同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定面粉及面制品中的聯(lián)二脲

阮莎莎，劉桂華，劉素純*，朱　舟，劉建軍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學　食品科學技術學院，湖南　長沙　410128；2.深圳市疾病預防控制中心，廣東　深圳　518055)

同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定面粉及面制品中的聯(lián)二脲

阮莎莎1，劉桂華2*，劉素純1*，朱舟2，劉建軍2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳518055)

摘要：建立了面粉及其制品中聯(lián)二脲的同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。采用純水超聲提取，含油脂的樣品加正己烷脫脂，所得樣液進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以乙腈與純水為流動相，梯度洗脫，經(jīng)Waters XBridge BEH Amide(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱分離，MS/MS采用電噴霧電離正離子(ESI+)，多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測，同位素內(nèi)標法定量。方法的線性范圍為0.2～100 μg/L，相關系數(shù)為0.999 9；在面粉、饅頭、面包、油條和面條5種基質(zhì)中的平均加標回收率為82.0%～113.6%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～9.3%；方法定量下限(LOQ)為20 μg/kg。應用該方法對136份市售的面粉及面制品進行檢測，在42份樣品中檢出聯(lián)二脲，檢出率為30.88%。其中面粉檢出4份，含量為43.7～564 μg/kg；饅頭未檢出；面條檢出2份，分別為70.8 μg/kg與9 840 μg/kg；油條檢出1份，含量為2 480 μg/kg；面包表層檢出15份，含量為27.4～8 730 μg/kg；面包內(nèi)芯檢出20份，含量為64.3～18 100 μg/kg。該方法操作簡單、靈敏快速、準確可靠，適用于面粉及其制品中聯(lián)二脲的測定。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；同位素內(nèi)標；面粉；面制品；聯(lián)二脲

偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide，ADC)具有氧化與漂白的雙重功能[1-2]，添加到面制品中能增強筋度，改善彈性、韌性及均勻性[3-4]。在面制品禁止使用溴酸鉀[5]后，ADC成為最廣泛使用的面粉改良劑之一。近年來研究表明，在面制品加工過程中，ADC可經(jīng)小麥蛋白還原成聯(lián)二脲(Biurea，HDC)，HDC經(jīng)高溫作用進一步降解為氨基脲(Semicarbazide,SEM)[6-7]。SEM已被證明具有致癌性與致突變作用[8-10]。在高溫特別是濕度較大的情況下，ADC也可直接轉(zhuǎn)化為HDC[11]。歐盟已禁止使用ADC作為面粉添加劑[12]，我國GB2760-2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》規(guī)定小麥粉中ADC的最大使用量為0.045 g/kg[13]。考慮到其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物SEM的毒性效應，有必要監(jiān)測食品中HDC的存在水平，這對使用ADC的食品的安全性評價有著重要意義。

目前，食品中HDC的定量分析方法主要為高效液相色譜法(HPLC)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。Bechtold等[14]最早利用HPLC檢測HDC。HDC的HPLC-MS/MS定量分析可直接測定或衍生后測定。如Mulder等[15]直接測定了含有面制品涂層的禽肉與海產(chǎn)品中HDC的含量；袁紅麗等[16]采用純水提取后固相萃取凈化測定了饅頭中的HDC含量，但該方法只針對饅頭中的HDC進行研究，并未涉及其他面制品；王雅等[17]使用高錳酸鉀將HDC氧化成ADC，利用對苯亞磺酸鈉將ADC衍生為對苯磺酰氨基脲，再進行HPLC-MS/MS檢測，該方法的定量下限可達5 μg/kg，此方法雖然靈敏度較高，但需要衍生化，操作較為繁瑣。

本研究對面粉及面制品中的HDC進行直接測定，采取純水直接提取，離心后取上清液，含油脂樣品加入正己烷脫脂，同位素內(nèi)標法定量，以期得到簡單高效、靈敏度高的HDC檢測方法，為檢測面粉及面制品中的HDC提供技術支持。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

AB SCIEX 4500 QTRAP三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，配有Turbo-V離子源、蠕動泵以及Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，氣源為純度大于99.999%的高純氮氣；Shimadzu LC-20A 超快速液相色譜儀(日本島津公司)；Waters XBridge BEH Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm×3.5 μm，美國Waters公司)；分析天平(XS205，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q plus超純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Beckman Coulter AllegraTMX-22R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；KQ-250DV 超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；IKA A-11 basic研磨機、IKA-MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；0.45 μm有機系微孔濾膜。

