固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水果中5種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量

仲伶俐，胡　莉，郭靈安，雷紹榮，毛建霏，李　曦，歐陽華學

(四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川　成都　610066)

固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水果中5種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量

仲伶俐，胡莉，郭靈安*，雷紹榮，毛建霏，李曦，歐陽華學

(四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川成都610066)

摘要：建立了固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時測定水果中6-芐基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑5種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的分析方法。水果樣品經(jīng)乙腈提取，NH2固相萃取小柱進行富集、凈化，以二氯甲烷-甲醇(92∶8)為洗脫溶液，濃縮定容后，用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱分離，流速0.3 mL/min，以水-甲醇為流動相梯度洗脫，于UPLC-MS/MS儀多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式測定，基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。結(jié)果表明，5種植物生長調(diào)節(jié)劑在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 1～0.999 6。在0.004，0.02，0.1 mg/kg加標水平下，方法的回收率為75.6%～110.5%，相對標準偏差(RSD)為1.2%～12.8%，方法檢出限(LOD,S/N≥3)為0.001～0.002 mg/kg，定量下限(LOQ,S/N≥10)為0.003～0.006 mg/kg。該方法操作簡便、靈敏度高、準確可靠，適用于水果中5種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的同時測定。

關(guān)鍵詞：固相萃取;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;水果;植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulator，PGR) 又稱外源植物激素，是人工合成的與內(nèi)源激素有相似生理作用的生長物質(zhì)。6-芐基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑均為植物生長調(diào)節(jié)劑，對果樹休眠、生根、生長、花芽分化、著果、果實發(fā)育、成熟期、果實品質(zhì)及抗逆性方面有調(diào)節(jié)作用，已被廣泛應(yīng)用于果樹生長過程[1-4]。日本對水果中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留限量的規(guī)定最為詳細，其對多種水果中6-芐基腺嘌呤、氯吡脲和多效唑均有限量要求，分別為0.02～0.1 mg/kg,0.01～0.1 mg/kg和0.01～1 mg/kg;烯效唑在草莓和鱷梨中的最大殘留限量為0.1，0.5 mg/kg[2,5]。而我國規(guī)定噻苯隆在葡萄和甜瓜中的最大殘留限量為0.05 mg/kg;氯吡脲在橙、枇杷、獼猴桃、葡萄中的最大殘留限量為0.05 mg/kg;多效唑在蘋果、荔枝中的最大殘留限量為0.5 mg/kg;6-芐基腺嘌呤和烯效唑尚無限量要求[6]。

目前植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的測定方法有衍生化氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8-10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-16]。由于植物生長調(diào)節(jié)劑的化學性質(zhì)差異較大，殘留量低，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀以其高選擇性和高靈敏度在多種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留同時測定中頗具優(yōu)勢[17]，樣品前處理通常采用QuEChERS法[11-12]或固相萃取(SPE)法[13-16]，雖然QuEChERS法簡單、快速，但SPE法在除雜質(zhì)能力和穩(wěn)定性上更加優(yōu)越。本文采用氨基固相萃取小柱凈化樣品，UPLC-MS/MS同時測定水果中6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑殘留量，前處理凈化時只使用1種淋洗液，相比于文獻中使用多種淋洗液或洗脫液的SPE法，更加簡便、快捷，操作時間短，凈化效果好，準確度和靈敏度能夠滿足國內(nèi)外限量標準的要求。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司);IKA T18高速勻質(zhì)機(德國IKA公司)，R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi公司)，LD5-2A高速離心機(北京京立離心機有限公司)，WH-3微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，DT-1002A電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)，0.22 μm微孔濾膜(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)。

5種植物生長調(diào)節(jié)劑標準品：6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑、烯效唑(純度≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈、二氯甲烷(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司);氯化鈉(分析純，西隴化工有限公司);NH2固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國Thermo公司);Florisil固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國Agilent公司);實驗用水均由優(yōu)普超純水系統(tǒng)制備。

1.2試樣制備

取不少于1 000 g樣品，取可食部分，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面的附著物，將樣品縮分至250 g，粉碎后密封，制成試樣備用，剩余試樣于-18 ℃保存。

