超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定斑馬魚性腺中13種類固醇激素

馬有寧，桂文君，程敬麗，朱國念

(浙江大學(xué)　農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江　杭州　310058)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定斑馬魚性腺中13種類固醇激素

馬有寧，桂文君，程敬麗，朱國念*

(浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江杭州310058)

摘要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定雌性斑馬魚性腺中13種類固醇激素的分析方法。雌魚性腺分別經(jīng)預(yù)冷的乙腈、乙酸乙酯浸提后，氨基(NH2)、親水-親脂平衡介質(zhì)(HLB)固相萃取柱富集凈化，ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱進行梯度分離。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，基質(zhì)匹配外標法定量。研究了不同提取溶劑對13種類固醇激素的提取效果，考察了固相萃取柱的凈化效果，并對斑馬魚性腺進行類固醇激素加標回收率實驗，結(jié)果表明，13種分析物的平均加標回收率為74.8%～127.0%，相對標準偏差為3.9%～15.8%，方法檢出限為0.006～0.300 μg/kg。該方法簡便、準確、靈敏，可應(yīng)用于斑馬魚性腺類固醇激素生理水平的檢測。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；NH2；HLB柱；斑馬魚性腺；類固醇激素

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)是指環(huán)境中存在的能夠干擾生物體內(nèi)源激素的合成、釋放、轉(zhuǎn)運、結(jié)合、作用或清除，從而影響機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、生殖、發(fā)育及行為的外源性物質(zhì)[1-2]。性激素在魚類生殖系統(tǒng)發(fā)育中起著決定性的作用[3]。而許多環(huán)境內(nèi)分泌干擾物如雙酚A(Bisphenol A,BSA)[4]、乙烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)[5-6]、17α-炔雌醇(EE2)[7]等可以通過性激素受體介導(dǎo)或非受體介導(dǎo)途徑發(fā)揮內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，影響性激素的合成、代謝而改變生物體內(nèi)性激素的利用度。其中斑馬魚作為生物學(xué)研究的一種新型模式生物已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)的研究[8]。

在斑馬魚體內(nèi)，類固醇激素的合成主要發(fā)生在外周組織，其中具有生物活性的性腺固醇類激素包括孕激素(Progestins)、皮質(zhì)激素(Corticosteroids)、雌激素(Estrogens)和雄激素(Androgens)等[9]。放射免疫分析法(RIA)主要應(yīng)用于測定斑馬魚血漿類固醇激素(主要是T、E2、11-KT)[10-11]。由于微量濃度的性激素即會產(chǎn)生明顯的生理學(xué)作用，因此需要高靈敏度的儀器分析檢測[12]。雖然傳統(tǒng)的RIA靈敏度高，但由于存在方法重復(fù)性差、交叉反應(yīng)率高、動態(tài)范圍窄、無法同時檢測多種激素物質(zhì)等缺陷而使其應(yīng)用受限[13-15]。隨著固相萃取柱的廣泛使用，使用氣相色譜(GC-MS)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC -MS/MS)測定類固醇激素得到了革命性的應(yīng)用[16]。雖然氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以提高靈敏度，但無法避免繁瑣的衍生化操作，增加了提取過程的復(fù)雜性[17-18]。UPLC-MS/MS可避免氣相色譜法復(fù)雜的前處理步驟，且可通過MRM提高方法的選擇性和檢出限[19]。目前應(yīng)用GC-MS[20]和UPLC-MS/MS測定動物組織[21-24]、液體樣品(尿液[25-26]、血漿[12，27])中的類固醇激素已有報道，但對斑馬魚性腺中類固醇激素的檢測鮮有報道[28]。本文采用不同模式的固相萃取柱(HLB和NH2柱)分別凈化，結(jié)合UPLC-MS/MS分析斑馬魚性腺中的13種內(nèi)源類固醇激素，以期提高方法靈敏度，減少基質(zhì)效應(yīng)。該方法靈敏度高，能夠滿足斑馬魚體內(nèi)13種類固醇激素生理水平的測定要求。

1實驗部分

1.1儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀Acquity Ultra Performance LC(Waters,Milford,MA,USA)，Applied Biosystems Triple Quad 5500質(zhì)譜儀器(ESI-MS/MS;Foster,CA,USA)，F(xiàn)RESCO 21臺式離心機(美國 Thermo Fisher 公司)。