HDC標準品(純度大于99%，美國Sigma-Aldrich公司)，13C2,15N2-HDC標準品(純度98.8%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)。實驗所用甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純，購自德國Merck公司。實驗用水(電阻率>18 MΩ·cm)均由Milli-Q plus超純水制備系統(tǒng)臨用現(xiàn)制。實驗用面粉及面制品購自深圳市各大超市。

1.2標準溶液的配制

稱取HDC標準品10 mg(精確至0.01 mg)，加水超聲輔助溶解，配成200 mg/L的標準儲備溶液,4 ℃避光保存，有效期180 d；根據(jù)實際需要用甲醇稀釋標準儲備液，獲得相應質(zhì)量濃度的標準工作液。稱取13C2,15N2-HDC標準品10 mg(精確至0.01 mg)，用超純水配成200 mg/L的溶液，置于4 ℃冰箱避光保存，有效期180 d；根據(jù)需要用甲醇稀釋成相應質(zhì)量濃度的內(nèi)標標準工作液。

1.3色譜-質(zhì)譜分析條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters XBridge BEH Amide 色譜柱(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱溫35 ℃；流動相為超純水(A)和乙腈(B)，流速為0.6 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min,75% B，0.5～2 min,75%～55% B，2～5 min,55% B，5～8 min,75%B；進樣量20 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式；掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)；離子噴霧電壓(IS)為5 500 V；離子源溫度(TEM)為650 ℃；氣簾氣(CUR)壓力35 psi；霧化氣(GS1)壓力45 psi；輔助加熱氣(GS2)壓力65 psi；碰撞氣(CAD)中等；去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)等參數(shù)見表1。

表1　HDC與13C2,15N2-HDC的MRM參數(shù)

*quantitative ion

1.4樣品前處理

面粉樣品直接稱取，面制品粉碎均勻取樣。準確稱取樣品2.00 g(精確至0.01 g)，分別加入0.1 mL13C2,15N2-HDC同位素內(nèi)標(10 mg/L)和10 mL超純水，超聲提取15 min，轉(zhuǎn)出上清液；殘渣再用10 mL超純水提取1次，合并上清液；于8 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL，用初始流動相稀釋至1 mL，0.45 μm有機系微孔濾膜過濾后采用LC-MS/MS測定；對于油條等油脂含量較高的樣品，提取液用初始流動相稀釋后加入2 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻30 s，于8 000 r/min離心5 min，取下清液過膜后測定。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將10 mg/L的HDC與13C2,15N2-HDC標準溶液以針泵注射器恒流進樣，分別在正、負離子模式下進行全掃描，選擇最佳的電離方式及監(jiān)測離子。結(jié)果表明，在正離子模式下,[M+H]+為響應度最強的離子，[M+Na]+次之。確定母離子后進行二級質(zhì)譜掃描，選取豐度較強的碎片離子作為定量離子和輔助定性離子，并進一步優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。掃描質(zhì)譜圖及碎片裂解途徑解析見圖1。

2.2流動相的優(yōu)化

本實驗選擇乙腈與純水為流動相。在HPLC-MS/MS中，適量添加易揮發(fā)性酸可調(diào)節(jié)流動相pH值，優(yōu)化峰形，并在質(zhì)譜檢測中提高待測物質(zhì)的電離效率，從而提高檢測靈敏度?？疾炝肆鲃酉嘀刑砑硬煌w積分數(shù)的甲酸和乙酸(0.1%，0.2%，0.5%，1.0%)對HDC電離效果與檢測靈敏度的影響。實驗顯示未添加酸時靈敏度最高，該結(jié)果與文獻[16]的研究結(jié)果一致。因此最終選用乙腈與純水為流動相。

圖2　不同洗脫方式對HDC色譜峰的影響Fig.2　Effect of different elution patterns on MRM chromatograms of biurea

對流動相的洗脫方式進行了優(yōu)化。因氨基柱的鍵合官能團易水解，其有機相含量常保持在50%～95%。在此范圍內(nèi)改變有機相的變化速率，以獲得最佳色譜峰形與檢測靈敏度。最終優(yōu)化的梯度程序如“1.3”所示。在其他分析條件相同的情況下，與袁麗紅等[16]選用乙腈-水(70∶30)的等度洗脫相比，該梯度洗脫程序下HDC的出峰時間更早，信噪比為等度洗脫的3倍。圖2為上述2種洗脫方式下100 μg/L HDC的色譜峰比較圖。

