而以往對(duì)腫瘤耐藥性的研究多側(cè)重于腫瘤細(xì)胞本身，但越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)成分可能通過(guò)各種途徑影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。為了驗(yàn)證CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的影響，筆者把各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用順鉑作用48 h，PI染色后顯微鏡下細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示CAFs+SGC7901共培養(yǎng)組與單培養(yǎng)組相比，SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性較SGC7901細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低（P<0.05），表明CAFs能降低順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的敏感性，促進(jìn)SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。此前有研究者發(fā)現(xiàn)CAFs與抗血管生成藥的耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)，能引起腫瘤細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥[10-11]。

CAFs可能通過(guò)代謝調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥。腫瘤細(xì)胞由于增殖速度快，必然導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)相對(duì)供應(yīng)不足，造成局部低氧和酸中毒的微環(huán)境，可誘導(dǎo)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（Glucose regulated proteins，GRPs）的產(chǎn)生[12]，其中GRP78是這種應(yīng)激性蛋白的代表。它是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，許多研究報(bào)道GRP78高表達(dá)與某些腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)[13-15]。本研究用微流控芯片平臺(tái)免疫熒光法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平，探討CAFs引起的胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥是否能引起與GRP78蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果CAFs與SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)組SGC7901細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高（P<0.05），因此推斷，CAFs引起的SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與GRP78蛋白的表達(dá)有一定相關(guān)性。

綜上所述，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的宿主細(xì)胞，腫瘤微環(huán)境中的CAFs可能通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)而引起胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，微流控芯片構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系能真實(shí)模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，是研究腫瘤的理想模式。

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（收稿日期：2015-12-09） （本文編輯：歐麗）