1.3樣品前處理

稱取10 g粉碎好的試樣于100 mL具塞離心管中，加入20.0 mL乙腈，高速勻漿2 min，加入10 g氯化鈉，蓋上蓋子，劇烈振搖1 min，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min，使乙腈和水相分層。移取10.0 mL上層乙腈溶液至100 mL梨形瓶中，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入4 mL二氯甲烷-甲醇(92∶8)淋洗液溶解殘渣，并將該樣品溶液移入用淋洗液活化好的NH2固相萃取小柱中，收集流出液于50 mL雞心瓶中，用3.0 mL淋洗液洗滌梨形瓶2次，移入NH2固相萃取小柱，合并洗脫液，在30 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用2.0 mL甲醇-水(1∶1)溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，供高效液相色譜測定。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流速：0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量5 μL;流動相：A為水，B為甲醇;洗脫程序：0～1.0 min，60% A;1.0～3.0 min，60%～30% A;3.0～4.0 min，30%～10% A;4.0～4.2 min，10%～60% A;4.2～5.2 min，60%A。

電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，毛細管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣(N2)溫度：350 ℃，脫溶劑氣流速：700 L/h，錐孔氣流速：50 L/h，碰撞氣(Ar)流速：2.5 L/h。5種植物生長調(diào)節(jié)劑的定性、 定量離子對等質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1　5種植物生長調(diào)節(jié)劑的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)

*quantitative ion

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的選擇

5種植物生長調(diào)節(jié)劑在C18色譜柱上均有很好的保留，實驗選擇1.7 μm C18色譜柱，采用梯度洗脫，提高了單位樣品的分析效率并減少了強保留雜質(zhì)在色譜柱的累積?？疾炝怂?甲醇、0.1%甲酸-甲醇、1 mmol/L醋酸銨-甲醇、0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨4種流動相的分離效果，最終確定以水-甲醇為流動相，在“1.4”梯度洗脫條件下，5種植物生長調(diào)節(jié)劑均能獲得較好的色譜峰形和穩(wěn)定的信號強度。

2.2質(zhì)譜條件的確定

5種植物生長調(diào)節(jié)劑均易離子化，適合采用ESI源。實驗首先采用直接進樣方式，分別在ESI+/ESI-模式下找到母離子，然后通過調(diào)節(jié)碰撞能量選擇2個相對豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子，分析時再結(jié)合化合物的保留時間等信息，進行定性、定量分析。5種植物生長調(diào)節(jié)劑的離子對及其對應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3凈化方法的選擇

水果樣品經(jīng)乙腈提取，鹽析分層，目標物連同雜質(zhì)被萃取至乙腈溶液中。本研究通過對Florisil和NH2凈化柱，以及丙酮-正己烷、乙酸乙酯-乙醇、二氯甲烷-甲醇3種洗脫溶劑采用正交試驗進行回收率效果測試，最終確定以NH2小柱凈化，10 mL二氯甲烷-甲醇(92∶8)為洗脫液。此凈化條件下，5種植物生長調(diào)節(jié)劑的特征離子在水果樣品中具有很好的特異性，草莓加標樣品的MRM圖譜見圖1。

2.4線性范圍、檢出限與定量下限

配制5種植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度分別為5，10，50，100，500 ng/mL的混合標準溶液，在優(yōu)化實驗條件下測定，以標準溶液的質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標，對應(yīng)峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，5種待測物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果顯示，5種植物生長調(diào)節(jié)劑在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 1～0.999 6。通過加標回收實驗，根據(jù)信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10的峰響應(yīng)值與樣品前處理的稀釋倍數(shù)，得出各化合物的方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。5種植物生長調(diào)節(jié)劑的方法LOD為0.001～0.002 mg/kg，LOQ為0.003～0.006 mg/kg，均滿足國內(nèi)外限量標準的要求。

圖1　草莓加標樣品中5種植物生長調(diào)節(jié)劑的MRM圖譜(0.004 mg/kg)

