• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同濃度肝素對高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白的影響

    2016-05-14 10:36:59李鴿肖偉桂永豐丁敬韜任澤銀趙久陽
    關(guān)鍵詞:肝素

    李鴿 肖偉 桂永豐 丁敬韜 任澤銀 趙久陽

    【摘要】 目的:研究不同濃度梯度的肝素對高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1、AQP3蛋白表達(dá)的影響。方法:采用免疫組化法檢測試驗組與對照組AQP1、AQP3蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與對照組比較,試驗組AQP1和AQP3蛋白陽性表達(dá)均明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且AQP1和AQP3蛋白表達(dá)水平在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組呈現(xiàn)明顯上調(diào),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);免疫組化示2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組細(xì)胞可見胞核及胞漿有空泡樣改變。結(jié)論:大劑量肝素在高糖環(huán)境中可顯著誘導(dǎo)AQP1、AQP3的表達(dá),且能使胞漿及胞核出現(xiàn)明顯的空泡樣改變。

    【關(guān)鍵詞】 肝素; 人腹膜間皮細(xì)胞; 水通道蛋白

    The Effect of Different Concentrations of Heparin on the Expression of Aquaporins of Human Peritoneal Mesothelial Cells Induced by Glucose/LI Ge,XIAO Wei,GUI Yong-feng,et al.//Medical Innovation of China,2016,13(09):017-021

    【Abstract】 Objective:To investigate the effect of different concentrations of heparin on the expression of aquaporin-1(AQP1) and aquaporin-3(AQP3) of human peritoneal mesothelial cells(HPMCs) induced by glucose.Method:The expression levels of AQP1 and AQP3 were detected by immunohistochemistry in the control group and the experimental group.Result:Compared with the control group,the expression of AQP1 and AQP3 were upregulated in the experimental group treated by 2.5% glucose and 1.5×10-2 mg/mL of heparin,the differences were statistically significant(P<0.05).Vacuolation was observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and 1.5×10-2 mg/mL of heparin by immunohistochemistry.Conclusion:The expression of AQP1 and AQP3 can be upregulated by glucose and high concentration of heparin.Vacuolation can be observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and high concentration of heparin.

    【Key words】 Heparin; Human peritoneal mesothelial cells; Aquaporin

    First-authors address:The First Peoples Hospital of Changde,Changde 415000,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.005

    腹膜透析是腎臟替代治療方法之一,相對于血液透析而言,其具有維持血液動力學(xué)穩(wěn)定、保護(hù)殘余腎功能等優(yōu)勢。長期以來,一直認(rèn)為腹膜透析中水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式為簡單擴(kuò)散,但Agre等[1]發(fā)現(xiàn)了28KD通道構(gòu)成整合膜蛋白,提出了通道介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)方式。Rippe等[2]用電腦模型,首次對水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)用三孔模型進(jìn)行了解釋。超微孔(3-5?)被證實對水分子具有選擇通透性,水通道蛋白(aquaporins,AQPs)為超微孔的對應(yīng)物,可選擇性地跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子,某些小分子溶質(zhì)如甘油、尿素等也可被水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。水通道蛋白(aquaporin,AQP)廣泛存在于動、植物及微生物的細(xì)胞膜上,迄今為止,已發(fā)現(xiàn)200余種水通道蛋白,在哺乳動物中,已克隆并鑒定出13種水通道蛋白,分為別AQP0~AQP12[3]。在與吸收和分泌液體有關(guān)的上皮細(xì)胞和協(xié)同水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中這些AQPs廣泛存在。研究表明,在某些特定條件下,水通道蛋白的表達(dá)受到激素、滲透壓改變和某些藥物的影響[4]。Tang等[5]提出AQP1存在于腹膜間皮細(xì)胞上,滲透劑(如葡萄糖)可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Lai等[6]發(fā)現(xiàn)AQP3亦存在于腹膜間皮細(xì)胞上。臨床上腹透管堵塞為腹膜透析患者常見并發(fā)癥,為預(yù)防腹透管堵塞,肝素抗凝經(jīng)常使用于腹透液中。有研究顯示,大劑量肝素添加于含葡萄糖的腹透液中可使腹膜透析的超濾量增加[7],這是否是通過影響了腹膜間皮細(xì)胞中AQP1、AQP3的表達(dá)而實現(xiàn)的,未見相關(guān)報道。故本實驗觀察腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3經(jīng)高糖誘導(dǎo)后肝素對其表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器 (1)主要試劑:AQP1、AQP3一抗,美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;細(xì)胞消化液(0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2,Sigma公司產(chǎn)品;1640培養(yǎng)液,Invitrogen公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS),天津TBD公司產(chǎn)品;DAB顯色液,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);免疫組化SP試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;D-葡萄糖(分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;肝素鈉注射液(12 500 U/2 mL,12 500 U相當(dāng)于100 mg),江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。PBS液、D-Hanks平衡鹽溶液為本實驗室自行配置,過濾滅菌分裝,室溫保存。(2)主要儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱,德國賀力式公司;垂直層流潔凈工作臺,上海上凈凈化設(shè)備有限公司;高速臺式冷凍離心機(jī),德國賀力式儀器公司;紫外可見分光光度計(型號UV-9100),北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn);紫外分析儀(型號WFH-201):溫州市孚華分析儀器廠;倒置相差顯微鏡:日本奧利巴斯公司生產(chǎn)。

