青年人胃癌中Cathepsin B的表達(dá)及意義

何琳莉，文　彬,蹇順海

(川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充　637000)

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青年人胃癌中Cathepsin B的表達(dá)及意義

何琳莉，文彬,蹇順海

(川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充637000)

摘要：檢測了Cathepsin B在青年人胃癌組織中的表達(dá)，探討其與腫瘤發(fā)生機制的關(guān)系。采用免疫組化方法(S-P法)及原位雜交法檢測Cathepsin B蛋白及其mRNA在52例青年人胃癌組織、15例胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織及15例癌旁組織中的表達(dá)；分析Cathepsin B的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明：青年人胃癌中Cathepsin B陽性表達(dá)率顯著高于胃高級別上皮內(nèi)瘤變(P<0.05)，癌旁組織不表達(dá)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)增高(P<0.05)；Cathespin B mRNA在胃癌中高表達(dá)，非癌組織中幾乎不表達(dá)，與蛋白表達(dá)基本一致。說明Cathepsin B的高表達(dá)在青年人胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，其表達(dá)水平可能成為提示胃癌轉(zhuǎn)移的良好指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：青年人胃癌；免疫組織化學(xué)；原位雜交

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率以及死亡率位居我國各種惡性腫瘤之首[1]。近年來，胃癌的發(fā)病規(guī)律有所變化，青年人(年齡≤35歲)胃癌的發(fā)病率呈上升趨勢[2]。大量研究表明：青年人胃癌具有更強的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，而胃癌的預(yù)后與胃癌分化、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。

組織蛋白酶B屬于半胱氨酸蛋白酶，主要存在于胞漿溶酶體中，可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)外蛋白水解的平衡。目前多數(shù)研究認(rèn)為高表達(dá)的Cathepsin B與腫瘤的惡性進(jìn)展關(guān)系密切[5]。在膀胱癌、肺癌、口腔癌、胰腺癌等惡性腫瘤中檢測到Cathepsin B表達(dá)增強，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]。目前在胃癌與Cathepsin B表達(dá)的相關(guān)性方面的研究較少。本文采用免疫組化及原位雜交法檢測青年人胃癌組織中Cathepsin B蛋白及其mRNA的表達(dá)，并結(jié)合患者臨床病理參數(shù)探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本

收集2003—2013年川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科確診存檔的青年人胃腺癌標(biāo)本52例(患者年齡≤35歲，參照國內(nèi)多數(shù)文獻(xiàn)報道對病人年齡段分組納入本研究)，將15例胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織及15例癌旁組織作為對照組。癌旁組織均含有胃黏膜，經(jīng)HE染色確診胃黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，無癌細(xì)胞累及。

1.2主要試劑及抗體

Cathepsin B兔抗人單克隆抗體購自美國epitomics公司；Cathepsin B原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司；二步法即用型檢測試劑及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3免疫組化

采用EnVision兩步法檢測Cathepsin B蛋白的表達(dá)情況。所用石蠟塊組織均經(jīng)連續(xù)切片、常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明處理、封片等步驟。結(jié)果判定：cathepsin B表達(dá)部位主要位于癌細(xì)胞胞漿，部分位于細(xì)胞核內(nèi)。使用DAB顯色系統(tǒng)染色，陽性結(jié)果為細(xì)胞漿內(nèi)彌漫分布染色明顯的棕黃色顆粒。在光學(xué)顯微鏡下觀察(隨機選取5個高倍視野)，根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強度及百分率計分[9]，其中：染色陽性細(xì)胞百分率小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，50%～75%為3分，大于75%為4分；細(xì)胞基本無著色為0分，細(xì)胞為淺黃色為1分，細(xì)胞為棕黃色為2分，細(xì)胞為棕色為3分。陽性程度按照上述兩項的乘積判定：0分記錄為陰性(-)，1～4分記錄為弱陽性(+)，5～8分記錄為中度陽性(++)，9～12分記錄為強陽性(+++)。