1.2試劑與材料

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純)、乙酸乙酯(分析純)購自美國Sigma-Aldrich公司；Waters OASIS HLB(200 mg×6 mL，美國Waters公司)；Bond Elut-NH2(500 mg×6 mL，美國Agilent Technologies公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

13種類固醇激素標準品：孕激素：孕酮、羥基孕烯醇酮、羥孕酮；皮質(zhì)激素：脫氧皮質(zhì)酮、脫氧皮質(zhì)醇、氫化可的松、皮質(zhì)酮；雄激素：去氫表雄酮、雄烯二酮、睪丸酮；雌激素：雌酮、雌二醇、雌三醇均購自美國Sigma-Aldrich公司，純度均大于95%。

1.3標準溶液的配制

標準儲備液：稱取10 mg(精確至0.01 mg)標準品，用甲醇定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，于-20 ℃避光保存。使用時用甲醇逐級稀釋成所需濃度的工作液。

混合標準工作液：分別吸取適量的類固醇標準儲備液，用甲醇配成1 mg/L的混合標準儲備液，于-20 ℃避光保存。

1.4樣品前處理

1.4.1樣品制備使用過量的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(300 mg/L)長時間麻醉斑馬魚至停止鰓蓋運動，收集雌魚性腺組織樣品保存于-80 ℃，待測。根據(jù)中國國家食品和藥物控制研究所實驗動物保護和應(yīng)用指南實施實驗。

1.4.2提取稱取0.3 g樣品(5尾魚)于2 mL離心管中，加入1 mL預(yù)冷(4 ℃)的乙腈。樣品勻漿后超聲提取30 min，于4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。殘渣中加入1 mL預(yù)冷(4 ℃)的乙酸乙酯，勻漿后超聲提取30 min，于4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，將兩次提取液合并，混勻，上清液于40 ℃氮吹近干，加入1 mL甲醇，混勻，獲得樣品粗提取液待凈化。

1.4.3凈化HLB固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL超純水平衡。取0.6 mL樣品粗提取液，加入2.4 mL超純水，混勻，過HLB固相萃取柱。用3 mL 30% 的甲醇水溶液洗滌萃取柱。用3 mL 純甲醇洗脫，洗脫液收集于10 mL試管中，于40 ℃氮吹近干，甲醇定容至300 μL，混勻，過0.22 μm濾膜(聚四氟乙烯，PTFE，美國Millipore公司)，待測定ESI(-)目標化合物。

NH2固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL甲醇-乙酸乙酯(20∶80)溶液平衡。取0.4 mL樣品粗提取液，加入1.6 mL乙酸乙酯，混勻，過NH2固相萃取柱，再用2 mL甲醇-乙酸乙酯(20∶80)洗脫，共4 mL均收集于10 mL試管中，于40 ℃氮吹近干，甲醇定容至300 μL，混勻，過0.22 μm濾膜，待測定ESI(+)目標化合物。

1.5UPLC-MS/MS

分析柱：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm;美國Waters公司)。流動相：A為0.1% 甲酸水溶液(ESI+)或0.1%氨水(ESI-)，B為乙腈溶液。梯度洗脫：ESI(+)，0～8 min，5%～95% B，8～9 min，95% B，9～9.1 min，95%～5% B；ESI(-)，0～7 min，10%～85% B，7～9 min，85%～95% B，9～9.1 min，95%～10% B。流速：300 μL/min，柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)如下：正離子模式，氣簾氣(CUR) 20 psi，碰撞氣(CAD) 8 psi，噴霧電壓(IS)5 500 V，離子化溫度(TEM) 550 ℃，霧化氣(GS1) 30 psi，渦輪增壓氣(GS2) 30 psi；此模式下分析的類固醇激素有8種：孕酮、脫氧皮質(zhì)酮、脫氧皮質(zhì)醇、氫化可的松、皮質(zhì)酮、去氫表雄酮、雄烯二酮、睪丸酮。

負離子模式，氣簾氣(CUR) 10 psi，碰撞氣(CAD) 8 psi，噴霧電壓(IS) -4 500 V，離子化溫度(TEM) 550 ℃，霧化氣(GS1) 40 psi，渦輪增壓氣(GS2) 40 psi。此模式下分析的類固醇激素有5種：羥基孕烯醇酮、羥孕酮、雌酮、雌二醇、雌三醇。采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(Dynamic SRM)模式掃描，其他參數(shù)見表1。