    1.2 人腹膜間皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 本實驗從連續(xù)性腹膜透析患者透出液中分離并提取人腹膜間皮細(xì)胞,無菌條件下收集患者流出液標(biāo)本,于4 ℃1000 r/min離心10 min,棄除上清。用D-Hanks平衡鹽溶液洗滌沉淀2次,將細(xì)胞接種于含10%(V/V)胎牛血清的1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,光鏡下觀察貼壁生長情況,待貼壁良好后用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,此后約每3天換液一次。待細(xì)胞生長融合成單層細(xì)胞后,用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA 2 mL混合液消化細(xì)胞,吸管吹打均勻,使細(xì)胞密度保持在(1×105~1×106)/mL。第二代細(xì)胞用于形態(tài)學(xué)及免疫組化鑒定,第三代細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。免疫組化顯示抗細(xì)胞角蛋白抗體陽性、抗波形蛋白抗體染色陽性,這正是間皮細(xì)胞的免疫學(xué)特征??沟冖蜃涌贵w和抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性,由此可排除血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。

    1.3 分組與處理 將培養(yǎng)至第三代的人腹膜間皮細(xì)胞均勻接種在6孔培養(yǎng)板上,當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)約80%融合狀態(tài)時,用無血清的1640培養(yǎng)液同步化24 h,使多數(shù)細(xì)胞處于G0期。用一定劑量的無菌注射用水稀釋肝素鈉注射液(50 mg/mL),配置不同濃度的肝素溶液;無菌稱取葡萄糖25 g,將其溶于無菌三蒸水1000 mL中,配置成2.5%高糖溶液。然后按照不同實驗要求隨機(jī)分為以下五組:(1)無葡萄糖、無肝素對照組;(2)2.5%葡萄糖組;(3)2.5×10-3mg/mL肝素+2.5%葡萄糖組;(4)5.0×10-3 mg/mL肝素+2.5%葡萄糖組;

