Vam3對小鼠體外胸腺細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)

劉 冰張俊伶李德冠潘 金王月英姚春所侯 琦孟愛民

1（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所 北京100021）2（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津300192）3（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 北京100050）

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Vam3對小鼠體外胸腺細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)

劉 冰1張俊伶2李德冠2潘 金1王月英2姚春所3侯 琦3孟愛民1

1（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所 北京100021）2（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津300192）
3（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 北京100050）

摘要探討白藜蘆醇二聚體(Amurensis H, Vam3)對輻射致小鼠胸腺細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。體外無菌分離小鼠胸腺細(xì)胞，實驗分為6組：對照組(Control)、白藜蘆醇組(Resveratrol, Res)、Vam3組、照射組(Irradiation, IR)、照射+ Res組和照射+Vam3組。照射+Res組和照射+Vam3組于照射前30 min給予Vam3和Res孵育，對照組、Res組、Vam3組以及照射組加等量RPMI-1640培養(yǎng)基或?qū)?yīng)藥物處理，除對照組、Res組和Vam3組外，其余3組均給予4 Gy137Cs γ-射線單次照射。照射后分別用生物發(fā)光法檢測小鼠胸腺細(xì)胞活力，活性氧探針(DCFH-DA)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平，熒光抗體標(biāo)記檢測γ-H2AX表達(dá)水平以及FITC-Annexin V和PI雙染標(biāo)記法檢測細(xì)胞早期凋亡率。結(jié)果顯示，與對照組比較，照射組細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞內(nèi)ROS和γ-H2AX水平明顯升高，同時細(xì)胞早期凋亡數(shù)目增加；而照射+Vam3組與照射+Res組比較顯示，Vam3在提升細(xì)胞活力，降低細(xì)胞內(nèi)ROS和γ-H2AX水平以及抑制細(xì)胞凋亡方面的作用比Res更加明顯。研究結(jié)果表明，Vam3對輻射引起的小鼠胸腺細(xì)胞急性損傷有一定保護(hù)作用，且保護(hù)作用優(yōu)于白藜蘆醇。關(guān)鍵詞 白藜蘆醇二聚體，白藜蘆醇，胸腺細(xì)胞，輻射損傷，輻射防護(hù)劑

基金資助：國家自然科學(xué)基金面上項目(81372928、81573094)和國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81402633)資助

第一作者：劉冰，男，1988年2月出生，2013年畢業(yè)于河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，現(xiàn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所放射醫(yī)學(xué)專業(yè)碩士研究生，E-mail: xieheliubing@163.com

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81372928, 81573094, and 81402633)

First author: LIU Bing (male) was born in February 1988 and graduated from Henan University of Science and Technology. Now he is a master candidate in the Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences, majoring in radiation

medicine, E-mail: xieheliubing@163.com

Received 20 October 2015; accepted 6 November 2015

CLC TL71, R551

電離輻射引起的免疫系統(tǒng)損傷是輻射損傷的主要表現(xiàn)之一，在受到照射后免疫細(xì)胞易發(fā)生凋亡、壞死，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，引起繼發(fā)感染等并發(fā)癥[1]。胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官，淋巴細(xì)胞在此發(fā)育、分化和成熟，對輻射十分敏感，因此，胸腺細(xì)胞的輻射反應(yīng)是輻射免疫學(xué)研究的重點[2]。白藜蘆醇二聚體(Amurensis H, Vam3)是從山葡萄根中獲得的天然二苯乙烯低聚體類化合物，在植物體內(nèi)含量較低，現(xiàn)在可以用白藜蘆醇(Resveratrol, Res)為原料化學(xué)合成，為Res的二聚體類同系物。前期的研究結(jié)果證實，Res對輻射引起的造血免疫系統(tǒng)具有較好的防護(hù)作用，能顯著改善輻射引起的造血免疫系統(tǒng)損傷[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，Vam3可以通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)而抑制煙霧凝集物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞自噬，且效果優(yōu)于白藜蘆醇[4]。而有關(guān)Vam3對造血免疫系統(tǒng)的輻射損傷防護(hù)作用的報道較少。本研究根據(jù)Vam3能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平這一特點，以Res為陽性對照藥物，觀察Vam3 對C57BL/6小鼠胸腺細(xì)胞的輻射損傷保護(hù)作用，為該天然化合物開發(fā)成為一種新型輻射防護(hù)藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特殊病原體(Specific pathogen free, SPF)級C57BL/6雄性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號[SCXK（京）2012-0001]，體質(zhì)量18～22 g。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