1.4原位雜交

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水、3%過氧化氫滅活(10 min)、3%胃蛋白酶消化(10 min)、0.1 MPBS緩沖液后固定、滴加預(yù)雜交液、電熱恒溫箱42 ℃孵育(3 h)、滴加雜交液、電熱恒溫箱42 ℃孵育(24 h)、SSC緩沖液洗滌切片、滴加封閉液、滴加ISH(1 h)、電熱恒溫箱42 ℃孵育(1 h)、DAB顯色(10 min)、蘇木素復(fù)染(5 min)、酒精脫水(15 min)、封片。結(jié)果判定：使用POD/DAB顯色系統(tǒng)，陽性信號呈棕黃色，主要位于細(xì)胞漿，少數(shù)細(xì)胞核著色。隨機選取5個高倍視野(每個視野細(xì)胞數(shù)量大于200)，將陽性細(xì)胞數(shù)大于等于5定為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組間比較采用χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1不同胃組織中Cathepsin B蛋白的表達(dá)

Cathepsin B蛋白定位于細(xì)胞漿，在癌旁組織、胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織及胃癌組織中的陽性率分別為0，13.3%，59.6%(圖1)。Cathepsin B在癌旁組織中無表達(dá)，在胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織中有2例表達(dá)。在胃癌組織中的陽性表達(dá)率與胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織相比顯著增高，且染色強度明顯加強，差異具有顯著性(P<0.01，見表1)。

圖1　Cathepsin B蛋白的表達(dá)

組別nCathepsinB-++++++癌旁組織1515000胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織1513110胃癌組織522161114

2.2胃癌中Cathepsin B蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Cathepsin B蛋白在淋巴結(jié)有、無轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為72.4%,43.5%；有、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為90.9%,51.2%；浸潤深度組中，T3—T4期、T1—T2期的陽性率分別為70.2%,33.3%。統(tǒng)計結(jié)果顯示:Cathepsin B蛋白的表達(dá)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但與患者性別、分化程度、腫塊大小、臨床分期無明顯相關(guān)性(P>0.05)。具體情況見表2。

表2　Cathepsin B蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3不同胃組織中Cathepsin B mRNA的表達(dá)

Cathepsin B mRNA陽性信號位于細(xì)胞漿。在癌旁組織、胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織及胃癌組織中的陽性率分別為0，6.7%，51.9%(見圖2)。Cathepsin B mRNA 在癌旁組織中無表達(dá)，在胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織中僅有1例微弱表達(dá)。胃癌中的陽性表達(dá)率顯著高于胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織(P<0.01)，與蛋白表達(dá)基本一致(見表3)。

圖2　Cathepsin B mRNA的表達(dá)

組別nCathepsinB-++++++癌旁組織1515000胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織1514100胃癌組織522551012

3討論

浸潤、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征性表現(xiàn)，也是多數(shù)實質(zhì)性惡性腫瘤難以治愈的原因。胃癌與其他惡性腫瘤一樣，其侵襲轉(zhuǎn)移是涉及多因素、多階段的連續(xù)動態(tài)過程。其中，基底膜成分的降解與腫瘤的惡性進(jìn)展關(guān)系極為密切[10]。在這復(fù)雜的病理生理過程中，腫瘤細(xì)胞與其周圍的基質(zhì)細(xì)胞可分泌多種酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，促使腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移。Cathepsin B屬于半胱氨酸蛋白酶類，是一類主要存在于溶酶體中的胞內(nèi)蛋白酶，其家族成員包括數(shù)十種亞型，如B、K、L、M、N、H等，目前研究較為多見的是B、L、D型。在生理狀態(tài)下，Cathepsin B可發(fā)揮降解多種蛋白質(zhì)的重要作用，維持細(xì)胞內(nèi)外蛋白水解的平衡。而在病理狀態(tài)下，Cathepsin B能水解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等，參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移[11]。目前，在多種實體惡性腫瘤中可檢測到Cathepsin B的高表達(dá)[12-14]。Ma等[15]研究發(fā)現(xiàn)：Cathepsin B在正常人食管黏膜無表達(dá)，而在食管癌及食管癌前病變中表達(dá)增高，并且在食管鱗癌裸鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)Cathepsin B高表達(dá)。在宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)[16]：Cathepsin B在宮內(nèi)膜癌中的陽性率顯著高于正常宮內(nèi)膜，且在抑制宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中Cathepsin B基因后癌細(xì)胞增殖能力顯著降低。在另一項關(guān)于胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)[17]：Cathepsin B在胃癌中活性顯著增高是其獨有的惡性表現(xiàn)，可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。Ebert 等[18]實驗發(fā)現(xiàn)：Cathepsin B在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為98%，在胃癌患者血清中的陽性率顯著高于健康對照組(P<0.01)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者血清水平明顯增高(P<0.05)，且Cathepsin B 血清水平高于129 pmol/L的患者生存率降低(P<0.05)，表明Cathepsin B可以作為胃癌診斷中判斷患者預(yù)后的潛力指標(biāo)。但Czyzewska等[19]研究認(rèn)為：Cathepsin B表達(dá)水平僅與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者5年生存率無相關(guān)性，因此Cathepsin B不能作為提示胃癌患者預(yù)后的獨立因素。