    (5)1.5×10-2 mg/mL肝素+2.5%葡萄糖組。

    1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測AQP1、AQP3蛋白表達(dá) 吸取6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,用pH=7.4的PBS液沖洗3次,再用2%多聚甲醛冰上固定30 min。再用PBS沖洗,5 min/次,沖洗3次。待自然風(fēng)干后,用3%H2O2室溫避光孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗5 min,洗3次,正常血清封閉非特異性抗原10 min后,加Ⅰ抗AQP1、AQP3多克隆抗體(1∶200稀釋),置于4 ℃孵育過夜。PBS洗3次,5 min/次,加入生物素化Ⅱ抗37 ℃孵育30 min,PBS洗3次,5 min/次,加入鏈酶親和素-生物素-堿性磷酸酶復(fù)合物,37 ℃孵育30 min,PBS洗3次,5 min/次。在蓋玻片上滴加DAB顯色液,顯微鏡下觀察10 min,鏡下觀察至出現(xiàn)棕黃色陽性信號,蒸餾水水洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染,碳酸鋰水溶液(pH7.0~8.0)返藍(lán);梯度乙醇逐級脫水;透明,過二甲苯溶液;中性樹膠封片,自然風(fēng)干。光鏡下觀察拍照,每張切片鏡下隨機(jī)取5個視野,用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量出積光密度值(IOD),并計算平均光密度。著色越深,則IOD值越大,表明該蛋白表達(dá)水平越高,最后對各組的AQP1和AQP3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,看是否具有統(tǒng)計學(xué)差異。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間的比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    免疫組化結(jié)果顯示:無糖無肝素組、2.5%葡萄糖組中AQP1、AQP3蛋白均有表達(dá)(圖1~3),但在2.5%葡萄糖加不同濃度梯度的肝素組中AQP1、AQP3陽性表達(dá)均明顯高于無糖無肝素對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.82,P<0.05),胞核上亦可見棕黃色深染顆粒;與2.5%葡萄糖組比較,AQP1蛋白在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組中的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.92,P<0.05);以及2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組與2.5%葡萄糖加2.5×10-3 mg/mL及5.0×10-3 mg/mL肝素組比較,AQP1的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.25、4.59,P<0.05);而2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖組加2.5×10-3 mg/mL肝素組、2.5%葡萄糖組加5.0×10-3 mg/mL肝素組之間,組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.54,P>0.05),見圖4~6、圖10。與2.5%葡萄糖組比較,AQP3蛋白在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組中表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.51,P<0.05);2.5%葡萄糖加

    1.5×10-2 mg/mL肝素組與2.5%葡萄糖加

    2.5×10-3 mg/mL、5×10-3 mg/mL肝素組比較,AQP3蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.04、4.88,P<0.05);而2.5%葡萄糖組與2.5%葡萄糖加2.5×10-3 mg/mL、5×10-3 mg/mL肝素組比較,AQP3蛋白表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.91,P>0.05),見圖7~9、圖11。2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組細(xì)胞免疫組化圖片可見,胞核及胞漿有空泡樣變,而2.5%葡萄糖加常規(guī)劑量肝素組胞漿胞核未見明顯空泡樣變。

    3 討論

    自三孔模型的提出以來,水通道蛋白的研究逐漸引起人們的重視,它們對轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外的水分子有重要作用,某些小分子溶質(zhì)在特定情況下也可被其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)?,F(xiàn)有的研究提示在人的腹膜間皮細(xì)胞中存在AQP1、AQP3蛋白質(zhì)的表達(dá)[8]。AQP1為選擇性水通道蛋白,AQP3不僅對水通透,而且能介導(dǎo)甘油或尿素等小分子的通透性。研究證實,AQP3與腎臟尿濃縮能力密切相關(guān),如果AQP3缺失將會導(dǎo)致小鼠多飲多尿及腎萎縮等[9-10]。大鼠腹膜細(xì)胞上的AQP1經(jīng)HgCl2阻斷后,66%的水分子轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制[11]。目前認(rèn)為在腹膜間皮細(xì)胞跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)中AQP1、AQP3是其主要通道,其蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)或功能的改變,均對腹膜透析的水超濾改變有一定影響。研究表明,高糖腹透液可以促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞AQP1的表達(dá)[12],且能增加AQP1由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜上,從而增加該細(xì)胞對水的通透性。這種穿梭機(jī)制的存在提示AQP1在細(xì)胞內(nèi)分布的改變可能也與腹膜超濾衰竭的發(fā)生有關(guān)[13]。長期的腹膜透析可引起腹膜組織纖維化,導(dǎo)致超濾衰竭,使患者被迫放棄透析治療,極大影響腎衰竭患者的生活質(zhì)量。臨床上肝素作為常用抗凝劑,主要用于防止血栓形成或栓塞性疾病、DIC,亦用于血液透析、腹膜透析預(yù)防腹透管堵塞等抗凝。研究表明,低分子肝素還能延緩早期腎功能不全進(jìn)展,且對腎病綜合征患者療效較好[14-15]。但肝素或低分子肝素對經(jīng)高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3的表達(dá)是否有影響,國內(nèi)外相關(guān)報道甚少。由此筆者猜想肝素是否通過對高糖環(huán)境中腹膜間皮細(xì)胞上的水通道蛋白表達(dá)的影響來增加超濾及尿素排泄的。

