高效液相色譜法檢測南極磷蝦油中總蝦青素含量

王　松,郝鵬飛,趙鑫鵬,苗鈞魁,劉小芳,趙憲勇,冷凱良*

(1．中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東　青島　266071;2．山東出入境檢驗檢疫局，山東　青島　266002)

實驗技術(shù)

高效液相色譜法檢測南極磷蝦油中總蝦青素含量

王松1,郝鵬飛2,趙鑫鵬1,苗鈞魁1,劉小芳1,趙憲勇1,冷凱良1*

(1．中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071;2．山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002)

摘要：建立了一種檢測南極磷蝦油中總蝦青素含量的高效液相色譜方法。樣品采用NaOH-甲醇溶液皂化后加入NaHSO4終止反應，反應液經(jīng)正己烷液液萃取凈化，采用C18液相色譜柱分離，二極管陣列檢測器在476 nm波長進行測定，蝦青素在5 min 內(nèi)得到較好分析。考察了皂化時間對蝦青素酯皂化效率的影響,研究結(jié)果顯示，皂化30 min為最佳反應時間。蝦青素含量在0.2～20.0 mg/L范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.005 mg/kg，定量下限為0.2 mg/kg。日內(nèi)精密度(RSD)≤3.4%,日間RSD≤4.3%，南極磷蝦油樣品的加標回收率為90.2%～95.2%。該方法的線性范圍寬、準確性好、精密度高，樣品前處理方法簡便，適用于南極磷蝦油中總蝦青素含量的分析檢測。

關(guān)鍵詞：蝦青素；南極磷蝦油；蝦青素酯；皂化；高效液相色譜法

南極磷蝦油富含EPA、DHA、磷脂、類胡蘿卜素等功能脂質(zhì)復合物，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、健腦益智等多種生理功能，作為一種新型脂質(zhì)保健品正受到越來越多的關(guān)注[1-3]。蝦青素(Astaxanthin)是南極磷蝦油中最重要的類胡蘿卜素色素[4],也是自然界中抗氧化及消除自由基能力最強的天然色素，具有抗氧化、預防腫瘤等多種生理功能[5-6]。蝦青素由多聚烯鏈和兩端的芳香環(huán)組成，每個芳香環(huán)上各有1個羥基和羰基，其化學名稱為 3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4，相對分子質(zhì)量為596.86。蝦青素兩端芳環(huán)上3,3′位的兩個羥基易與脂肪酸形成蝦青素酯，研究表明南極磷蝦中的蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在(見圖1)，游離蝦青素所占的比例較少[7]。

目前關(guān)于蝦青素的檢測方法主要有薄層色譜法、分光光度法和高效液相色譜法等[8-10]。分光光度法曾經(jīng)是最為常用的蝦青素檢測方法，但由于蝦青素與其他類胡蘿卜素的最大吸收波長均在480 nm左右，因此測定結(jié)果為總類胡蘿卜素含量，無法將蝦青素與其他類胡蘿卜素分開。同時分光光度法在樣品成分比較復雜時易受基質(zhì)干擾，難以準確測定樣品中蝦青素的真實含量。高效液相色譜法由于靈敏度高、線性范圍寬、準確性好等優(yōu)點，已在雨生紅球藻、紅法夫酵母以及水產(chǎn)品的蝦青素檢測中得到廣泛應用[11-13]。由于蝦青素酯種類較多，無相應的標準品，難以同時對全部蝦青素酯組分進行定量檢測。目前，蝦青素檢測主要采用皂化方法將不同的蝦青素酯完全皂化生成游離蝦青素，再采用高效液相色譜法進行總蝦青素含量的檢測[14-15]。由于南極磷蝦油中高含量的油脂會嚴重影響檢測結(jié)果，需通過有效的脫脂前處理才能實現(xiàn)蝦青素的檢測。目前國內(nèi)關(guān)于南極磷蝦油中蝦青素測定方法的研究已有報道[16-17]，現(xiàn)有的檢測方法主要通過凝膠過濾(GPC)或固相萃取(SPE)方法進行脂類凈化后采用液相色譜檢測，操作步驟較為繁瑣，檢測成本較高。本研究中南極磷蝦油樣品經(jīng)NaOH-甲醇溶液皂化-甲酯化反應處理后，蝦青素全部轉(zhuǎn)化成游離蝦青素，脂肪酸全部轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯；采用正己烷進行液液萃取，有效去除了脂肪酸甲酯，降低了基質(zhì)干擾，進一步采用高效液相色譜法測定樣品中的總蝦青素含量，可實現(xiàn)南極磷蝦油中總蝦青素的高效、快速、準確檢測。