表1　13種類固醇激素的母離子、子離子、去簇電壓及碰撞能量

圖1　不同提取溶劑對13種類固醇激素回收率的影響(5 μg/kg)Fig.1　Effects of different extraction solvents on recoveries of 13 steroids(5 μg/kg)

2結(jié)果與討論

2.1提取溶劑的優(yōu)化

為了獲得較好的回收率和除雜效果，實驗考察了甲醇[29]、乙腈[30]、乙酸乙酯[31]、乙腈-乙酸乙酯[32]5種溶劑的提取效果，選用雌魚性腺，預(yù)先添加13種混合標準溶液，使其含量為5 μg/kg，各組提取液均采用基質(zhì)匹配校準法測定。結(jié)果表明(圖1)，甲醇作為提取溶劑時，除F外，類固醇激素的回收率均不足70%，且提取液中雜質(zhì)較多，背景噪音大；而分別單獨使用乙腈、乙酸乙酯時，孕激素、皮質(zhì)激素及雄激素的提取回收率可滿足要求，但對雌激素的提取回收率較小，分別小于40%和65%，其中乙腈提取物更為純凈，背景噪聲小。而結(jié)合兩種提取溶劑分次提取，可明顯增加雌激素的回收率，回收率均達到74%以上。因此選擇乙腈結(jié)合乙酸乙酯作為提取溶劑進行分次提取。

2.2凈化方法的優(yōu)化

本研究對固相萃取柱HLB的上樣溶劑組成和洗脫條件進行優(yōu)化。固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL 水活化，將混合標準溶液溶于初始上樣液10%甲醇-水溶液中，則上樣液中類固醇的質(zhì)量濃度為5 μg/L，并依次用20%，40%，60%，80%，100%甲醇-水溶液淋洗，設(shè)定淋洗體積為3 mL，收集淋洗液。結(jié)果表明，當(dāng)淋洗液中甲醇含量超過40%時，可檢出10.1%的E和16.8%的F，而當(dāng)甲醇含量達80%時，所有目標化合物的回收率均在95%以上。為此，方法選擇3 mL 20%甲醇水溶液作為上柱前的溶劑，3 mL 30%甲醇水溶液作為淋洗液，3 mL 100%甲醇作為洗脫溶劑。

本研究采用NH2[21]、HLB固相萃取柱凈化，以基質(zhì)效應(yīng)評價方法的純化效果。選用雌魚性腺，按照“1.4.2”方法處理得到樣品粗提液，將粗提液分成兩份，其中一份經(jīng)HLB柱凈化，另一份經(jīng)NH2柱凈化得到樣品純化液。為了考察基質(zhì)效應(yīng)，相同量的激素(5 μg/kg) 分別配在性腺組織純化液和甲醇中，扣除提取液中本底后，比較兩者峰面積，觀察是否有離子增強或抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示，樣品粗提液經(jīng)HLB凈化后，雄激素、P4、皮質(zhì)激素均表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)增強效應(yīng)，回收率高達412%(F)；而樣品粗提液經(jīng)NH2柱凈化后，雌激素、17P4和17P5表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，為了獲取更好的純化效果并降低目標化合物的基質(zhì)效應(yīng)，本文將樣品粗提液分成2份，分別采用HLB固相萃取柱凈化雄激素、P4和皮質(zhì)激素，而NH2固相萃取柱用于凈化雌激素、17P4和17P5。

2.3UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

在UPLC-MS/MS分析中，流動相主要對分析物的離子化效率產(chǎn)生影響，從而引起靈敏度的變化。實驗結(jié)果表明，正離子模式下，以0.1%甲酸水溶液為流動相可以獲得較高的靈敏度，而負離子模式下，以0.1%氨水為流動相可以獲得最佳的靈敏度和色譜分離度。圖2為13種分析物在最佳色譜條件下的提取離子流圖(TIC)。

2.4線性關(guān)系、檢出限、回收率與精密度

采用基質(zhì)匹配外標法定量。將13種類固醇激素混合標準工作液用空白組織液依次稀釋成0.1～50 μg/L的系列濃度，在最佳實驗條件下進行測定，用色譜峰面積和濃度繪制標準曲線。結(jié)果表明，13種分析物在此濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)不低于0.998 3。以各目標物色譜峰的3倍信噪比(S/N=3)計算得13種目標化合物的檢出限(LOD)為0.006～0.300 μg/kg(表2)。

