HLA—DQB1等位基因與廣西壯族人群肝癌家族聚集性的相關(guān)性

龔婷婷　吳繼周　梁惠萍　盧庭婷　蔣莉　吳健林　胡蝶飛　寧秋悅　龐裕

【摘要】 目的：探討HLA-DQB1等位基因與廣西壯族人群肝癌家族聚集性的相關(guān)性，為尋找廣西壯族人群肝癌的遺傳易感基因或拮抗基因提供線索。方法：采取性別、年齡±5歲配對方法，在廣西壯族肝癌高發(fā)區(qū)選取肝癌高發(fā)家族成員、無癌家族成員各48例作為研究對象，采集研究對象外周血并提取全血DNA，應(yīng)用PCR-SSP方法對HLA-DQB1等位基因進(jìn)行檢測。結(jié)果：（1）HLA-DQB1*02/06/07等位基因在肝癌高發(fā)家族組和無癌家族組的基因頻率分別是8.33%和33.33%、33.33%和8.33%、25.00%和50.00%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；HLA-DQB1*04/05/08/09分別是0和8.33%、50.00%和41.67%、25.00%和16.67%、8.33%和8.33%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；（2）HLA-DQB1*02/04/05/06/07/08/09等位基因在乙型肝炎病毒感染組（HBsAg陽性組）及非乙型肝炎病毒感染組（HBsAg陰性組）中的基因頻率分別為15.79%和22.08%、0和5.19%、42.11%和46.75%、26.32%和19.48%、47.37%和35.06%、21.05%和20.78%、5.26%和9.09%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（3）HLA-DQB1各等位基因與性別無明顯相關(guān)（P>0.05）。結(jié)論：（1）HLA-DQB1*02/07等位基因可能是廣西壯族人群肝癌發(fā)生的拮抗基因，而HLA-DQB1*06等位基因可能為其易感基因；（2）HLA-DQB1各等位基因可能與廣西壯族肝癌高發(fā)區(qū)乙肝病毒的感染及性別無明顯關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】 HLA-DQB1； 等位基因； 原發(fā)性肝癌； 家族聚集性

Relationship between HLA-DQB1 Allele and Familial Clustering of Hepatocellular Carcinoma in Guangxi Zhuang People/GONG Ting-ting，WU Ji-zhou，LIANG Hui-ping，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：001-004

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between HLA-DQB1 allele and familial clustering of hepatocellular carcinoma（HCC） to provide some evidence for the seeking susceptibility gene or resistant gene of HCC in Guangxi Zhuang people，China.Method：Using gender， age 5 year old matching method，from high incidence of hepatocellular carcinoma in Guangxi Zhuang，48 members whose families with two or more than two HCC patients were selected as the experimental group，and 48 members from families without any cancer were selected as the control group.Peripheral blood samples were collected to extract DNA for testing HLA-DQB1 alleles by PCR-SSP.Result：（1）The gene frequencies of alleles HLA-DQB1*02/06/07 in the experimental group and the control group were 8.33% and 33.33% （ 字2=9.095，P=0.003），33.33% and 8.33%（ 字2=9.095，P=0.003），25.00% and 50.00% （ 字2=6.400，P=0.011） respectively；HLA-DQB1*04/05/08/09 were 0 and 8.33%，50.00% and 41.67%，25.00% and 16.67%，8.33% and 8.33% respectively（P>0.05）.（2）The gene frequencies of alleles HLA-DQB1*02/04/05/06/07/08/09 in the HBsAg positive and the HBsAg negative group were 15.79% and 22.08%，0 and 5.19%，42.11% and 46.75%，26.32% and 19.48%，47.37% and 35.06%， 21.05% and 20.78%，5.26% and 9.09% respectively（P>0.05）.（3）There were no significant correlation between LA-DQB1 alleles and sex（P>0.05）.Conclusion：（1）HLA-DQB1*02/07 may to be the antagonist genes of hepatocellular carcinoma of Guangxi Zhuang，and HLA-DQB1*06 may be susceptibility gene for its；（2）HLA-DQB1 allele may have no significant association with hepatitis B virus infection and sex in the high incidence area of Guangxi Zhuang.