1實驗部分

1.1材料與儀器

南極磷蝦油樣品1、樣品2由黃海水產(chǎn)研究所提供,Superba南極磷蝦油由挪威Aker公司提供，南極磷蝦油NKO及紐諾迪科由市場購買；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷(色譜純，德國Merck公司)；無水硫酸氫鈉、氫氧化鈉等均為分析純；蝦青素標準品(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度95.8% ± 0.5%)；KQ-300E超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);BS210S 型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；JB-1A 磁力攪拌器(上海精密科學儀器有限公司)；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士步琦有限公司)；Agilent 1260液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2實驗方法

1.2.1游離蝦青素的提取參考SN/T 2327-2009，準確稱取1.0 g南極磷蝦油樣品于50 mL離心管中，加入15 mL甲醇-二氯甲烷(3∶1)，再加入10顆玻璃珠，渦旋振蕩2 min，30 ℃恒溫振蕩提取30 min，低溫離心(4 ℃，5 000 r/min) 5 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，樣品再用5 mL甲醇-二氯甲烷(3∶1)重復提取1次，合并提取液于25 mL容量瓶中，加甲醇-二氯甲烷(3∶1)定容至刻度，渦旋混合后過0.45 μm微孔濾膜，供HPLC檢測。

1.2.2總蝦青素的提取準確稱取0.5 g南極磷蝦油樣品于50 mL離心管中，加入5 mL正己烷，渦旋振蕩使之完全溶解，再加入10 mL氫氧化鈉-甲醇(4 mol/L)溶液，渦旋振蕩2 min，避光條件下30 ℃恒溫振蕩反應30 min，加5 g硫酸氫鈉終止反應，低溫離心(4 ℃，5 000 r/min) 5 min，下層(甲醇-水相)過0.45 μm微孔濾膜，供檢測。

1.2.3標準溶液的配制準確稱取蝦青素標準品15 mg，用甲醇-二氯甲烷(3∶1)溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的標準儲備液，充氮密封，置于-18 ℃冰箱中避光保存，有效期1個月。使用前將儲備液用甲醇-二氯甲烷(3∶1)稀釋，配成適量濃度的標準工作液，所有標準工作液均充氮密封，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4色譜條件色譜柱：VanusilASB C18色譜柱(Agala)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測器：DAD紫外檢測器；檢測波長為476 nm，參比波長600 nm；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：純甲醇，等度洗脫20 min。

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件優(yōu)化

2.1.1檢測波長的選擇采用二極管陣列檢測器(DAD)對蝦青素標準溶液進行全波長掃描，獲取光譜圖。光譜結(jié)果顯示，在甲醇溶液中蝦青素的最大吸收波長為476 nm。因此選擇476 nm作為蝦青素的檢測波長。

2.1.2流動相的選擇分別以純甲醇、甲醇-水、乙腈-水、純乙腈作為流動相，進樣等體積的蝦青素標準溶液進行條件優(yōu)化，其余色譜條件同“1.2.4”所述。結(jié)果表明，純甲醇及甲醇-水混合體系作流動相均可以很好地洗脫蝦青素，其中采用純甲醇為流動相時，蝦青素在4.8 min 左右出峰，色譜峰對稱性良好，而隨著甲醇比例的降低，峰形不變，但出峰時間逐漸延后。采用純乙腈及不同比例的乙腈-水為流動相時，檢測結(jié)果與甲醇-水體系相近。因此，本實驗采用純甲醇作為流動相。

圖2　南極磷蝦油樣品的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC Chromatogram of Antaritic krill oilthe number 1 peak indicates the free astaxanthin,and the peaks from number 2 to 8 indicate the astaxanthin esters