表2　13種內(nèi)源類固醇激素的線性關(guān)系、檢出限、平均回收率及相對標準偏差(n=3)

(續(xù)表2)

AnalyteLinearrange(μg/L)Linearequation*rLOD(μg/kg)Added(μg/kg)Meanrecovery(%)RSD(%)S0.1～50Y=13261X-1780.80.99980.0240.25,1.25,6.25104.0,115.2,127.013.2,5.2,11.9F0.1～50Y=5149X-165.50.99860.0350.25,1.25,6.2574.8,88.7,86.910.3,11.9,6.6E0.1～50Y=8508X+80.60.99960.0180.25,1.25,6.2580.3,91.2,89.610.2,6.8,7.8DHEA1.0～50Y=12320X-1617.41.00000.3002.5,6.25,15.62586.3,90.1,92.45.5,3.9,7.2AE0.1～50Y=44886X-1123.90.99940.0200.25,1.25,6.2583.8,89.8,100.610.7,6.1,4.9T0.1～50Y=55266X-6538.60.99830.0120.25,1.25,6.2598.2,95.4,106.010.4,8.4,3.9E10.1～50Y=53006X-7121.40.99990.0060.2,1.0,5.083.0,79.4,76.612.2,11.1,8.9E20.1～50Y=30708X+631.40.99990.0080.2,1.0,5.083.6,88.9,89.411.4,12.2,9.1E30.1～50Y=6924X+157.70.99980.0500.2,1.0,5.088.9,91.3,86.110.3,11.4,7.3

*Y：peak area;X:mass concentration(μg/L)

圖3　斑馬魚性腺中類固醇激素的含量Fig.3　Contents of steroid hormones in ovaries of zebrafish

對斑馬魚性腺進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD，n=3)。結(jié)果表明，13種化合物的平均加標回收率為74.8%～127.0%，RSD為3.9%～15.8%。

2.5實際樣品的檢測

選用野生型斑馬魚，對雌性斑馬魚進行三唑錫農(nóng)藥(Azocyclotin,AZO,0.45 μg/L)暴露21 d，按優(yōu)化的分析條件測定性腺類固醇激素的變化。結(jié)果表明，除E3、S和DOC外，其余10種類固醇激素均有檢出(見圖3)。由圖3可以看出，雌性斑馬魚暴露于三唑錫21 d后，性腺中雄性激素明顯增加(65.3%～199%)，而雌性激素、孕激素、皮質(zhì)激素明顯降低(16.9%～78.8%)。

3結(jié)論

本文建立了斑馬魚雌魚性腺中13種內(nèi)源類固醇激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，分別對儀器條件、樣品提取溶劑進行了優(yōu)化，采用不同的固相萃取柱分別凈化以提高分析方法的靈敏度和準確性。本方法準確、可靠，具有較高的實用性，可為環(huán)境污染物對斑馬魚類固醇激素干擾研究提供有力的技術(shù)支撐。

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Analysis of Steroid Hormones in Ovaries of Zebrafish(Danio rerio) by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA You-ning,GUI Wen-jun,CHENG Jing-li,ZHU Guo-nian*

(Institute of Pesticide and Environmental Toxicology,Zhejiang University,Hangzhou310058,China)

Abstract：An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of steroid hormones in ovaries of zebrafish.Homogenized ovary samples were purified with NH2 and HLB solid phase extraction column after extracted with acetonitrile and ethyl acetate at 4 ℃.The samples were transported and eluted on an analytical column ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm).All the analytes were detected in selected reaction monitoring(SRM) mode and quantified by the external matrix-matched standard method.The extraction efficiencies of different extraction solvents and cleanup effects of solid phase extraction columns for each analyte were further investigated.The average recoveries of 13 steroid hormones in spiked zebrafish ovary samples ranged from 74.8% to 127.0% with relative standard deviations(RSD) of 3.9%-15.8%.The results showed that the limits of detection(LODs,S/N=3) were in the range of 0.006-0.300 μg/kg.The method was sensitive and reliable,and could meet the requirements for the quantification of steroid hormones in zebrafish at physiological level.Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);NH2;HLB;zebrafish;steroid hormones

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2016-02-16

基金項目：浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究項目(2014C37050)

*通訊作者：朱國念，教授，研究方向:農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)與農(nóng)藥污染治理，Tel：0571-86971220，E-mail:zhugn@zju.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.015

中圖分類號：O657.63；Q548.2

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0460-06