【Key words】 HLA-DQB1； Allele； Hepatocellular carcinoma； Familial clustering

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.001

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的死亡率在各種惡性腫瘤中位居第三位，我國肝癌患者數(shù)量居世界首位，并有繼續(xù)升高的趨勢[1-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，廣西是我國乙肝病毒型肝炎和肝癌的高發(fā)區(qū)，并且在肝癌高發(fā)區(qū)中存在明顯的家族聚集現(xiàn)象[4-6]。肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但近年來的研究表明，原發(fā)性肝癌的發(fā)病可能與環(huán)境因素、遺傳因素及免疫功能等有一定的聯(lián)系[7]。人類白細(xì)胞抗原（HLA）作為個體組織細(xì)胞的遺傳標(biāo)志之一，在抗原的遞呈與識別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱等方面具有關(guān)鍵性的作用[8]。筆者前期的研究已發(fā)現(xiàn)HLA與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。本試驗應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)檢測廣西肝癌高發(fā)區(qū)人群HLA-DQB1等位基因的多態(tài)性，為尋找廣西壯族人群肝癌的遺傳易感基因或拮抗基因提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣西壯族肝癌高發(fā)區(qū)肝癌高發(fā)家族成員48例作為試驗組，以相同的生活條件、生活習(xí)慣以及生活水平、相同性別、年齡±5歲作為配對條件，選擇無癌家族成員48例作為對照組。肝癌高發(fā)家族的定義：有血緣關(guān)系的家族成員中發(fā)生過2例或2例以上的原發(fā)性肝癌（HCC）病例；無癌家族定義：有血緣關(guān)系的家族成員中未發(fā)生過任何惡性腫瘤病例的家族。試驗組中，男35例，女13例；平均年齡（28.79±18.01）歲；對照組中，男35例，女13例；平均年齡（30.40±16.99）歲。所有研究對象的HCV抗體均為陰性。所有肝癌病例診斷符合第四屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議修訂的肝癌標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與DNA提取 抽取研究對象空腹時外周靜脈血10 mL，其中5 mL自凝血用于乙肝兩對半（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，陽性者檢測乙肝病毒DNA）、丙肝抗體、肝功能等項目的檢測。5 mL抗凝血混勻分裝后，采用北京艾德萊生物科技有限公司的人基因組DNA試劑盒提取DNA，并保存于-80 ℃待測。

1.2.2 HLA-DQB1基因型的檢測 應(yīng)用天津秀鵬公司HLA-DQ基因分型低分辨檢測試劑盒（PCR-SSP法），嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 （1）PCR反應(yīng)體系的組成：1000 μL dNTP-Buffer工作液的配制：將440 μL濃縮dNTP-Buffer和560 μL無菌水充分混勻；配制Buffer-酶-樣本混合液：80 μL dNTP-Buffer工作液、0.7 μL Taq酶、8 μL DNA充分混合，分別向每個引物孔（1～8）各加入10 μL上述混合液。（2）擴(kuò)增條件：見表1。（3）PCR產(chǎn)物確定：將擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL加到2.5%瓊脂糖凝膠孔中，145 V電泳10～15 min，直到內(nèi)參帶和陽性帶清晰分開為止。

1.2.4 結(jié)果判讀 將膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果判讀參照試劑盒提供的結(jié)果分型表，如只檢測出一個等位基因，則視為純合子。試劑盒可檢出的范圍：HLA-DQB1*（02～09），其中HLA-DQB1*03歸為HLA-DQB1*（07～09），結(jié)果見圖1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，HLA-DQB1各基因位點(diǎn)分布用行X列 字2檢驗進(jìn)行分析，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度用比值比（odds ratio，OR=ad/bc）反映，計算兩組各位點(diǎn)基因分布頻率，雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HLA-DQB1各等位基因表達(dá)頻率的分布及比較 HLA-DQB1*02/06/07等位基因在試驗組及對照組的陽性率分別為8.33%和33.33%、33.33%和8.33%、25.00%和50.00%，兩組間此3種等位基因比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），HLA-DQB1*02/07等位基因在試驗組的表達(dá)頻率均顯著低于對照組，其OR值分別為0.182和0.333，HLA-DQB1*06等位基因在試驗組的表達(dá)頻率顯著高于對照組，其OR值為5.500，而HLA-DQB1*04/05/08/09等位基因在兩組間的頻率分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.2 HLA-DQB1各等位基因的表達(dá)與性別及HBV感染的相關(guān)性 統(tǒng)計結(jié)果表明，HLA-DQB1各等位基因與HBV感染、性別均無明顯相關(guān)（P>0.05），見表3～4。