CompoundRegressionequationr2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)6-BAy=898.59x+822.060.99920.0010.003Thidiazurony=505.46x+1826.250.99960.0020.006Forchlorfenurony=644.44x+455.960.99860.0010.003Paclobutrazoly=27.10x-22.050.99950.0020.006Uniconazoley=204.70x+3959.230.99610.0010.003

2.5方法的準確度與精密度

選擇蘋果、葡萄、李子、芒果、獼猴桃、草莓6種水果樣品進行基質(zhì)加標回收實驗，加標濃度為0.004，0.02，0.1 mg/kg，回收率和相對標準偏差(RSD)見表3。結(jié)果顯示，6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑在水果樣品中的平均回收率為75.6%～110.5%，RSD為1.2%～12.8%，本方法下5種植物生長調(diào)節(jié)劑具有良好的準確度與精密度，符合多農(nóng)殘分析要求。

表3　5種植物生長調(diào)節(jié)劑在水果中的加標回收率和RSD(n=6)

2.6實際樣品的測定

采用本方法對30個草莓樣品進行測定，其中噻苯隆未檢出，6-芐基腺嘌呤、氯吡脲、多效唑和烯效唑均有檢出，其殘留量分別為0.001～0.048 mg/kg，0.011～0.043 mg/kg，0.006～0.064 mg/kg和0.008 1～0.023 mg/kg。

3結(jié)論

本文建立了氨基固相萃取小柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定水果中6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑殘留量的方法。5種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出限為0.001～0.002 mg/kg，定量下限為0.003～0.006 mg/kg，在0.004，0.02，0.1 mg/kg加標水平下，回收率為75.6%～110.5%，相對標準偏差為1.2%～12.8%。該方法靈敏度高，準確度好，能夠滿足國內(nèi)外限量標準要求，可用于單個或同時分析水果中5種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量。

參考文獻：

[1]Ye M E.ApplicationofPlantGrowthRegulatorsonFruitTrees.2nd ed.Beijing：Chemical Industry Press(葉明兒.植物生長調(diào)節(jié)劑在果樹上的應(yīng)用.2版.北京：化學工業(yè)出版社)，2011.

[2]Mu Y L，Guo D H，Ding Z P.Agrochemicals(牟艷莉，郭德華，丁卓平.農(nóng)藥)，2013，52(6)：398-401.

[3]Yang X R，Liu Y X，Liu S F，Sun F Z，Sun S Q，Zhang X W，Zhang W，Gao J F.TianjinAgric.Sci.(楊秀榮，劉亦學，劉水芳，孫鳳芝，孫淑琴，張學文，張惟，高俊鳳.天津農(nóng)業(yè)科學)，2007，13(1)：23-25.

[4]Wu A J，Chen J B.PesticideScienceandAdministration(吳愛娟，陳建波.農(nóng)藥科學與管理)，2013，34(11)：38-41.

[5]The Japan Food Chemical Research Foundation.Maximum Residue Limits(MRLs) List of Agricultural Chemicals in Foods.[2015-7-20].http://www.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/search.html.

[6]GB 2763-2014.National Food Safety Standard Maximum Residue Limits for Pesticides in Food.National Standards of the People’s Republic of China(食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量.中華人民共和國國家標準).

[7]Wu P G，Tan Y，Zhang J，Wang L Y，Tang J，Jiang W，Pan X D，Ma B J，Ni Z N，Wang T J.Chin.J.Anal.Chem.(吳平谷，譚瑩，張晶，王立媛，湯鋆，姜維，潘曉東，馬冰潔，倪竹南，王天嬌.分析化學)，2014，42(6)：866-871.

[8]Lu Y M，Yi G B，Chen C B，Cai J L，Du B Y，Chen R Z.J.Instrum.Anal.(陸益民，易國斌，陳創(chuàng)彬，蔡金亮，杜彬仰，陳如珠.分析測試學報)，2011，30(2) ：186-189．

[9]Zhang H R，Zhou W，Wang B，Shi L X，Wang L T.Chin.J.Anal.Lab.(張慧榮，周圍，王波，史立學，王麗婷.分析試驗室)，2014，33(9)：1097-1100.

[10]Zhou Y M，Xin X.FoodSci.(周艷明，忻雪.食品科學)，2010，31(18)：301-304.