    本研究通過人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)的體外培養(yǎng)實驗表明,與無糖無肝素對照組比較,2.5%葡萄糖組及不同濃度梯度的試驗組中AQP1和AQP3蛋白陽性表達(dá)均明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);且AQP1和AQP3蛋白表達(dá)水平在葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組呈現(xiàn)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);免疫組化示葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組細(xì)胞可見胞核及胞漿有空泡樣改變。本實驗主要闡述了肝素對腹膜間皮細(xì)胞上AQP表達(dá)的影響及1.5×10-2 mg/mL肝素對腹膜透析中腹膜間皮細(xì)胞可能存在的損傷作用,這種表現(xiàn)的具體過程及分子機(jī)制有待深入研究。筆者進(jìn)一步推測人腹膜間皮細(xì)胞中AQP1、AQP3表達(dá)或功能的改變可影響跨腹膜水轉(zhuǎn)運(yùn),甚至可導(dǎo)致腹膜超濾衰竭的發(fā)生。

    總之,本研究證實了在2.5%高糖環(huán)境下1.5×10-2 mg/mL大劑量肝素對體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞上AQP1、AQP3的表達(dá)有明顯上調(diào)作用,并致胞漿胞核出現(xiàn)空泡樣改變,而在常規(guī)劑量下未見此改變,提示中低劑量的肝素對人腹膜間皮細(xì)胞可能具有一定程度的保護(hù)作用。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Agre P,King L S,Yasui M,et al.Aquaporin water channels:from atomic structure to clinical medicine[J].J Physiol,2002,542(Pt 1):3-16.

    [2] Rippe B,Stelin G,Haraldsson B.Computer simulations of peritoneal fluid transport in CAPD[J].Kidney Int,1991,40(2):315-325.

    [3]杜偉偉,楊洪濤.AQP1與腹膜透析超濾相關(guān)研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012,13(11):1020-1023.

    [4]彭燕,仲建新.水通道蛋白結(jié)構(gòu)、分布與功能[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2011,8(9):194-196.

    [5] Tang S,Leung J C,Lam C W,et al.In vitro studies of aquaporins 1 and 3 expression in cultured human proximal tubular cells:upregulation by transferrin but not albumin[J].Am J Kidney Dis,2001,38(2):317-330.

    [6] Lai K N,Leung J C,Chan L Y,et al.Expression of aquaporin-3 in human peritoneal mesothelial cells and its up-regulation by glucose in vitro[J].Kidney International,2002,62(4):1431-1439.

    [7] Nakayama M,Kawaguchi Y,Yamada K,et al.Immunohistochemical detection of advanced glycosylation end-products in the peritoneum and its possible patho-physiological role in CAPD[J].Kidney Int,1997,51(1):182-186.

    [8]劉樹榮,張少斌.水通道蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,34(12):2260-2262.

    [9] Yang B,Ma T,Verkman A S.Erythrocyte water permeability and renal function in double knockout mice lacking aquaporin-1 and aquaporin-3[J].J Biol Chem,2001,276(1):624-628.

    [10] Shinzato T,Nakai S,Akiba T,et al.Survival in long-term haemodialysis patients:results from the annual survey of the Japanese Society for Dialysis Therapy[J].Nephrol Dial Transplant,1996,11(11):2139-2142.

    [11] Yang B,F(xiàn)olkesson H G,Yang J,et al.Reduced osmotic water permeability of the peritoneal barrier in aquaporin-1 knockout mice[J].Am J Physiol,1999,276(1 Pt 1):C76-81.

    [12]陳生曉,任昊,劉鄭榮,等.腹透液對大鼠腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1表達(dá)的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2008,33(1):72-74.

    [13]李正紅,張旭,曹麗萍,等.黃芪注射液對高糖腹透液作用下人腹膜間皮細(xì)胞AQP1表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(4):1148-1151.

    [14]張景云,韓麗芳,王新玲,等.低分子肝素對早期腎功能不全的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2011,8(30):33-34.

    [15]郝海英,鄭朝霞,徐嵐.低分子肝素鈣治療腎病綜合征的臨床研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2010,7(27):154-155.