3 討論

作為首次發(fā)現(xiàn)與疾病有明確關(guān)系的人類遺傳系統(tǒng)，人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）具有共顯性、多態(tài)性及多基因性等遺傳特征。迄今已有較多的研究表明，HLA Ⅱ類抗原的表達(dá)在部分腫瘤中存在異常[11-12]。本研究對HLA-DQB1各等位基因在廣西壯族人群肝癌高發(fā)家族組及無癌家族組中的表達(dá)頻率進(jìn)行結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，攜帶HLA-DQB1*02/07等位基因的家族成員發(fā)生肝癌的風(fēng)險明顯降低，此兩種等位基因可能是肝癌發(fā)生的拮抗基因，而HLA-DQB1*06等位基因表達(dá)的家族成員比無HLA-DQB1*06等位基因表達(dá)的家族成員發(fā)生原發(fā)性肝癌的幾率高5.500倍以上，其可能是肝癌發(fā)生的易感基因。HLA-DQB1*04/05/08/09等位基因可能與廣西壯族人群肝癌的家庭聚集現(xiàn)象及肝癌的發(fā)生發(fā)展無明顯關(guān)聯(lián)。

在不同國家、不同民族及地區(qū)，對HLA復(fù)合體與肝細(xì)胞癌之間的關(guān)聯(lián)性的研究，結(jié)果差異較大。金丹[13]在對大連地區(qū)肝癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*06基因可能是原發(fā)性肝癌的拮抗基因，而HLA-DQB1*03可能是易感基因。El-Chennawi等[14]對埃及地區(qū)肝癌患者研究表明，DQB1*02在肝癌患者中明顯高于正常組，DQB1*06則明顯低于正常組，從而推測DQB1*02可能為肝癌的易感基因，而DQB1*06可能為其保護(hù)基因。程元橋等[15]對湖北地區(qū)漢族人群的研究結(jié)果表明DQB1*0501等位基因與湖北地區(qū)漢人乙肝后肝硬化相關(guān)聯(lián)，推測其可能是湖北地區(qū)漢人乙肝后肝硬化的易感基因，而DQB1*0602則呈負(fù)相關(guān)，可能為其保護(hù)基因，而肝硬化極易導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。Li等[16]對山西地區(qū)人群HLA-DQB1等位基因研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*0202、*0301等位基因可能是乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌及家族性乙肝原發(fā)性肝癌的易感基因，HLA-DQB1*0302等位基因可能是家族性乙肝原發(fā)性肝癌的拮抗基因。HLA-DQB1*0301等位基因可能與肝細(xì)胞HBV-DNA復(fù)制有關(guān)，從而可能導(dǎo)致肝癌，而HLA-DQB1*0302等位基因可能會抑制HBV-DNA的復(fù)制從而減少肝癌的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA_DQB1*06等位基因可能是肝癌的易感基因，而HLA-DQB1*02/07等位基因則可能是肝癌的拮抗基因，與上述研究結(jié)果存在一定差異，這可能與研究對象的民族和地區(qū)分布有關(guān)，HLA-DQB1*06等位基因可能是肝癌的易感基因，可能是廣西壯族的一個民族特色。并且本試驗是以肝癌高發(fā)家族及無癌家族成員作為研究對象，均為正常人，而上述研究的試驗組都是肝癌患者，對照組為正常人，在研究對象的選擇上也與本試驗存在差異，這可能也是導(dǎo)致研究結(jié)果不同的原因。Chalub等[17]對巴西亞馬遜地區(qū)肝癌患者HLA-DQB1等位基因研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*04等位基因可能是HBV感染者發(fā)展為肝癌的危險因素。Xin等[18]進(jìn)行Meta分析證實(shí)HLA-DQB1*02（OR=1.78，P=0.03）、HLA-DQB1*03（OR=0.65，P=0.007）、DQB1*0502（OR=1.82，P=0.01）、DQB1*0602（OR=0.58，P=0.03）與肝癌發(fā)生的風(fēng)險顯著相關(guān)，根據(jù)其分析結(jié)果表明HLA-DQB1*02、DQB1*0502為HCC的危險因素，而HLA-DQB1*03、DQB1*0602則為其保護(hù)因素，本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*04/05可能對廣西壯族人群肝癌高發(fā)區(qū)肝癌的發(fā)生無明顯影響，表明HLA-DQB1*04/05的缺失可能與廣西肝癌的遺傳易感性無明顯相關(guān)，其可能只是廣西壯族人群的遺傳特征之一。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，廣西肝癌高發(fā)區(qū)的肝癌家族聚集性與HBV感染密切相關(guān)[19]。梁軍等[20]對新疆維吾爾族HLA-DQB1基因多態(tài)性與HBV感染結(jié)局相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，HLA-DQB1*0201可能是該族人群HBV感染的拮抗基因，DQB1*03可能是其易感基因，其中DQB1*0301與HBV的持續(xù)感染有關(guān)，而攜帶DQB1*0303的人群更易發(fā)展成為ASC，這可能與病毒的清除效率較低有關(guān)。本研究中HLA-DQB1各等位基因的表達(dá)頻率在HBV感染組與非HBV感染組間的比較均無顯著性差異（P>0.05），提示廣西壯族人群肝癌家族聚集性可能不是由于HLA-DQB1各等位基因造成機(jī)體對HBV感染的遺傳易感性所致。

本研究還存在一定的局限性，在后續(xù)的研究中，可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，以期望在基因水平上對原發(fā)性肝癌的家族聚集性進(jìn)行更深一步的探討。

參考文獻(xiàn)

[1] Jemal A，Bray，F(xiàn)，Center M M，et al.Global cancer statistics[J].CA：A Cancer Journal for Clinicians，2011，61（2）：69-90.