[11]Zhang Y L，Liu H，Wang S L，Ding T，Xu N S，Yu K Y，Shen W J，Zhao Z Y，Liu Y，Wu B，Zhang R，Shen C Y.J.Instrum.Anal.(張亞蓮，柳菡，王歲樓，丁濤，徐牛生，余可垚，沈偉健，趙增運，劉蕓，吳斌，張睿，沈崇鈺.分析測試學報)，2015，34(2)：164-170.

[12]Mu Y L，Guo D H，Ding Z P，Yi X H.Chin.J.Anal.Chem.(牟艷莉，郭德華，丁卓平，伊雄海.分析化學)，2013，41(11)：1640-1646.

[13]Mu Y L，Guo D H，Ding Z P.J.Instrum.Anal.(牟艷莉，郭德華，丁卓平.分析測試學報)，2013，32(8)：935-940.

[14]Wang J J，Lu Y，Yang T，Zhang H T，Wang J D.J.Instrum.Anal.(王靜靜，鹿毅，楊濤，張煌濤，王吉德.分析測試學報)，2011，30(2)：128-134.

[15]Wu F Q，Jin B H，Chen B，Chen P J，Xiao F.Chin.Agric.Sci.Bull.(吳鳳琪，靳保輝，陳波，陳沛金，肖鋒．中國農(nóng)學通報)，2010，26(15)：115-119．

[16]Mu Y L，Guo D H，Ding Z P.Chin.J.Chromatogr.(牟艷莉，郭德華，丁卓平.色譜)，2013，31(10)：1016-1020.

[17]Chen W J，Zhang Y H，Li Y C，Zhao Q Y，Jiao B N.FoodSci.(陳衛(wèi)軍，張耀海，李云成，趙其陽，焦必寧.食品科學)，2012，33(11)：283-289.

Determination of 5 Plant Growth Regulator Residues in Fruits by Solid Phase Extraction and Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHONG Ling-li，HU Li，GUO Ling-an*，LEI Shao-rong，MAO Jian-fei，LI Xi，OUYANG Hua-xue

(Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu610066，China)

Abstract：A method for the simultaneous determination of 5 plant growth regulator residues,including 6-benzyl adenine(6-BA)，thidiazuron，forchlorfenuron，paclobutrazol and uniconazole in fruits was developed by using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS) with solid phase extraction(SPE).Samples were extracted with acetonitrile，then the extracts were concentrated and cleaned up on a NH2 solid phase extraction cartridge with dichloromethane-methanol(92∶8) as elution solution.Sample preparation was accomplished after concentrated and redissoved.The UPLC-MS/MS method was performed with Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm) column using water-methanol as mobile phase by gradient elution，at a flow rate of 0.3 mL/min.The target compounds were determined by UPLC-MS/MS under multi reaction monitoring(MRM) mode，and then quantitatively analyzed by external standard method using the matrix-matched standard solution.The results showed that there were good linearities for 5 plant growth regulators between peak areas and concentrations in the range of 5-500 ng/mL under the optimal conditions，with correlation coefficients(r2) of 0.996 1-0.999 6.The spiked recoveries of 5 plant growth regulators in fruits at three spiked levels of 0.004，0.02，0.1 mg/kg ranged from 75.6% to 110.5% with relative standard deviations(RSDs) of 1.2%-12.8%.The limits of detection of this method(LOD) were in the range of 0.001-0.002 mg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) were 0.003-0.006 mg/kg.The established method was simple，sensitive，accurate and reliable，and could meet the requirements of multi pesticide residues analysis in fruits.

Key words：solid phase extraction(SPE);ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);fruits;plant growth regulators

收稿日期：2015-08-27;修回日期：2015-09-23

基金項目：四川省財政基因工程專項資金項目(2012QNJJ-026);四川省農(nóng)業(yè)科學院新興學科(2013XXXK-023)

*通訊作者：郭靈安，副研究員，研究方向：食品質(zhì)量與安全，Tel:028-84504149，E-mail：gla028@163.com

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.016

中圖分類號：O657.63;TQ314.254

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0466-05