Vam3和白藜蘆醇（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所惠贈）；無支原體胎牛血清（美國Gibco公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；二甲基亞砜(DMSO)（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；活性氧ROS探針（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞活力檢測試劑（美國Promega公司）；γ-H2AX抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；兔抗小鼠IgG抗體（上海拜沃生物科技有限公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國eBioscience公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司，型號Infinite M200）；流式細(xì)胞儀（美國BD Bioscience公司，型號C6）；137Cs γ-射線照射源（加拿大原子能有限公司，型號USD Autoce1140）。

1.3 小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分離

將用乙醚麻醉后的C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死，并置于75%乙醇浸泡消毒20 min。在超凈臺無菌剪開小鼠胸腔，取出胸腺，加入無菌PBS緩沖液研磨，用無菌200目篩網(wǎng)過濾至離心管，制備單細(xì)胞懸液。之后離心（條件1500 r/min，5 min）棄上清液，將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基里。用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL?1使用。

1.4 Vam3毒性檢測

用二甲基亞砜(DMSO)溶解Vam3和Res粉末，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Vam3 和Res溶液，調(diào)整藥物濃度為2×10?2、2×10?3、2×10?4、2×10?5、2×10?6、2×10?7mol/L。取調(diào)整好的濃度為2×106mL?1的胸腺細(xì)胞，以每孔100 μL接種至96孔板，對照組每孔加等量RPMI-1640培養(yǎng)基代替，其他組每孔加入100 μL相對應(yīng)的不同濃度的Vam3和Res藥物孵育，培養(yǎng)12 h后每孔加入20 μL生物發(fā)光試劑Celltiter-GloTM，反應(yīng)20 min，用多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力（生物發(fā)光值）。

1.5 實驗分組與照射

將胸腺細(xì)胞懸液分為6組：對照組(Control)、Res組、Vam3組、照射組(IR)、照射+Res組和照射+Vam3組。對照組和照射組：取500 μL胸腺細(xì)胞懸液，加入等量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，小心吹打混勻。Res組和Vam3組：取500μL胸腺細(xì)胞懸液，加入等量濃度為2×10?6mol/L的Res 或Vam3藥物，小心吹打混勻。照射+Res組和照射+Vam3組：取500μL胸腺細(xì)胞懸液，加入等量藥物濃度為2×10?6mol/L的Res或Vam3，并吹打混勻。將各組細(xì)胞放入37℃ 5% CO2孵箱中孵育30 min后，照射組、照射+Res組及照射+Vam3組給予一次性4 Gy137Cs γ-射線輻射，劑量率為1 Gy/min，而其余3組給予假照射。

1.6 細(xì)胞活力測定

照射完畢后接種于96孔板，每孔200μL，培養(yǎng)12 h后每孔加入20 μL生物發(fā)光試劑Celltiter-Glo TM，室溫避光震蕩20 min，多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測

照射之后將細(xì)胞接種至24孔板，放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱孵育6 h后，將各組細(xì)胞收集入2 mL EP管內(nèi)。將細(xì)胞離心后棄上清，取細(xì)胞沉淀，按無血清RPMI-1640與DCFH比例為3000:1的比例稀釋活性氧檢測探針，之后每管內(nèi)加入500 μL活性氧檢測探針，于37℃水浴鍋內(nèi)孵育20 min，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次以洗去未結(jié)合的活性氧探針，然后用300μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度(DCF MFI)。