[2] Ferlay J，Shin H R，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2010，127（12）：2893-2917.

[3]陳萬青，鄭榮壽，張思維，等.2003～2007年中國癌癥發(fā)病分析[J].中國腫瘤，2012，21（3）：161-170.

[4]吳繼周，鐘世聰，劉啟福，等.廣西肝癌高發(fā)區(qū)五項危險因素與原發(fā)性肝癌關(guān)系的定群研究[J].廣西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1992，9（3）：12-15.

[5]沈立萍，楊進(jìn)業(yè)，莫兆軍，等.廣西壯族自治區(qū)1996～2005年乙型肝炎發(fā)病狀況監(jiān)測分析[J].疾病控制雜志，2007，11（2）：210-211.

[6]吳繼周，羅光漢，蘇明華，等.乙型肝炎病毒與丙型肝炎病毒及其基因亞型的重疊感染與原發(fā)性肝癌家庭聚集性的關(guān)系[J].中華流行病學(xué)雜志，2002，23（6）：488.

[7] Joo J K，Kim S H，Kim H G，et al.CpG methylation of transcription factor 4 in gastric carcinoma[J].Annals of Surgical Oncology，2010，17（12）：3344-3353.

[8] Wong C M，Ng I O.Molecular Pathogenesis of hepatocellular carcinoma[J].Liver Int，2008，28（2）：160-174.

[9]馬莎莎，吳繼周，吳健林，等.HLA-DRB1*03/04等位基因與廣西原發(fā)性肝癌家族聚集性的相關(guān)性[J].世界華人消化雜志，2013，21（4）：346-351.

[10]吳健林，吳繼周，韋穎華，等.HLA-DRB1*07/09/11等位基因?qū)V西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌家族聚集性的影響[J].應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，19（4）：193-198.

[11]吳靜，馬燕花.HLA-Ⅱ等位基因多態(tài)性及其與食管癌的相關(guān)性[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2004，11（5）：97-100.

[12]張素芳，史成章.胃癌及癌前病變中樹突狀細(xì)胞浸潤、HLA-DR抗原表達(dá)的臨床意義[J].腫瘤防治研究，2004，31（5）：261-263.

[13]金丹.原發(fā)性肝癌的發(fā)生與HLA-DRB1、HLA-DQB1基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2013.

[14] El-Chennawi F A，Auf F A，Metwally S S，et al.HLA-class Ⅱ alleles in Egyptian patients with hepatocellular carcinoma[J].Immunological Investigations，2008，37（7）：661-674.

[15]程元橋，林菊生，梁擴(kuò)寰，等.DQB1等位基因多態(tài)性與乙肝后肝硬化的遺傳易感性研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2005，14（3）：235-238.

[16] Li Q，Li X，Zhang L，et al.Correlation between polymorphisms in the human leukocyte antigen-DQB1 alleles and hepatitis B with primary hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of Hepatology，2015，23（4）：270-274.

[17] Chalub S R，da Silva R M，da Silva A P，et al.Evaluation of a histocompatibility antigen related to hepatitis B virus in patients with hepatocellular carcinoma in the western Brazilian Amazon[J].Genetics and Molecular Research：GMR，2013，12（2）：1336-1346.

[18] Xin Y N，Lin Z H，Jiang X J，et al.Specific HLA-DQB1 alleles associated with risk for development of hepatocellular carcinoma：a meta-analysis[J].World Journal of Gastroenterology：WJG，2011，17（17）：2248-2254.

[19]吳繼周，湯春園，蔣杰球，等.HBV感染及復(fù)制狀態(tài)在HCC家庭聚集性中的作用研究[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué)，1997，3（5）：10-12.

[20]梁軍，張永萍，楊曉筠，等.新疆維吾爾族HLA-DQB1基因多態(tài)性與HBV感染結(jié)局的相關(guān)性[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，48（5）：530-534.

（收稿日期：2015-12-29） （本文編輯：歐麗）