2.2前處理條件的優(yōu)化

2.2.1皂化反應時間的優(yōu)化南極磷蝦油中的蝦青素均以游離和蝦青素酯的形式存在，根據(jù)“1.2.4”色譜條件檢測南極磷蝦油樣品，結(jié)果在18 min內(nèi)出現(xiàn)全部色譜峰(圖2)。根據(jù)色譜峰的吸收光譜可確定色譜峰1～8均為蝦青素，其余色譜峰為非蝦青素組分。再通過與蝦青素標準品的色譜比對，確定色譜峰1為游離蝦青素峰，色譜峰(2～7)均為蝦青素酯峰，其余色譜峰從吸收光譜判斷為南極磷蝦油基質(zhì)中的非蝦青素各類脂質(zhì)物質(zhì)。由于各類蝦青素酯無相應的標準品，因此無法直接進行定量，需要先通過皂化反應使蝦青素酯全部轉(zhuǎn)化成游離蝦青素。本實驗采用氫氧化鈉-甲醇(4 mol/L)進行皂化反應，隨后加入硫酸氫鈉溶液終止反應，最終將南極磷蝦油中的蝦青素酯全部轉(zhuǎn)化為游離蝦青素，進行總蝦青素含量測定。

反應時間對蝦青素酯的皂化率有很大影響。反應時間太短，蝦青素酯皂化不完全，而反應時間太長會造成蝦青素分解，影響檢測結(jié)果。考察了皂化反應時長為10～150 min時HPLC的檢測結(jié)果，結(jié)果顯示，皂化反應時間不足30 min時，皂化反應不完全，仍有未皂化的蝦青素酯峰出現(xiàn)。反應時長在30～90 min之間可以確保蝦青素酯完全皂化，南極磷蝦油樣品經(jīng)皂化后，HPLC色譜檢測結(jié)果顯示，保留時間4.8 min左右為單一的游離蝦青素峰，其他蝦青素酯峰消失。皂化超過120 min則會造成蝦青素分解，其色譜峰出現(xiàn)分叉、變寬，以及明顯的拖尾現(xiàn)象?？紤]到實驗效率，選擇30 min為南極磷蝦油中蝦青素酯皂化反應時間。

2.2.2凈化條件的選擇南極磷蝦油的主要成分為甘油酯和磷脂等脂類物質(zhì)，大量的脂類物質(zhì)會干擾檢測結(jié)果，污染檢測儀器，因此檢測樣品的油脂脫除是重要的前處理步驟。目前報道的南極磷蝦油的脂類脫除主要是在皂化反應前通過固相萃取或者通過GPC去除其他脂類物質(zhì)，步驟繁瑣，檢測成本高。本實驗在南極磷蝦油樣品經(jīng)皂化-甲酯化反應后，使磷蝦油中的脂肪酸成分生成脂肪酸甲酯，蝦青素全部轉(zhuǎn)化為游離蝦青素，由于游離蝦青素的極性較高，而脂肪酸甲酯的極性很低，因此可以采用正己烷溶劑，通過液液萃取法從反應液中去除脂肪酸甲酯，實現(xiàn)蝦青素檢測樣品的凈化。南極磷蝦油樣品采用正己烷溶解，加入甲醇-水為反應液體系，振蕩條件下進行皂化-甲酯化反應。反應終止后，反應液經(jīng)離心，脂肪酸甲酯進入上層的正己烷相，蝦青素及不皂化物存在于下層的甲醇-水相。取下層的反應液作為待測液，其中含有的不皂化物在476 nm處對蝦青素檢測不會造成干擾。南極磷蝦油皂化脫脂后在4.8 min處顯示游離蝦青素單峰，基線平滑，峰形良好。HPLC色譜峰的吸收光譜檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過脫脂處理后，南極磷蝦油中蝦青素的皂化產(chǎn)物為純度很高的游離蝦青素峰。說明正己烷液液萃取法可以有效去除脂類物質(zhì)干擾。

2.3線性范圍、檢出限與定量下限

分別配制濃度為0.2，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L的系列蝦青素標準溶液，采用優(yōu)化的前處理條件并進行HPLC分析。以蝦青素標準溶液的色譜峰面積(Y)為縱坐標，以相應的濃度(X，mg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果顯示，在0.2～20.0 mg/L范圍內(nèi)，蝦青素的線性方程為Y=236.449X+7.176，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限(S/N=3)為0.005 mg/kg，定量下限(S/N=100)為0.2 mg/kg。在常規(guī)工作中，根據(jù)南極磷蝦油樣品中蝦青素的質(zhì)量濃度，校準曲線的質(zhì)量濃度范圍通常選擇為0.2～20.0 mg/L。

2.4精密度與回收率實驗

將0.5～10.0 mg/L濃度的蝦青素標準溶液，在優(yōu)化條件下，于同一日內(nèi)重復測定5次進行日內(nèi)實驗；于5日內(nèi)每日測定1次進行日間實驗，結(jié)果見表1。日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為1.0%～3.4%,日間RSD為1.3%～4.3%。