1.8 細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX水平檢測

照射完畢后收集細(xì)胞，接種于24孔板，在37℃5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)3 h，之后將各組細(xì)胞取出加入2 mL EP管內(nèi)，離心（條件同上）后棄上清，每管加固定破膜液100μL室溫孵育30min，用1×wash buffer液洗滌兩遍后離心（條件同上）棄上清，然后加入抗γ-H2AX抗體，每管加0.5 μL，室溫孵育1 h，離心棄上清后加入FITC熒光素標(biāo)記兔抗小鼠IgG二抗，室溫避光孵育30 min。PBS緩沖液洗滌細(xì)胞二次以洗掉多余抗體，加300μL PBS重懸，用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度。

1.9 細(xì)胞凋亡測定

照射之后將細(xì)胞接種于24孔板，放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后將各組細(xì)胞收集入2 mL EP管內(nèi)，離心（條件同上）后棄上清，然后用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。則早期和晚期凋亡細(xì)胞分別被Annexin V（Annexin V+單陽）及Annexin V和PI（Annexin V+/ PI+雙陽）標(biāo)記，壞死的細(xì)胞僅被PI 標(biāo)記（PI+單陽），正?；罴?xì)胞未被標(biāo)記（Annexin V?/PI?雙陰），然后用流式細(xì)胞儀分析胸腺細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞百分率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗結(jié)果均以x± s表示，組間比較用獨立樣本t檢驗。用GraphPad Prism 5軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 Vam3對小鼠胸腺細(xì)胞的毒性作用不同濃度梯度Vam3處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，1×10?5、1×10?6、1×10?7mol/L藥物濃度未表現(xiàn)出毒性作用，似乎對細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，與對照組相比，細(xì)胞活力依次提升15% (p<0.01)、23% (p<0.001)和14% (p<0.01)，在該濃度范圍里1×10?6mol/L濃度對細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)。而之后隨著藥物濃度增加1×10?3和1×10?4mol/L濃度的Vam3處理細(xì)胞后，與對照組相比，細(xì)胞活力分別下降14%和68%，表現(xiàn)出一定的毒性作用，在1×10?2mol/L濃度時Vam3對細(xì)胞有明顯毒性作用，胸腺細(xì)胞幾乎全部死亡。同時，Vam3 與Res比較發(fā)現(xiàn)，同一濃度條件下Vam3的藥物毒性要顯著低于Res，見圖1。

2.2 Vam3對小鼠胸腺細(xì)胞受照后活力的影響

毒性實驗結(jié)果顯示，1×10?6mol/L濃度的藥物對胸腺細(xì)胞保護(hù)作用最明顯，以下實驗Res和Vam3濃度均選擇1×10?6mol/L。照射前30 min對胸腺細(xì)胞進(jìn)行Res和Vam3藥物處理，照射后12 h收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力。對照組比較發(fā)現(xiàn)，照射組胸腺細(xì)胞活力下降為對照組的10%(p<0.001)；照射+Vam3組細(xì)胞活力提高52%(p<0.01)；且照射+Vam3組與照射+Res組比較，細(xì)胞活力顯著升高(p<0.05)，說明Vam3對小鼠胸腺細(xì)胞有輻射損傷保護(hù)作用，且防護(hù)效果優(yōu)于白藜蘆醇，見圖2。

2.3 Vam3對小鼠胸腺細(xì)胞受照后ROS水平影響

為了評價Vam3對輻射后胸腺細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，照射前對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，照射后6h收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果與對照組比較，照射組胸腺細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高97% (p<0.001)；與照射組相比，照射+Vam3組細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降28% (p<0.001)；且照射+Vam3組與照射+Res組比較，細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降更加明顯(p<0.001)，見圖3。