    (收稿日期:2015-10-08) (本文編輯:歐麗)

    猜你喜歡
    肝素
    低分子肝素聯(lián)合阿司匹林治療子癇前期孕婦35例臨床觀察
    肝素在生物體內(nèi)合成機(jī)制研究進(jìn)展
    費(fèi)森尤斯血液透析機(jī)中肝素泵的故障處理及日常維護(hù)保養(yǎng)
    食神鞘氨醇桿菌(Sphingo spiritivorum)肝素酶的制備和性質(zhì)研究
    加熱法在無肝素血液灌流護(hù)理中的應(yīng)用
    低分子肝素鈣治療肺心病合并呼吸衰竭的效果研究
    肝素抗凝血漿用于急診生化檢驗的價值分析
    肝素聯(lián)合鹽酸山莨菪堿治療糖尿病足的療效觀察
    PCC中不同水平抗凝血酶和肝素對其促凝及抗凝能力的影響
    肝素結(jié)合蛋白在ST段抬高性急性心肌梗死中的臨床意義
    老司机深夜福利视频在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 中文字幕久久专区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产精品久久电影中文字幕| 18+在线观看网站| 在线天堂最新版资源| 久久亚洲精品不卡| 69av精品久久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 99热精品在线国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 88av欧美| 亚洲精品久久国产高清桃花| www.www免费av| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 波多野结衣巨乳人妻| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲人成网站在线播| 婷婷丁香在线五月| 三级毛片av免费| 国产麻豆成人av免费视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产成人av教育| 精品一区二区三区视频在线| 黄色丝袜av网址大全| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本 av在线| 丝袜美腿在线中文| 亚洲不卡免费看| 国产精品国产高清国产av| 五月伊人婷婷丁香| 精品久久久久久久末码| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲av五月六月丁香网| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲电影在线观看av| 国产精品1区2区在线观看.| 不卡一级毛片| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产乱人视频| 国产精品无大码| 91久久精品国产一区二区三区| 国产 一区精品| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 日本一本二区三区精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产免费一级a男人的天堂| 少妇丰满av| 国产91精品成人一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 国产欧美日韩精品亚洲av| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av美国av| 九色成人免费人妻av| 麻豆国产97在线/欧美| 麻豆国产av国片精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 身体一侧抽搐| 欧美精品国产亚洲| aaaaa片日本免费| 91在线观看av| 久久人人精品亚洲av| 天美传媒精品一区二区| 在线播放国产精品三级| 赤兔流量卡办理| 精品一区二区三区av网在线观看| 天堂√8在线中文| 久久精品国产清高在天天线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 床上黄色一级片| 国产亚洲91精品色在线| 国产av不卡久久| 免费av毛片视频| 天堂√8在线中文| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线观看午夜福利视频| 深爱激情五月婷婷| 波多野结衣高清作品| 免费高清视频大片| 久久中文看片网| 成年女人永久免费观看视频| 深爱激情五月婷婷| 日本黄大片高清| 久久久久久伊人网av| 高清日韩中文字幕在线| 日韩强制内射视频| 欧美一区二区亚洲| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 综合色av麻豆| 我要搜黄色片| 欧美黑人巨大hd| 中亚洲国语对白在线视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久久久久大av| 久久九九热精品免费| 免费在线观看日本一区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费看av在线观看网站| 国语自产精品视频在线第100页| 草草在线视频免费看| 午夜老司机福利剧场| 老女人水多毛片| 精品一区二区三区人妻视频| 深爱激情五月婷婷| av黄色大香蕉| 日韩欧美 国产精品| 欧美性猛交黑人性爽| 热99re8久久精品国产| 欧美日本视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美黑人巨大hd| 国产高清三级在线| 国产高潮美女av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品一区二区三区四区久久| 在线看三级毛片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产主播在线观看一区二区| 春色校园在线视频观看| 欧美潮喷喷水| 美女大奶头视频| 欧美成人a在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲自偷自拍三级| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本成人三级电影网站| 床上黄色一级片| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲最大成人中文| 99在线人妻在线中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品人妻久久久影院| 欧美日韩乱码在线| www.色视频.com| 日日啪夜夜撸| 在线观看av片永久免费下载| 我要看日韩黄色一级片| 一进一出抽搐动态| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲成人久久性| 欧美黑人欧美精品刺激| 禁无遮挡网站| 国产精品久久电影中文字幕| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一本一本综合久久| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产黄片美女视频| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费观看的影片在线观看| 日韩欧美在线二视频| 国产黄片美女视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品,欧美在线| 亚洲精华国产精华精| 91麻豆av在线| 国语自产精品视频在线第100页| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人无遮挡网站| 精品无人区乱码1区二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品一区二区性色av| 综合色av麻豆| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 最新在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 嫩草影院入口| 韩国av一区二区三区四区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 人妻少妇偷人精品九色| 特级一级黄色大片| 哪里可以看免费的av片| 在线播放国产精品三级| 成人三级黄色视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品成人久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 