表1　方法的精密度實驗結(jié)果

表2　南極磷蝦油樣品中蝦青素在3種加標水平下的回收率

表3　不同南極磷蝦油中蝦青素的含量(n=3)

*：no detected

根據(jù)檢測結(jié)果，以已知蝦青素含量的南極磷蝦油樣品配制蝦青素濃度為5.32 mg/kg的樣品，在樣品中分別按照10.0，20.0，50.0 mg/kg 3個不同添加水平進行蝦青素加標回收率實驗，平行制備6份樣品，按本方法檢測蝦青素含量，結(jié)果如表2所示。蝦青素在不同濃度下的加標回收率為90.2%～95.2%。

2.5實際樣品的測定

采用優(yōu)化的前處理條件和色譜條件，進行不同南極磷蝦油樣品中游離蝦青素和總蝦青素含量的測定，結(jié)果如表3所示。市售3種南極磷蝦油樣品中均未檢出游離蝦青素，總蝦青素含量為65～114 mg/kg。樣品1和樣品2為本實驗室從不同的南極磷蝦原料中提取的粗蝦油，檢出兩種樣品均含有游離蝦青素，同時總蝦青素含量也較3種市售產(chǎn)品高。上述檢測結(jié)果差異推測可能有以下原因：①不同來源的南極磷蝦原料中蝦青素含量存在一定差異；②市售南極磷蝦油經(jīng)過精制后，其所含蝦青素可能在精制過程中有所損失。

3結(jié)論

本文建立了一種南極磷蝦油中總蝦青素含量的檢測方法。南極磷蝦油樣品經(jīng)過皂化-甲酯化反應后，采用正己烷液液萃取凈化去除脂肪酸甲酯，取得了良好的效果。實驗結(jié)果顯示該方法中蝦青素的線性范圍為0.2～20.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999 9，檢出限為0.005 mg/kg，定量下限為0.2 mg/kg，加標回收率為90.2%～95.2%，RSD小于5%。該方法準確性好、精密度高，樣品前處理方法簡便、快速，適用于南極磷蝦油中總蝦青素含量的分析檢測。

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Determination of Total Astaxanthin in Antarctic Krill Oil by High Performance Liquid Chromatography

WANG Song1,HAO Peng-fei2,ZHAO Xin-peng1,MIAO Jun-kui1,LIU Xiao-fang1,ZHAO Xian-yong1,LENG Kai-liang1*

(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao266071,China;2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao266002,China)

Abstract：A C18reversed-phase high performance liquid chromatographic(RP-HPLC) method was developed for the determination of total astaxanthin saponified from Antarctic krill oil.The sample was saponified with sodium hydroxide-methanol solution(4 mol/L)，the reaction was ended with sodium hydrogen sulfate,and the reaction liquid was purified by n-hexane liquid-liquid extraction．The effect of saponification time on saponification efficiency of astaxanthin in Antarctic krill oil was investigated.The results showed that the best saponification time was 30 min．Chromatographic separation was performed with a C18liquid chromatographic column(250 mm×4.6 mm，5 μm) at room temperature with an eluent of 100% methanol at a flow rate of 1.0 mL/min.The eluate was monitored with a diode array detector at 476 nm.The separation and identification of astaxanthin was completed within 5 min.The limits of detection(LOD) and quantitation(LOQ) for astaxanthin in Antarctic krill oil were 0.005 mg/kg and 0.2 mg/kg,respectively.A good linear relationship between chromatographic peak area and concentration in the range of 0.2-20.0 mg/L was obtained with a correlation coefficient of 0.999 9．The average recoveries were between 90.2% and 95.2%，and the inter- and intra-RSDs of the method were not more than 3.4% and 4.3%,respectively.The method was rapid,simple,precise and accurate,and could be applied in the inspection of astaxanthin in Antarctic krill oil．

Key words：astaxanthin;Antarctic krill oil;astaxanthin ester;saponification;high performance liquid chromatography(HPLC)

收稿日期：2015-09-16；修回日期：2015-10-28

基金項目：青島市博士后創(chuàng)新項目(ZQ51201415030);農(nóng)業(yè)部項目“南極海洋生物資源開發(fā)利用”(1230135)

*通訊作者：冷凱良，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用,Tel:0532-85803921,E-mail:lengkl@ysfri.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.019

中圖分類號：O657.72;O629.4

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0482-05