2.4 Vam3對小鼠胸腺細(xì)胞γ-H2AX水平的影響

于照射前對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，照射后3 h流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX水平，結(jié)果與對照組比較，照射組胸腺細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX水平顯著升高(p<0.001)；與照射組相比，照射+Vam3組細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX水平下降70% (p<0.001)；且照射+Vam3組與照射+Res組比較，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX水平顯著下降(p<0.001)，見圖4。

2.5 Vam3對小鼠胸腺細(xì)胞受照后凋亡水平影響

為了評價Vam3對輻射后胸腺細(xì)胞凋亡的影響，實驗于照射前對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，照射后4 h流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞比例。結(jié)果與對照組比較，照射組胸腺細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例顯著升高(p<0.001)；與照射組相比，照射+Vam3組細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例下降53% (p<0.001)；且照射+Vam3組與照射+Res組比較，早期凋亡細(xì)胞比例顯著下降(p<0.05)，見圖5。

3 討論

胸腺是輻射敏感組織，受到全身及體外照射可很快引起其凋亡[2]，輻射致胸腺細(xì)胞損傷可進(jìn)一步引起造血免疫系統(tǒng)功能障礙[5]。當(dāng)電離輻射穿透生物組織時，能通過直接和間接作用產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高、DNA單雙鏈斷裂等生物學(xué)變化導(dǎo)致細(xì)胞受損[6-7]。實驗以白藜蘆醇為陽性對照藥物，探索其二聚體同系物Vam3對胸腺細(xì)胞輻射損傷保護(hù)作用。研究指標(biāo)選取細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、γ-H2AX水平以及細(xì)胞早期凋亡比例。前期的Vam3毒性實驗結(jié)果顯示，在同等濃度條件下Vam3對胸腺細(xì)胞的毒性作用較Res小，其毒性范圍表現(xiàn)為1×10?7～1×10?5mol/L時對胸腺細(xì)胞活力影響不大，之后隨藥物濃度的增加，其毒性逐漸增強(qiáng)，在濃度為1×10?2mol/L時具有明顯的毒性作用。而細(xì)胞活力檢測是反應(yīng)活細(xì)胞存活的重要指標(biāo)，發(fā)光試劑中的熒光素酶只能與活細(xì)胞內(nèi)ATP發(fā)生反應(yīng)而被檢測到，因此，檢測到的生物發(fā)光值反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)目，其值越大表明細(xì)胞活力越強(qiáng)。實驗結(jié)果顯示小鼠胸腺細(xì)胞受4 Gy γ-射線輻射后，細(xì)胞活力明顯下降，ROS水平升高。細(xì)胞內(nèi)異常增高的ROS水平可使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，故而有效的抗氧化劑能夠減輕電離輻射引起的細(xì)胞損傷[3,8]。

H2AX是組蛋白H2A的一種亞型，活化后的γ-H2AX在輻射致DNA雙鏈斷裂修復(fù)中起重要的作用[9]。Thiriet等[10]研究發(fā)現(xiàn)在染色質(zhì)DNA雙鏈斷裂周圍出現(xiàn)的H2AX磷酸化核灶(Nuclear foci)幾乎與DNA雙鏈斷裂呈現(xiàn)1:1數(shù)量關(guān)系，提示輻射后細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX水平可以清楚地反映DNA損傷程度和修復(fù)情況。實驗發(fā)現(xiàn)輻射后胸腺細(xì)胞γ-H2AX水平顯著升高，同時輻射后胸腺淋巴細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目亦增加，提示照射可引起胸腺細(xì)胞DNA損傷，可能誘導(dǎo)大量胸腺細(xì)胞凋亡。