2.3樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取劑的優(yōu)化食品中親水性污染物的常用提取溶劑主要有甲醇、乙腈或水溶液[18-19]，HDC的提取劑有純水[16-17]與二甲基甲酰胺[15]?？疾炝思兯?、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液、10%二甲基甲酰胺水溶液作為提取劑的提取效率。分別稱取不含HDC的空白基質(zhì)(面粉、饅頭、面包、油條、面條) 2.00 g，添加100 μg/kg的HDC標準品，比較不同提取劑的提取效率，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，純水作為提取劑時，提取效率最高。

由于提取劑在溶解提取待測物的同時會引入樣品基體中的其他雜質(zhì)，這些雜質(zhì)對目標物質(zhì)響應值的影響稱為基質(zhì)效應。不同的提取劑引入的雜質(zhì)不同，產(chǎn)生的基質(zhì)效應也不同。本實驗對空白基質(zhì)進行預處理，采用處理后的基質(zhì)液配制基質(zhì)匹配標準曲線。利用基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑稀釋標準曲線中對應點絕對響應值的比值來衡量基質(zhì)效應。比值小于1，說明基質(zhì)對待測物的響應值有抑制作用；比值大于1，則說明基質(zhì)對待測物的響應值有增強作用；比值越接近1，基質(zhì)對待測物響應值的影響越小。結(jié)果顯示，以純水作為提取劑時，基質(zhì)效應在0.95～1.13，10%二甲基甲酰胺水溶液作為提取劑時，基質(zhì)效應在0.51～0.63，50%乙腈水溶液與50%甲醇水溶液的基質(zhì)效應分別為0.79～0.88與0.74～0.80。因此，10%二甲基甲酰胺水溶液作為提取劑時，對HDC質(zhì)譜響應值有較強的抑制作用。此結(jié)果可合理解釋HDC更易溶于二甲基甲酰胺,因此10%二甲基甲酰胺水溶液的提取效率更低。綜合考慮提取效率與基質(zhì)效應，最終選用純水作為提取劑。

表2不同提取劑對HDC提取效率的比較

Table 2Comparison between extraction efficiencies of different solvents for biurea

(μg/kg)

ExtractionsolventFlourSteamedbunNoodleBreadDeep-frieddoughsticksWater74.579.278.281.773.710%Dimethylformamide55.743.254.149.347.350%Acetonitrile54.362.154.943.851.550%Methanol43.152.237.051.743.2

2.3.2提取方法的優(yōu)化利用加標面粉分別研究了不同提取方式、提取時間和提取次數(shù)對提取效率的影響。在不同提取方式中，超聲提取的加標回收率為76.5%，遠大于旋渦振蕩提取的回收率(32.4%)，因此本實驗選擇超聲提取。比較了超聲時間分別為10，20，30 min時對提取效率的影響，獲得其加標回收率分別為65.2%，76.5%和79.1%，因此，實驗選擇最佳超聲時間為30 min。在提取次數(shù)的基礎上，同體積的提取劑分2次提取的回收率為87.9%，單次提取的回收率為67.3%。對于其他基質(zhì)也獲得了一致的結(jié)果。綜合考慮提取時間與提取次數(shù)，最終選定的提取方式為超聲提取，提取2次，每次15 min。

2.4同位素內(nèi)標的應用

由于面制品種類繁多，性質(zhì)差異大，采取基質(zhì)匹配方法配制標準曲線，工作復雜繁瑣。而檢測物的同位素內(nèi)標與檢測物的色譜行為與質(zhì)譜行為均一致。在樣品進行前處理時即將同位素內(nèi)標加入，不僅可以消除基質(zhì)效應，也可校正操作帶來的損失與誤差。本實驗選用穩(wěn)定同位素內(nèi)標物13C2,15N2-HDC，比較了加標樣品分別采用內(nèi)標法與外標法定量計算的回收率。結(jié)果顯示，內(nèi)標法定量的回收率為82.0%～113.6%，外標法定量的回收率為62.4%～74.3%。因此本實驗最終采用內(nèi)標法進行定量。

2.5方法性能

2.5.1線性范圍與檢出限取適量的標準儲備液用初始流動相稀釋成質(zhì)量濃度為 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100 μg/L 的系列濃度標準工作液進行HPLC-MS/MS分析。以HDC與內(nèi)標的濃度比為橫坐標，HDC與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，進行線性回歸分析。結(jié)果表明，HDC在0.2～100 μg/L范圍具有良好的線性，相關系數(shù)(r)為0.999 9。

分別稱取不含HDC的空白基質(zhì)(面粉、饅頭、面包、油條、面條)，添加HDC標準品，按照優(yōu)化后的最終方法進行檢測，以3倍信噪比(S/N)對應的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，10倍信噪比對應的質(zhì)量濃度作為定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，HDC的LOD為5 μg/kg，LOQ為20 μg/kg。