本文用青年人胃癌標(biāo)本、胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織、癌旁組織研究Cathepsin B蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：Cathepsin B蛋白及mRNA在癌旁組織均無表達(dá)；在胃癌組織中，無論是蛋白陽性表達(dá)率、表達(dá)強度或是 mRNA陽性表達(dá)率及表達(dá)強度均顯著高于胃高級別上皮內(nèi)瘤變組織，說明Cathepsin B表達(dá)增加可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要基礎(chǔ)。在本次實驗中，mRNA表達(dá)總體陽性率低于蛋白表達(dá)陽性率，但其結(jié)果分析與前者基本一致，這可能與檢測手段的敏感性不同有關(guān)。有報道指出，Cathepsin B在多種腫瘤浸潤邊緣處有表達(dá)增強的情況發(fā)生[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織的良-惡性分界處表達(dá)明顯，這可能與Cathepsin B參與腫瘤細(xì)胞對周圍組織的粘附及對細(xì)胞外基質(zhì)屏障的降解有關(guān)。此外，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移組及浸潤漿膜層組中均出現(xiàn)Cathepsin B蛋白的表達(dá)增加，提示Cathepsin B有可能成為判斷胃癌惡性程度、提示高轉(zhuǎn)移風(fēng)險的生物學(xué)指標(biāo)之一。

綜合以上分析， Cathepsin B在癌旁組織無表達(dá)，在青年人胃癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)有關(guān)。提示Cathepsin B與青年人胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為診斷胃癌的有效指標(biāo)之一，且為胃癌的靶向治療提供新的思路，具有廣泛的研究前景。

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(責(zé)任編輯何杰玲)

Expression of Cathepsin B and Its Significance in Gastric Cancer Tissue of Young Patient

HE Lin-li, WEN Bin, JIAN Shun-hai

(North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China)

Abstract:Cathepsin B expression in gastric cancer tissue in young people was detected and its relationship with the tumorigenesis mechanism was explored. The immunocytochemistry method (S-P method) and in-situ hybridization method were adopted to detect Cathepsin B and the expression of mRNA in 52 cases of gastric cancer tissues, 15 cases of gastric bypass high-grade intraepithelial neoplasia and 15 cases of cancer tissues. The positive rate of Cathepsin B in the gastric cancer tissue of non-selected people significantly exceeds non-typical gastric proliferating tissue, and there is no expression of normal appearing tissue(P<0.05). And there is a rise of expression among lymphatic metastasis and distant metastasis among young patients(P<0.05). The high expression of cathespin B mRNA in stomach cancer and the no expression in non-cancer tissue, which is in accord with the expression of protein. The high expression of Cathepsin B in gastric cancer occurrence and development plays an important role in the process and its expression level may be prompted a good index of the gastric cancer metastasis.

Key words:young patients with gastric cancer; immunocytochemistry; in-situ hybridization

中圖分類號：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 1674-8425(2016)03-0069-05

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.03.012

作者簡介：何琳莉(1989—)，女，四川南充人，碩士，主要從事消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

收稿日期：2015-12-12

引用格式：何琳莉，文彬,蹇順海.青年人胃癌中Cathepsin B的表達(dá)及意義[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué))，2016(3):69-73.

Citation format：HE Lin-li, WEN Bin, JIAN Shun-hai.Expression of Cathepsin B and Its Significance in Gastric Cancer Tissue of Young Patient[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2016(3):69-73.