將小鼠胸腺細(xì)胞照射前30 min給予Vam3和Res藥物處理，結(jié)果胸腺淋巴細(xì)胞活力下降明顯減輕，胞內(nèi)ROS和γ-H2AX水平以及凋亡的胸腺淋巴細(xì)胞比例明顯降低，且照射+Vam3組與照射+Res組比較，Vam3在提升細(xì)胞活力、降低細(xì)胞內(nèi)ROS 和γ-H2AX水平以及抑制細(xì)胞凋亡方面的作用比Res更加明顯，表明Vam3對輻射引起胸腺淋巴細(xì)胞的急性損傷有保護(hù)作用，且Vam3的輻射保護(hù)作用優(yōu)于其單體白藜蘆醇。從結(jié)構(gòu)式上分析Vam3作用優(yōu)于白藜蘆醇的原因可能為：白藜蘆醇發(fā)揮其抗氧化能力的主要結(jié)構(gòu)為其3個具有很強(qiáng)供電子能力的酚羥基，Vam3作為白藜蘆醇的二聚體同系物，具有更多的酚羥基，因此，具有更強(qiáng)的抗氧化能力。同時經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造的Vam3具有比白藜蘆醇更低的毒性作用。Res的輻射防護(hù)作用已經(jīng)得到多方面的研究證實，鑒于Vam3本身毒性很低，在一定程度上提示其可能作為一種新型輻射防護(hù)劑，本項研究對Vam3細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行了初探，后續(xù)尚需要更系統(tǒng)深入的研究證實。

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Radiation protection effects of Vam3 on mouse thymocyte in vitro

LIU Bing1ZHANG Junling2LI Deguan2PAN Jin1WANG Yueying2YAO Chunsuo3HOU Qi3MENG Aimin11(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)2(Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China)3(Institute of Material Medical, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing100050, China)

ABSTRACTThe aim is to observe the protective effect of Vam3 on irradiation-induced injury of thymocytes isolated sterilely from mice. The thymocytes were divided into 6 groups: control group, resveratrol group, Vam3book=71,ebook=40group, irradiation group, irradiation with resveratrol group and irradiation with Vam3 group. Except the control group, resveratrol group and Vam3 group, the rest groups were exposed to radiation at a single dose of 4 Gy γ-rays from137Cs after 30 min treatment by vehicle and tested drug, respectively. The thymocytes’ viability was measured by bioluminescence; the level of thymocytes’ reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA; the level of thymocytes’ γ-H2AX was measured by fluorescent antibody labeling; the early apoptosis was detected by FITC-Annexin V and PI labelling using flow cytometry (FCM) after radiation. Compared with control group, the thymocytes’ cell viability decreased obviously after irradiation, and the level of cell ROS, γ-H2AX and early apoptosis cell increased. By comparing the resveratrol group and Vam3 group with the irradiation group, we can find that Res and Vam3 could reduce the decrease of thymocytes’ cell viability and inhibit the increase of ROS, γ-H2AX and early apoptosis cell induced by irradiation. The comparison between irradiation with resveratrol group and irradiation with Vam3 group showed that the effects of Vam3 in increasing cell viability, decreasing the level of ROS and γ-H2AX and lowering the early apoptosis rate were more obvious than resveratrol. It can be concluded that Vam3 performs better than resveratrol in the protection of mice thymocytes against the acute radiation injury.

KEYWORDSVam3, Resveratrol, Thymocyte, Radiation injuries, Radioprotector

Corresponding author:YAO Chunsuo, professor, E-mail: yaocs@imm.ac.cn; HOU Qi, professor, E-mail: houq@imm.ac.cn; MENG Aimin, doctoral tutor, professor, E-mail: aiminmeng@cnilas.org

收稿日期：初稿2015-10-20；修回2015-11-06

通訊作者：姚春所，研究員，E-mail: yaocs@imm.ac.cn；侯琦，研究員，E-mail: houq@imm.ac.cn；孟愛民，博士生導(dǎo)師，教授，E-mail: aiminmeng@cnilas.org

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020207

中圖分類號TL71，R551