不卡一级毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 我要看日韩黄色一级片| 麻豆国产av国片精品| 亚洲在线自拍视频| 无遮挡黄片免费观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品野战在线观看| 久久国产乱子免费精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成人特级av手机在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 日本黄色片子视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 97热精品久久久久久| 欧美高清成人免费视频www| 国产伦精品一区二区三区视频9| 在线免费十八禁| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产av一区在线观看免费| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲最大成人中文| 国产一区二区三区在线臀色熟女| av在线老鸭窝| 色在线成人网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲经典国产精华液单| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 真人做人爱边吃奶动态| 深夜精品福利| 亚洲图色成人| 美女大奶头视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 精品不卡国产一区二区三区| 嫩草影院新地址| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品久久久久久久久亚洲 | 美女免费视频网站| av女优亚洲男人天堂| 黄色配什么色好看| 嫩草影院精品99| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久这里只有精品中国| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产午夜福利久久久久久| а√天堂www在线а√下载| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日本黄大片高清| 精品久久久久久久久av| 国产色爽女视频免费观看| 国产老妇女一区| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 高清日韩中文字幕在线| 老司机福利观看| 嫩草影视91久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 看免费成人av毛片| 免费观看人在逋| 联通29元200g的流量卡| 亚州av有码| 久久草成人影院| 国产爱豆传媒在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 精品福利观看| 日本a在线网址| 日日夜夜操网爽| 男女做爰动态图高潮gif福利片| x7x7x7水蜜桃| 一进一出抽搐gif免费好疼| 中国美女看黄片| 搞女人的毛片| 舔av片在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩精品有码人妻一区| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 精品人妻1区二区| 久久国内精品自在自线图片| .国产精品久久| 一夜夜www| 在线国产一区二区在线| 色哟哟·www| 国产大屁股一区二区在线视频| www日本黄色视频网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 小说图片视频综合网站| 亚洲五月天丁香| 欧美人与善性xxx| 国产精品三级大全| 中文字幕久久专区| 精品午夜福利在线看| 内地一区二区视频在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99久国产av精品| 日韩精品青青久久久久久| 成年人黄色毛片网站| 欧美最新免费一区二区三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩欧美在线乱码| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人a区在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩欧美国产一区二区入口| 少妇人妻精品综合一区二区 | 窝窝影院91人妻| 国产私拍福利视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品,欧美在线| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲人成网站在线播| 成年版毛片免费区| 黄色女人牲交| 成年免费大片在线观看| 国产av在哪里看| 国产成人aa在线观看| 亚洲电影在线观看av| 亚洲精华国产精华精| 黄色配什么色好看| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美激情国产日韩精品一区| 天美传媒精品一区二区| 国产探花极品一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩一区二区视频免费看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 老司机福利观看| 国产一区二区三区av在线 | 久99久视频精品免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲专区国产一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产熟女欧美一区二区| 午夜福利视频1000在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产黄片美女视频| 一区二区三区免费毛片| 日本成人三级电影网站| 国产精华一区二区三区| av.在线天堂| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产熟女欧美一区二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成年版毛片免费区| 一区二区三区免费毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费观看的影片在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 成年人黄色毛片网站| 欧美三级亚洲精品| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 欧美黑人巨大hd| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 国产激情偷乱视频一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产视频一区二区在线看| 亚州av有码| 91麻豆av在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲av熟女| 国产高清三级在线| 小说图片视频综合网站| 久久中文看片网| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲人成网站高清观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一个人看的www免费观看视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费看光身美女| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美三级亚洲精品| 国产精品一区www在线观看 | 亚洲国产色片| 男人舔奶头视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 伦精品一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 国产黄片美女视频| 春色校园在线视频观看| 成人av一区二区三区在线看| 精品无人区乱码1区二区| av中文乱码字幕在线| 国产日本99.