2.5.2回收率與精密度選取經(jīng)測定不含HDC的面粉、饅頭、面包、油條、方便面5種空白基質(zhì)，分別按照50，500，2 000 μg/kg 3個濃度水平進行加標回收實驗，每個加標水平做6個平行樣品，計算平均回收率與相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。HDC的平均回收率為82.0%～113.6%，RSD為2.1%～9.3%。

表3　加標面粉及面制品的回收率與精密度測定結(jié)果(n=6)

2.6實際樣品的測定

應用本方法對市售的面粉(31份)、饅頭(12份)、面條(19份)、油條(10份)、面包(32份)進行檢測。其中面包取樣時分為表層與內(nèi)芯，共獲得實際檢測樣品136份。42份樣品中檢出HDC，檢出率為30.88%。其中部分面制品樣品的檢出水平超出線性范圍，據(jù)第一次檢測值提高稀釋倍數(shù)，再次進行測定。4份面粉樣品中檢出HDC，含量水平為43.7～564 μg/kg；饅頭中未檢出HDC，2份面條檢出HDC，含量分別為70.8 μg/kg與9 840 μg/kg；1份油條檢出HDC，含量為2 480 μg/kg；15份面包表層檢出HDC，含量水平為27.4～8 730 μg/kg，20份面包內(nèi)芯檢出HDC，含量水平為64.3～18 100 μg/kg。不同基質(zhì)實際樣品的提取離子流色譜圖見圖3。面包樣品中，同一樣品內(nèi)芯的HDC水平均高于表層，部分樣品內(nèi)芯中檢出HDC，但表層中未檢出。推測其原因為面包焙烤時，表層溫度更高，部分HDC受熱降解所致。

3結(jié)論

本文建立了面粉及其制品中HDC的同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品基質(zhì)中的HDC采用純水超聲提取，提取液稀釋后測定。方法無需衍生化，操作簡便快速，靈敏度高，檢測范圍廣，能夠滿足日常分析的要求，為面粉及面制品監(jiān)控提供了有力的技術支持。

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Determination of Biurea in Flour and Flour Products by Isotope Dilution High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

RUAN Sha-sha1,LIU Gui-hua2*,LIU Su-chun1*,ZHU Zhou2,LIU Jian-jun2

(1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha410128,China；2.Shenzhen Center for Disease Control and Prevention,Shenzhen518055,China)

Abstract：An isotope dilution high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was established for the determination of biurea in flour and flour products.The biurea in certain matrices was extracted with ultrapure water,defatted with n-hexane when necessary,and then analyzed by HPLC-MS/MS.LC separation was performed on a Waters XBridge BEH Amide column(3.5 μm，4.6 mm×150 mm) using ultrapure water and acetonitrile as mobile phase by gradient elution.Identification was achieved by electrospray ionization(ESI+) in positive mode using multiple reaction monitoring.Quantification was performed by isotope labeled13C2,15N2-biurea internal standard calibration.The calibration curve of biurea showed a good linearity in the range of 0.2-100 μg/L with a correlation coefficient of 0.999 9.The average recoveries of biurea in flour,steamed bun,bread,deep-fried dough stick and noodle matrices(six aliquots for each level) at three spiked levels ranged from 82.0% to 113.6%,with RSDs of 2.1%-9.3%.The LOQ of the methed was 20 μg/kg.The optimized method was successfully applied in the analysis of 136 real samples collected from local markets in Southern China，while biurea residues were found in 42(30.88%) samples,of which 43.7-564 μg/kg of biurea existed in 4 flours,70.8-9 840 μg/kg in 2 noodles,2 480 μg/kg in 1 deep-fried dough stick,27.4-8 730 μg/kg in 15 breads-crust and 64.3-18 100 μg/kg in 20 breads-interior.This method is applicable for the determination of biurea in flour and different flour products due to its operation convenience,high sensitivity and good accuracy.

Key words：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);isotope labeled internal standard;flour;flour products;biurea

收稿日期：2015-09-23；修回日期：2015-10-15

基金項目：2014年深圳市科技研發(fā)資金基礎研究項目(JCYJ20140410164217367)

*通訊作者：劉素純，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學，Tel:0731-84617007,E-mail:liusuchun@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.008

中圖分類號：O657.63;TQ225.261

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0420-06

劉桂華，碩士，主任技師，研究方向：食品安全與殘留物檢驗，Tel:0755-25601549,E-mail:gliu_686@hotmail.com