免费观看| 日本与韩国留学比较| 欧美中文日本在线观看视频| 精品久久久久久久久亚洲 | 九色成人免费人妻av| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美一区二区亚洲| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩欧美精品免费久久| av在线蜜桃| 国产精品一区www在线观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品久久久久久久久av| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本免费a在线| 看免费成人av毛片| 在线观看午夜福利视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 美女高潮的动态| 精华霜和精华液先用哪个| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 国产精品野战在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 在线观看66精品国产| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲成人久久性| 无人区码免费观看不卡| 美女免费视频网站| 日韩欧美国产在线观看| 精品久久国产蜜桃| 欧美人与善性xxx| 免费人成视频x8x8入口观看| 动漫黄色视频在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av一区综合| 伦理电影大哥的女人| 在线观看午夜福利视频| ponron亚洲| 久久精品国产亚洲网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 88av欧美| 女人被狂操c到高潮| 欧美区成人在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本免费a在线| 午夜久久久久精精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99久久精品国产国产毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 麻豆成人午夜福利视频| 免费看光身美女| 丰满人妻一区二区三区视频av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 午夜精品在线福利| 亚洲 国产 在线| 亚洲精品456在线播放app | 少妇的逼水好多| 一个人免费在线观看电影| 黄色日韩在线| 最近在线观看免费完整版| 精品人妻1区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 色吧在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| av专区在线播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品久久久久久久久免| 最好的美女福利视频网| 一进一出抽搐动态| 22中文网久久字幕| 久久草成人影院| 香蕉av资源在线| 99久久精品一区二区三区| 日本免费a在线| 99久久九九国产精品国产免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av中文av极速乱 | 97碰自拍视频| 欧美高清性xxxxhd video| 美女黄网站色视频| 91在线观看av| 久久午夜福利片| 国产免费一级a男人的天堂| 99热这里只有是精品在线观看| 成人国产麻豆网| 亚洲在线观看片| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美最新免费一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 美女大奶头视频| 国产综合懂色| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美最新免费一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜福利欧美成人| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 黄色视频,在线免费观看| 黄色日韩在线| 无人区码免费观看不卡| 热99在线观看视频| 99久久精品一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99热精品在线国产| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美三级亚洲精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩欧美三级三区| 在线播放无遮挡| 一区二区三区免费毛片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本三级黄在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 看十八女毛片水多多多| 国产成人aa在线观看| 少妇丰满av| 窝窝影院91人妻| 岛国在线免费视频观看| 国产高清视频在线播放一区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 伊人久久精品亚洲午夜| 国内精品宾馆在线| 搡老岳熟女国产| 国内精品久久久久精免费| 嫩草影院新地址| 国内精品美女久久久久久| 国产69精品久久久久777片| 色吧在线观看| 欧美+日韩+精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 国内精品美女久久久久久| 免费看日本二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久色成人| 精品久久久久久久久亚洲 | 69人妻影院| 国产一级毛片七仙女欲春2| 色视频www国产| 一进一出好大好爽视频| 男女那种视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 日本a在线网址| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 搞女人的毛片| av视频在线观看入口| 国产毛片a区久久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产免费男女视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产伦在线观看视频一区| 一夜夜www| h日本视频在线播放| 高清毛片免费观看视频网站| 国产极品精品免费视频能看的| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品在线观看二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 少妇丰满av| 日韩欧美国产在线观看| 天堂动漫精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| av在线亚洲专区| 日本a在线网址| 婷婷亚洲欧美| 日韩av在线大香蕉| 国产精品久久久久久久电影| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩欧美精品v在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 黄色女人牲交| 亚洲午夜理论影院| 久久九九热精品免费| 色噜噜av男人的天堂激情| 看黄色毛片网站| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 看片在线看免费视频| 性色avwww在线观看| 美女大奶头视频| 99久久精品一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产欧美日韩精品一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成人美女网站在线观看视频| 夜夜爽天天搞| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久精品大字幕| 嫩草影院入口| 国产爱豆传媒在线观看| 99久国产av精品| 亚州av有码| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 美女 人体艺术 gogo| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲av第一区精品v没综合| 悠悠久久av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 狠狠狠狠99中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看|